Summary
Häri presenterar vi ett förfarande för att mata pesticid förorenad mat till både en individuell honungsbiet och en bikupa koloni. Proceduren utvärderar bekämpningsmedlet effekt på enskilda honungsbin genom in vivo matning av grundläggande larv diet och även på det naturliga tillståndet av bikupa koloni.
Introduction
Förekomsten av bekämpningsmedel i miljön är en av de allvarligaste problemen som påverkar livet för en honungsbiet 1, 2, 3. Flera studier har visat den gemensamma närvaron av bekämpningsmedelsrester i honung bisamhällen och biprodukter. I Taiwan, den genomsnittliga spridning av bekämpningsmedel var 11-12 kg / ha varje år (2005-2013). Mängden bekämpningsmedel som används i Taiwan är högre än EU-länderna och de latinamerikanska länderna 4, 5. Med andra ord är biodling miljön allvarlig påfrestning bekämpningsmedel, särskilt i Taiwan och eventuellt i andra länder.
Honungsbiet Apis mellifera är en av de stora pollinatörer i jordbrukssystem 6 och producerar också värdefulla produkter såsom honung. Men honungsbin är mässored olika bekämpningsmedel och dessa bekämpningsmedel kan föras tillbaka till bikupor efter föda på blommor som har besprutas med bekämpningsmedel vid insamling nektar och pollen 7, 8. De kan också utsättas för bekämpningsmedel av biodlarna själva som syftar till att kontrollera skadedjursproblem inne i kuporna 9, 10, 11. Eftersom honungsbi larver matas av sjuksköterska bin för deras utvecklings, larver, drönare och även drottningen kan exponeras för dessa bekämpningsmedelsförorenade nektar och pollen 12. Giftigheten hos olika bekämpningsmedel honungsbin måste åtgärdas 13.
Många ansträngningar har gjorts för att utvärdera frågor om miljöbekämpningsmedelsrester. Yang et al. testade påverkan av neurotoxiska insekts imidakloprid på utvecklingen av honungsbiet larver ibikupa och rapporterade att en sub-letal dos av imidakloprid resulterade i olfactory associativa beteende av de vuxna bin 14. Också, Urlacher et al. sökte subletala effekterna av en organophosphatebekämpningsmedel, klorpyrifos, på en honungsbiet arbetare lärande prestanda under laboratorieförhållanden 15. I vår tidigare studie utvärderade vi effekterna av en insekt tillväxtregulator (IGR), pyriproxifen (PPN) på larv honungsbin 16.
I detta dokument presenterar vi metoder för utvärdering av kemiska effekter på utvecklingen av honungsbin. Honung bee matningsmetoder beskrevs och applicerades på antingen enskilda honungsbin eller till en koloni. Först testade vi olika koncentrationer av pesticid-kontaminerade grundlarv diet (FLM) på larver i kolonierna för att utvärdera effekterna av pesticiden på individuella honungsbin in vivo. Vi fortsatte sedan för att simulera den naturliga conditjoner av pesticiden genom att använda bekämpningsmedel förorenade sirap inom bikupor. I denna metod, kommer PPN, som ofta används mot skadeinsekter 17 och är skadligt för utvecklingen av honungsbiet larver och puppor 16, 18, 19, vara en indikator för att representera den negativa effekten av pesticiden i fält.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparat
- Göra ett L av 50% sockersirap. Lös upp 1 kg sackaros i 1 L ddHaO 2 O.
- Förbereda pyriproxifen (PPN) lösning i BLD. Göra 1,1 L av 10 tusen ppm PPN stamlösning och späd 100 ml PPN-lösning i 1 L steriliseras DDH 2 O. Lagra vid 4 ° C.
- Utspäda PPN stamlösning till slutliga koncentrationer av 0,1, 1, 10 och 100 mg / kg (ppm) i BLD för följande experiment.
- Gör PPN-sirap (för kolonin nivå). Utspäda PPN lager till slutkoncentrationer av 10 och 100 ppm i 50% sockersirap för följande experiment.
- Honey bee uppfödning.
Obs: Här är den experimentella platsen National Ilan University (NIU) bigården, Yi-Lan City, Taiwan; (GPS-koordinater: N24.747278, E121.746200).- Kontrollera honungsbi (Apis mellifera L.) kolonier varje vecka för livsmedel kvantitet och foder med en liter 50% sockersirap om nödvändigt (honung lagringsområdet är tomt). Definiera en hälsosamkoloni som 9 ramar av honungsbiet kammar i varje koloni med en drottning lägga ägg normalt.
- Bereda 100 ml av basisk larv diet (FLM). Upplösa 6% D-glukos, 6% fruktos, och en% jästextrakt i steriliserat destillerat avjoniserat vatten (DDH 2 O) och komplettera med 50% drottninggelé. Lagra vid 4 ° C men inte under mer än 3 dagar.
Notera: För-värm till 35 ° C innan experimentet och använd inom 3 dagar.
2. In Vivo Feeding Method
Notera: In vivo utfodringsmetod har modifierats Hanley et al. 20
- Honungsbiet larver val och märkning.
- Infoga en drottning för utestängande att dela 9 ramar av en frisk koloni i 4 ramar och 5 ramar och samtidigt begränsa drottningen till 4 ramsektionen. Lämna åtminstone en tom ram i fyra ramsektionen för att lägga ägg.
- Efter drottningen lägger ägg för en dag, Ta ramarna för utseendet av ägg och hålla äggen inuti bikupor under 72 h (den 4: e dag) tills en dagar gamla larver kläcks. Ta en av de ramar som innehåller en dagar gamla arbetaren larver (streckat inom 24 h) ut från test kupan för hand och ta bort de honungsbiet arbetare från ramen med ett bi borste.
- Täcka ramen med en transparent slid (Storlek = Längd x Bredd x tjock = 29,7 mm x 21 mm x 0,1 mm) och spika den transparenta sliden på kanten av ramar med häftstift (Figur 1A).
- För varje behandling, slumpmässigt välja 50 en dag gamla larver (den 4: e dag) och markera varje kull cell genom användning av permanenta märkpennor på den transparenta sliden (figurerna 1A och 1B).
Obs! Skriv informationen för varje behandling på ramen och transparent slide samt med hjälp av permanenta märkpennor för att undvika förväxling mellan olika behandlingar. Ta bort de markerade bilderna och hålla för in vivo </ Em> utfodring och observation.
- In vivo utfodring.
- Lägga till olika koncentrationer av PPN-BLD (0,1, 1, 10 och 100 ppm) till varje märkt kull cell genom pipettering på dag 1, 2 och 3 med 10 mikroliter, 10 mikroliter och 20 mikroliter, respektive, enligt intags kvantiteten av larver ålder. Tillsätt samma mängd BLD (ingen PPN) till en kontrollgrupp. Därigenom, den totala dosen av PPN-BLD i varje märkt yngel cellen ackumulerar till 4, 40, 400, och 4000 pg.
OBS: Inse de märkta avels celler genom de markerade transparenta objektglas och ta bort de markerade transparenta objektglasen efter utfodring. Använda färsk BLD för matning för att förhindra rengöring av kullen cellerna av arbetstagare bin. - Returnera PPN-behandlade ramar till de ursprungliga kolonierna för ytterligare synpunkter.
OBS: Varje behandling har fyra biologiska upprepningar i fyra kolonier.
- Lägga till olika koncentrationer av PPN-BLD (0,1, 1, 10 och 100 ppm) till varje märkt kull cell genom pipettering på dag 1, 2 och 3 med 10 mikroliter, 10 mikroliter och 20 mikroliter, respektive, enligt intags kvantiteten av larver ålder. Tillsätt samma mängd BLD (ingen PPN) till en kontrollgrupp. Därigenom, den totala dosen av PPN-BLD i varje märkt yngel cellen ackumulerar till 4, 40, 400, och 4000 pg.
- Observation av behandlat larver på dag 7.
- För att observera the PPN-behandlade larver tillbaka de märkta transparenta bilderna till ramarna för att spela dödligheten och stoppning priser i de märkta avelscellerna.
- Observation av behandlade puppor och eclosion priser på dag 13.
- Ta bort bivax av det utjämnade avelsceller.
- Sätt mjuka tippas pincett i kullen cell och klämma puppor mycket svagt sedan ta puppor ut försiktigt.
- Överföra puppor i 24-brunnars vävnadsodlingsplattor med en dubbel-skikt av laboratorie vävnader under varje brunn. Spela skadan och dödligheten under PUPP överföring.
- Hålla de 24-brunnars vävnadsodlingsplattor i en inkubator vid 34 ° C och 70% relativ fuktighet tills uppkomsten (ca 8 dagar).
- Observera och registrera puppor och dykt honungsbin.
- Statistik
- Beräkna de registrerade data och närvarande som ett medelvärde ± SD
- Analysera data med hjälp av variansanalys (ANOVA) av SAS och använder den minst signifikanta skillnaden (LSD) test för att analysera skillnaderna mellan två medel för olika behandlingar. Definiera statistiskt signifikant som P-värde <0,05. Olika bokstäver i samma kolumn i tabellen visade en signifikant effekt av den statistiska analysen.
3. Toxicitet av PPN på Colony Nivå i Beehive
- Ställ in honungsbiet grupperna.
- Infoga en drottning för utestängande vertikalt för att dela upp 9 ramar av en frisk koloni i 4 ramar (del A) och 5 ramar (del B) medan begränsande drottningen till 4 ramsektionen. Lämna åtminstone en tom ram i 4-ramsektionen för att lägga ägg.
Obs: Annorlunda drottning utestängande den ovanpå drottningen delen för att förhindra drottningen från att röra sig mellan delarna. - Efter drottningen lägger ägg för en dag, kontrollera ramarna för uppkomsten av ägg. Vidta lämpliga ramar som innehåller ägg ut från del A för hand och ta honungsbiet arbetarefrån ramen med ett bi borste.
- Täcka ramen med transparent slid och spika den transparenta sliden till kanten av ramen med häftstift.
- Slumpmässigt välja 100 avels celler innehållande ägg och markera varje kull cell genom användning av permanent markör på den transparenta bilden. Tilldela dessa 100 avels celler som Grupp 1. Skriv informationen för varje behandling på ramen och öppet glid användning permanent markör för att undvika förväxling mellan olika behandlingar.
- Returnera den märkta ramen till del A i 3 dagar och sedan överföra drottningen till del B för att lägga ägg.
- Efter en dag, ta ramarna i del B, välj en lämplig ram och märka 100 avels celler innehållande ägg såsom beskrivs i steg 3.1.4. Tilldela dessa 100 avels celler som Grupp 2.
- Returnera den märkta ramen till del B i 3 dagar och sedan överföra drottningen till del A för att lägga ägg.
- Upprepa drottningen växling mellan del A och del B ytterligare 6 gånger och tilldela grupper numeriskt,respektive (figur 2). Det bör finnas totalt 9 grupper.
- Infoga en drottning för utestängande vertikalt för att dela upp 9 ramar av en frisk koloni i 4 ramar (del A) och 5 ramar (del B) medan begränsande drottningen till 4 ramsektionen. Lämna åtminstone en tom ram i 4-ramsektionen för att lägga ägg.
- T reat honungsbiet koloni med PPN sockerlag på dag 13 (Figur 2).
- Lägg 1 L 50% PPN sockersirap innehållande 10 eller 100 ppm i en plast bee matarlåda (B x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) och sätta boxen ovanpå ramarna i de experimentella kolonier.
Obs: Grupp 1 inte får PPN på 13 dagar som kullen cellerna har förseglats. - Mata kontrollgruppen med en L 50% sockersirap (ingen PPN) såsom beskrivits i steg 2,2.
- Lägg 1 L 50% PPN sockersirap innehållande 10 eller 100 ppm i en plast bee matarlåda (B x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) och sätta boxen ovanpå ramarna i de experimentella kolonier.
- Räkna en dagar gamla larver och rekord som ägget kläckningsgrad av 100 märkta yngelceller för varje grupp vid dag 5 (figur 2). Honungsbiet ägg brukar ta 3 dagar att kläckas i 0 dag larver; Därför, ta och märka 100 ägg-innehållande avkommor celler vid dag 1 och räkna antalet en dagar gamla larver för varje grupp på dag 5 för att erhålla den procentuella kläckningsgraden.
- Count de förslutna avelsceller och post som larver capping hastighet av 100 märkta yngelceller för varje grupp vid dag 11 (figur 2). 6 till 7 dagar gamla larver avels celler kommer att begränsas med bivax av honung bee arbetare för larver pupating.
- Observera puppor mognad och registrera eclosion hastighet av 100 märkta yngelceller för varje grupp vid dag 17 (figur 2).
- Ta bort bivax av det utjämnade avkommor celler och ta puppor ut med mjuka tippade pincett försiktigt. Överföra puppor in i en 24-brunnars vävnadsodlingsplattor med en dubbel-skikt av laboratorie vävnader under varje brunn.
- Hålla de 24-brunnars vävnadsodlingsplattor i en inkubator vid 34 ° C och 70% RH tills uppkomst.
- Observera och registrera puppor och dök honungsbin för varje grupp tills grupp 9 (49 experimentella dagar).
Notera: Varje behandling har fyra biologiska upprepas.
- Statistik
- Beräkna de registrerade uppgifterna och närvarande som medelvärde± SD.
- Analysera de betydande skillnader mellan par av behandlingar (t ex 0 ppm / 10 ppm, 10 ppm / 100 ppm och 0 ppm / 100 ppm) i varje grupp med hjälp av Students två-svansade t-test. Definiera så statistiskt signifikant om P-värdet <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För honungsbiet fälttest, var en drottning begränsad till 4-ramsektion för att lägga ägg. Detta steg skulle kunna öka yngeltätheten i en ram och underlätta efterföljande observationer. Varje behandling var märkt och honungsbin utveckling klart observeras genom en transparent bild. In vivo utfodring av PPN-BLD till honungsbiet larver i bikupan utfördes exakt utvärdera inverkan av PPN på utvecklingen av honungsbin i kolonin. Med användning av in vivo utfodringsmetod i underlättas observationen av effekterna av de kemiska behandlingar på bikupan.
För varje dos av PPN-BLD, ades totalt femtio avkommor celler märkta och behandlas. Efter att ha lagt PPN-BLD var de behandlade ramar tillbaka till de ursprungliga kolonierna för observation under naturliga förhållanden. De negativa effekterna av PPN-BLD på larvstadiet honungsbin var lätt observed. En dosberoende effekt observerades. Tabell 1 presenterar antalet honungsbin som dog vid larvstadiet vid de två högre doser av 10 och 100 ppm. Såsom visas i tabell 1, vid de två doserna (0,1 och 1 ppm), de täckande priser, dagar till uppkomst och eclosion taxor var inte signifikant från 0 (FLM mat tillsatt) eller unfed kontroll, med endast en signifikant högre procentuell andel av bin med deformerade vingar vid en ppm. Melanin av puppor iakttogs vid låga koncentrationer av PPN. Dessutom andelen vuxna honungsbin uppträdde med deformerade vingar ökade med högre doser av PPN (tabell 1).
Att simulera honung bisamhällen lider av miljö PPN rest, matning av PPN sirap till hela honungsbiet koloni utfördes. Före behandling togs varje koloni uppdelade i 9 olika temporala grupperna vid 3 dagars intervall med två drottning glasisättning (Figur 2). Därför var effekten av PPN på andelen kläckning, tak och eclosion observeras samtidigt under förhållanden som liknar dem i naturen.
Kolonierna matades sirap med 10 eller 100 ppm PPN vid dag 13 (indikerad av den röda streckade i fig 2). Teoretiskt, grupp 1 var ett PPN fria kontrollen eftersom PPN-Sirapen matades vid dag 13 och de honungsbin i grupp 1 var i puppstadium och capped; de honungsbin i larvstadiet började att påverkas i grupperna 2 och 3, och äggen kommer att påverkas i grupper 4-9 beroende på den längre exponeringstiden i PPN-kontaminerade bikupor (Figur 2).
I denna studie, matade vi honung bisamhällen med PPN sirap och observerade utveckling när de vuxna honungsbin konsumerade sirapen och förmodligen matade drottningen och larver. Detta antagande bekräftades av hatcHing, capping och eclosion hastigheter och deformerade bevingade bin observerades efter de PPN behandlingar, såsom visas i figurerna 3A - 3D. Alla parametrar skiljde sig signifikant vid den högre dosen (100 ppm) utgående från grupp 3, utom kläckningsgrad (figur 3A - 3D). Dessutom efter PPN-sirap behandlingar dog många puppor med svarta nagelband eller genom att underlåta att växa fram. I 100 ppm PPN behandling ades de täckta cellerna förstörs, och den skadade puppor avlägsnades från kolonin (figur 3E).
Figur 1: Schema av avels celler märkning. (A) en dag-gammal arbetare larver täcks av transparenta glidpapper och märktes genom permanent markör. (B) Märkt 1 dagsgamla worker larvyngelceller; den vita pilen indikerar en 1 dagsgamla arbetare larv inuti. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tidslinje för när PPN startas relativt de 9 försöksgrupper. Olika koncentrationer av PPN matades på dag 13 (röd streckad linje). Den behandlade kolonin var uppdelad i del A och del B. De drottning utbyten från del A till del B och vice versa för lägga ägg är visade. Detta har återgivits med tillstånd från Elsevier 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6 / 55296fig3.jpg"/>
Figur 3: Utveckling av honungsbiet larver före och efter utfodring 1 kg PPN sirap i testade bisamhällen. Totalt nio grupper undersöktes i detta experiment: (A) kläckningsgrad; (B) utjämningssatsen; (C) eclosion hastighet; och (D) missbildade vinghastighet. Medelvärde ± SD presenteras; Röda pilar indikerar den tid under vilken PPN kan börja agera på bin. Svarta asterisker visar statistisk signifikans jämfört med kontrollen (0 ppm). Röd asterisk visar statistisk signifikans mellan 10 och 100 ppm; (E) 100 ppm PPN sirap behandlad bee koloni visade icke-begränsade celler, antagligen deformeras puppor och svart och deformerade puppor. Detta har återgivits med tillstånd från Elsevier 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| PPN-BLD (ppm) | Larver No. | larvutveckling | ||
| Capped Grad (%) | Eclosion Grad (%) | Missbildade vingar (%) | ||
| 100 | 140 | 0b | 0b | - |
| 10 | 139 | 22,2 ± 33.2b | 0b | - |
| 1 | 140 | 72,3 ± 17.9a | 67,7 ± 17.6a | 7,7 ± 5.7a |
| 0,1 | 136 | 78,3 ± 17.5a | 75,4 ± 22.8a | 1,4 ± 2.8b |
| 0 | 138 | 78,9 ± 5.4a | 78,9 ± 5.4a | 0b |
| Icke-matning | 122 | 87,8 ± 9.1a | 86,1 ± 7.2a | 0,8 ± 1.5b |
Tabell 1: Effekter av fortsatta 3 dagar utfodring av PPN på en dagsgamla larver. Till varje larv cell, var 10, 10 och 20 mikroliter av BLD sattes från dagarna 1 till 3, respektive. Varje analys innehöll 25-38 larver i en koloni och 4 kolonier testades. Medelvärde ± SD presenteras. Olika bokstäver i samma kolumn är signifikant olika med minsta kvadratskillnaden test (P <0,05) efter ANOVA visade en signifikant effekt. Detta har återgivits med tillstånd från Elsevier 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drottningen begränsade äggläggande metod och drottning utbytesmetod är kritiska steg för att ställa in honungsbiet grupper för fälttester inom detta protokoll. Drottningen begränsade äggläggande metod tillåter synkronisering av livscykeln för honungsbin. Följaktligen kan forskarna välja en dag gamla larver i samma ålder för behandling med olika doser av bekämpningsmedel. För drottningen-utbytesmetoden, var drottningen utbyts mellan del A (4 ramar) och B (5 ramar) för att erhålla olika utvecklingsstadier av honungsbiet för fälttest för att utvärdera effekterna av bekämpningsmedels och bekämpningsmedelsrester. Dessutom har ett stort antal utvalda yngelceller registreras i fälttest med användning av transparenta objektglas för märkning. Men ägg över läggning ibland resulterar i otillräckliga avels celler för drottningen lägger ägg. Därför krävs framställningen av tomma ramar för drottningen-utbytesmetoden. Alternativt kan drottningen begränsade äggläggande metoden också användas för attförbereda olika honungsbiet grupper för testning i bikupan. Separation av ramarna i 2 ramar i del A och 7 ramar i del B och placeringen av drottningen delvis A (2 ramar) kan begränsa de ägg som drottningen inom de 2-ramar.
För vivo-matningsmetod i, var PPN-BLD till varje kull cell. Honungsbin uppvisade högre acceptans av BLD än sirap 16, 20. Honey bee larver kan överleva och växa på en konstgjord diet bestående av drottninggelé, socker, jästextrakt, och destillerat vatten 22, 23. Glukos och fruktos sammansättningen av BLD påverkade inte överlevnaden av larverna in vitro 21 och därför skulle BLD vara mer stabil för honungsbiet tillväxt i bikupan. Noterbart är att använda färsk BLD för utfodring kan också förhindra att arbetstagare bin larver uteslutning underlarver utfodringsexperiment. Dessutom under matningsprocessen, skonsam matning initialt för att undvika döden av en dagsgamla larver.
Under fältförsök, kemiskt förorenat BLD i bikupan ibland orsakat larv uteslutning på grund av den höga lukt känslighet av ammande bin. Sockerkompositionen påverkar signifikant den genomsnittliga larvöverlevnad, pre-PUPP larvvikterna, vuxna vikter och ovariole nummer 21. När sirap användes för att leverera transgent pollen eller en positiv kontroll av bekämpningsmedel diazinon till honungsbiet larver, arbetarna avlägsnades några larver från avels celler innehållande tillsatt eller kontaminerade livsmedel 21. Sålunda bör sockerkompositionen noteras. En ökning av antalet en dagsgamla larver eller dispergering de testade individuella avelscellplatser kan också förbättra problemen. Indeed, baserat på observationen av de PPN-BLD behandlingsprocesser och de dramatiska dosberoende effekterna avPPN-BLD på utvecklingen av honungsbin, antog vi att sjuksköterskorna inte bort artificiellt läggas BLD till kullen cellerna. Låga koncentrationer av PPN orsak melanin av puppor, möjligen på grund av ökad fenoloxidas-aktivitet, som reglerar melanin och förpuppning 24, 25, 26. Baserat på användningen av en artificiell utfodring metod för varje kull cell kan de dramatiska effekterna av PPN-BLD om utvecklingen av honungsbin bero på direktkontakt med PPN från den första dagen av kläckningen.
De kemiska doser som används i utfodringsexperiment skulle kunna utformas utifrån enkätdata för bekämpningsmedelsrester i färska pollen prover som tagits från honung bikupor. Det finns en mängd olika vägar för kontaminering av kolonier i den naturliga miljön bekämpningsmedel. Kemiska föroreningar kunde föras tillbaka till de honung bisamhällen och intas av larver på grund av att matnings MOTjon arbetstagare honungsbin, så småningom påverka utvecklingen av larver. För att utvärdera effekterna av PPN på kolonin nivån i bikupan var sirap istället för pollen för att mata i denna studie som den snabbaste och mest direkta sättet att se till att honungsbin konsumerade kemikalien. Vidare kan definieras villkoret för sirap, medan halten av pollen är svår att styra (t ex patogener eller kontaminering av bekämpningsmedel).
Under fältförhållanden, olika utvecklingsstadier (ägg, larver, puppor och vuxna bin) av honungsbin i en honungsbiet koloni drabbas av samma miljö faktor. I vår experimentuppställning var naturliga förhållanden simuleras för att utvärdera effekterna av den kemiska på utvecklingsstadier honungsbin i en dynamisk miljö. Därför, efter PPN-behandling (13 dagar), kunde vi observera den opåverkade utjämningssatsen i grupp 1, det påverkade utjämningssatsen i de övriga åtta grupper, och den påverkas larvstadiets i grupperna 2 och 3, etc. Under dessa förhållanden, de sanna effekterna inom kolonin och vägen spridning av kemikalien till hela kolonin är tydliga.
De honung bisamhällen behandlade med PPN sirap uppvisade distorsion av lockförsedda celler och avlägsnande av puppor från kolonin. Vidare har ett omfattande melanin av puppor observeras i 100 ppm PPN behandling. Således PPN-sirapen matningsmetod tillät den dynamiska effekten av kemikalier på livscykeln för honungsbin i bikupan som skall observeras. I denna studie var sirapen togs upp av arbetaren och ammande bin förmodligen matas till drottningen och larver. För bekräftelse kommer våra framtida studier använda kemiska markörer (såsom ett ätligt färgämne) i den kemiska-innehållande sirapen för att ytterligare underlätta studier av dynamiken i kemiskt förorenade bikupor.
Maten källa sjuksköterska bin bör komma från fält eller bikupa och larver matas underkäken och hypopharyngeal körtel sekret producerade av sjuksköterska bin 21, 25, 26, 27, 28. När larver matas av sjuksköterska bin, kan sekret producerade av hypofarynxcancer körtel i mandibles späda PPN-sirap. Denna biologiska utspädningseffekten mer liknar de naturliga förhållandena men förklarar de olika resultaten till vivo utfodringsmetod i. Flera material inkluderande andra pesticider, tungmetaller och honung bee patogener skulle kunna tillämpas på denna utfodringsmetod för att utvärdera och hantera de roller i honung bisamhällen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Grant 105AS-13.2.3-BQ-B1 från Bureau of Animal och växtskydd inspektion och karantän, rådet för jordbruk, Executive Yuan och Grant 103-2313-B-197-002-My3 från ministeriet för vetenskap och teknologi (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Honey bee box | SAN-YI Honey Factory | W1266 | Honeybees rearing |
| Queen excluder (between frames) | SAN-YI Honey Factory | I1575 | Queen limitation |
| Queen excluder (on top) | SAN-YI Honey Factory | I1566 | Queen limitation on top |
| Bee brush | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | W1414 | clean the bees on frame gently |
| Bee feeder | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | P0219 | feed sugar syrup to colony |
| Transparent slide | Wan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40) | 1139 | Mark the larval area on the frames (Material: Polyethylene Terephthalate, PET) (Size = Length*Width*thick = 29.7 mm * 21 mm * 0.1 mm) |
| 24 well tissu culture plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | TCP011024 | Rearing pupae from extraction |
| Autoclave | Tomin medical equipmenco., LTD. | TM-321 | Make sterilized distilled deionized water (ddH2O) |
| P20 pipetman | Gilson | F123600 | Add PPN into bee larval food pool |
| Incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-550RD | Rearing pupae from extraction |
| Kimwipes | COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD | KCS34155 | Rearing pupae from extraction |
| Royal jelly | National Ilan University (NIU) | NIU | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(-)-Fructose | Sigma | F0127 | Make basic larval diet (BLD) |
| Yeast extract | CONDA, pronadisa | 1702 | Make basic larval diet (BLD) |
| Sucrose | Taiwan sugar coporation | E01071010 | Make sugar syrup for bee food |
| Pyriproxyfen (11%) | LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD. | Registration No. 1937 | Insect growth regulator (IGR) used in the experiment |
References
- Ruffi nengo, S. R., et al. Integrated pest management to control Varroa destructor and its implications to Apis mellifera colonies. Zootecnia Trop. 32 (2), 149-168 (2014).
- Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries, implications for honey bee health. PLoS One. 5, e9754 (2010).
- Lu, C. A., Chang, C. H., Tao, L., Chen, M. Distributions of neonicotinoid insecticides in the Commonwealth of Massachusetts, a temporal and spatial variation analysis for pollen and honey samples. Environ. Chem. 13, 4-11 (2016).
- Tsai, W. T. Analysis of coupling the pesticide use reduction with environmental policy for agricultural sustainability in Taiwan. Environ. & Pollut. 2, 59-65 (2013).
- Weng, Z. H. Pesticide market status and development trend (in Chinese). PRIDE. , https://pride.stpi.narl.org.tw/ (2016).
- Kevan, P. G. Pollinators as bioindicators of the state of the environment, species, activity and diversity. Agric. Ecosys. Environ. 74 (1-3), 373-393 (1999).
- Kevan, P. G. Forest application of the insecticide fenitrothion and its effect on wild bee pollinators (Hymenoptera: Apoidea) of lowbush blueberries (Vaccinium SPP.) in Southern New Brunswick, Canada. Biol. Conserv. 7, 301-309 (1975).
- Crane, E., Walker, P. The impact of pest management on bees and pollination. , IBRA. Cardiff, UK. (1983).
- Haouar, M., Decormis, L., Rey, J. Fluvalinate applied to flowering apple trees-contamination of honey-gathering bees and hive products. Agronomie. 10 (2), 133-137 (1990).
- Chauzat, M. P., et al. A survey of pesticide residues in pollen loads collected by honey bees in France. J. Econ. Entomol. 99 (2), 253-262 (2006).
- Bonzini, S., Tremolada, P., Bernardinelli, I., Colombo, M., Vighi, M. Predicting pesticide fate in the hive (part 1), experimentally determined τ-fluvalinate residues in bees, honey and wax. Apidologie. 42 (3), 378 (2011).
- Sanchez-Bayo, F., Goka, K. Pesticide residues and bees-a risk assessment. PLoS One. 9 (4), e94482 (2014).
- Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. Pesticides and honey bee toxicity-USA. Apidologie. 41, 312-331 (2010).
- Yang, E. C., Chang, H. C., Wu, W. Y., Chen, Y. W. Impaired olfactory associative behavior of honeybee workers due to contamination of imidacloprid in the larval stage. PLoS One. 7, e49472 (2012).
- Urlacher, E., et al. Measurements of chlorpyrifos levels in forager bees and comparison with levels that disrupt honey bee odor-mediated learning under laboratory conditions. J. Chem. Ecol. 42 (2), 127-138 (2016).
- Chen, Y. W., Wu, P. S., Yang, E. C., Nai, Y. S., Huang, Z. Y. The impact of pyriproxyfen on the development of honey bee (Apis mellifera L.) colony in field. J. Asia Pac. Entomol. 19 (3), 589-594 (2016).
- Dennehy, T. J., DrGain, B. A., Harpold, V. S., Brink, S. A., Nichols, R. L. Whitefly Resistance to Insecticides in Arizona: 2002 and 2003 Results. , San Antonio, TX, USA. http://ag.arizona.edu/crop/cotton/insects/wf/whiteflyresistance0204.pdf 1926-1938 (2004).
- Yang, E. C., Wu, P. S., Chang, H. C., Chen, Y. W. Effect of sub-lethal dosages of insecticides on honey bee behavior and physiology. Proceedings of international seminar on enhancement of functional biodiversity relevant to sustainable food production, ASPAC, Tsukuba, Japan, , http://www.niaes.affrc.go.jp/sinfo/sympo/h22/1109/paper_06.pdf (2010).
- Fourrier, J., et al. Larval exposure to the juvenile hormone analog pyriproxyfen disrupts acceptance of and social behavior performance in adult honey bees. PLoS One. 10, e0132985 (2015).
- Hanley, A. V., Huang, Z. Y., Pett, W. L. Effects of dietary transgenic Bt corn pollen on larvae of Apis mellifera and Galleria mellonella. J. Apicult.Res. 42 (4), 77-81 (2003).
- Kaftanoglu, O., Linksvayer, T. A., Page, R. E. Rearing honey bees, apis mellifera, in vitro 1, effects of sugar concentrations on survival and development. J. Insect Sci. 11 (96), 1-10 (2011).
- Vandenberg, J. D., Shimanuki, H. Technique for rearing worker honey bees in the laboratory. J. Apicult. Res. 26 (2), 90-97 (1987).
- Peng, Y. S. C., Mussen, E., Fong, A., Montague, M. A., Tyler, T. Effects of chlortetracycline on honey bee worker larvae reared in vitro. J. Invertebr.Pathol. 60 (2), 127-133 (1992).
- Bitondi, M. M., Mora, I. M., Simoes, Z. L., Figueiredo, V. L. The Apis mellifera pupal melanization program is affected by treatment with a juvenile hormone analogue. J. Insect Physiol. 44 (5-6), 499-507 (1998).
- Zufelato, M. S., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L., Hartfelder, K. The juvenile hormone analog pyriproxyfen affects ecdysteroid-dependent cuticle melanization and shifts the pupal ecdysteroid peak in the honey bee (Apis mellifera). Arthropod Struct. Dev. 29 (2), 111-119 (2000).
- Santos, A. E., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L. Hormone-dependent protein patterns in integument and cuticular pigmentation in Apis mellifera during pharate adult development. J. Insect Physiol. 47 (11), 1275-1282 (2001).
- Brouwers, E. V. M. Glucose/Fructose ratio in the food of honeybee larvae during caste differentiation. J. Apicult.Res. 23 (2), 94-101 (1984).
- Howe, S. R., Dimick, P. S., Benton, A. W. Composition of freshly harvested and commercial royal jelly. J. Apicult. Res. 24 (1), 52-61 (1985).
