Summary
Этот протокол описывает подробная методология для обнаружения H2O2 локализации в солеа senegalensis сперматозоидов с помощью чувствительных флюрохром DCFH-DA ROS, живой митохондрий пятно на митохондрии и DAPI для ядер Визуализация, соответственно. Протокол призван быть выполнены в течение 2 ч с талой или свежие сперматозоидов.
Abstract
Окислительный стресс является одним из важных факторов в снижении качества спермы. Разработка эффективных протоколов для обнаружения реактивнооксигенных видов (ров) в сперматозоиды имеет большое значение в любых видов, но эти методы являются используется редко и еще меньше в костистых. Криоконсервирование является полезным методом в аквакультуре для различных целей, включая банки генов и гарантированная доступность спермы в течение всего года. Замораживания/оттаивания процедур может вызывать производства рос и повреждение клеток спермы. Учитывая потенциальным ущербом, избыток ROS производства может привести к в сперматозоидов в зависимости от их локализации, здесь подробная методология выявления H2O2 и оценить его внутриклеточной локализации, конфокальная микроскопия предусмотрено. Для этой цели сочетание 3 флуорохромов (2′, диацетата 7′-Dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA), пятно живой митохондрии и 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole дигидрохлорид (DAPI)), используются для оценки сотрудничества локализации H2O2 с ядрами сперматозоидов или митохондрий в солеа senegalesis образцов спермы.
Introduction
Реактивнооксигенных видов производства был связан с качеством спермы недавно1. Хотя производство рос в митохондриях может считаться нормальный физиологический процесс, окислительный стресс от избыточного производства рос является ясной причины повреждения в сперматозоидов на различных уровнях. В организме человека Оксидативный стресс связан с мужского бесплодия, изменения моторики и возможность пройти капацитации2; в млекопитающих изменения целостности ДНК в замороженной спермы образцы были также связаны с синтез H2O23.
Криоконсервация является общий метод для гена, банковский счет в аквакультуре. Эта технология особенно важна в видов репродуктивных проблем, таких как senegalensis солею. Этот ценных пород на рынке показывает репродуктивного дисфункции у людей, родившихся в заключении из-за отсутствия ухаживания. Этот факт делает спермы криоконсервация необходимо иметь доступность спермы для искусственного оплодотворения. Однако криоконсервация может быть источником оксидативного стресса, которая может быть пагубным для сперматозоидов4 как исследования сообщали положительный эффект антиоксидантных добавок. ROS ингибирование через митохондриальной таргетингом антиоксидант был сообщениям полезно для криоконсервации спермы в желтый сом5.
Таким образом важно знать, особенно после криоконсервирования6,7 , потому что эти молекулы были признаны как недостаток для выживания спермы и фертильность8уровень рос в образцах спермы. Кроме того изучение распределения рос в ячейке может иметь решающее значение для выведения уровень потенциального ущерба. В качестве примера можно предположить низкий уровень рос в митохондриях нормальной и совместим с функцией спермы, но высокий уровень рос внутри ядро может быть показатели повреждения ДНК сперматозоидов. H2O2 является одним из наиболее актуальных рос, что может быть освобожден от митохондрии и проникать ядро, потому что это небольшая и заряд менее молекулы9. Dichlorofluorescein диацетата (DCFH-DA) специально может выявить внутриклеточных перекиси, излучающие зеленый флуоресценции. В этой статье представлен подробный протокол обнаружения H2O2 внутриклеточной локализации в солеа senegalensis спермы с помощью конфокальной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Флюрохром инкубации и конфокальный анализ займет по крайней мере 2-3 ч для элемента управления и образец с обработанной. Обработка данных не входит в это время вычисления. Необходимые материалы можно найти в Таблице материалов. Этот протокол может быть применен к свежие или Криоконсервированные сперматозоидов. Senegalensis солею является рыб, которые порождает в холодной воде, всегда работы в холодных условиях (4-7 ° C). Общий вид протокола см.
1. Подготовительная работа до эксперимента
- Подготовьте 1 мм, что пятно митохондрии Стоковый раствор в ДМСО чда.
- Подготовьте 4′ 1 мкг/мл, 6-diamidino-2-phenylindole дигидрохлорид (DAPI) раствор в деионизированной воде.
- Приготовляют раствор Рингера 200 мОсм/кг (116 мм NaCl, 2.9 KCl, 1.8 мм CaCl2, 5 HEPES, рН 7,7)
- Подготовка 4 мм 2′, диацетата (DCFH-DA) 7′-dichlorodihydrofluorescein раствор в метаноле чда.
Примечание: Держите акции решения в аликвоты при-20 ° C до тех пор, пока требуется. - Установите microcentrifuge на 4-7 ° C.
2. Подготовка перед флюрохром инкубации
Примечание: Нежный обработка сперматозоидов является желательным, когда дозирования и resuspending.
- При работе с криоконсервированных клеток, готовить на водяной бане для размораживания при 40 ° C на солею senegalensis сперматозоидов10. Погружать соломы образцы в водяной бане для 7 s.
- С помощью ножниц для резки, пустые образца в трубку отцентрифугировать и центрифуги на 1000 x г, 4-7 ° C за 1 мин.
- Удалите семенной плазмы или семенных плазмы с криопротекторами из криоконсервированных образцов, закупорить отказаться от любой компонент, которые могут помешать с окрашивание протоколом.
- Ресуспензируйте клетки в 50-100 мкл 4 ° C 200 мОсм/кг раствора Рингера.
- Определение концентрации сперматозоидов с Нойбауэр или аналогичные Счетной палаты под стереоскопическим микроскопом.
- Разбавления суспензии клеток до 1-2 х 106 клеток/мл в окончательный объем 0,5 мл в 4 ° C раствор Рингера.
3. флюрохром инкубации
Примечание: Флуорохромов должны быть обработаны в условиях низкой освещенности, особенно когда в растворе.
- Добавить 3,125 мкл Стоковый раствор DCFH-DA (конечная концентрация в образца: 25 мкм) для разбавления образца рабочей. Инкубируйте на 4-7 ° C 40 мин в темноте10.
- После 30 мин, добавить 0,5 мкл DAPI Стоковый раствор (конечная концентрация в образце: 2 мкм) и 0,5 мкл митохондрии пятно Стоковый раствор (конечная концентрация в образце: 100 Нм) образца. Инкубируйте оба флуорохромов 10 мин в темноте.
4. Пробоподготовка для Confocal микроскопии
- После инкубации время центрифуга суспензию клеток на 1000 x г, 4-7 ° C за 1 мин.
- Отказаться от супернатант тщательно, закупорить.
- Добавьте 10-20 мкл 200 мОсм/кг раствора Рингера.
- Место 5 мкл суспензии концентрации клеток падение на слайде.
- Тщательно Поставьте крышку слайд на подготовке и запечатать его с польскими. Когда лак высохнет, подготовка готова для confocal микроскопии.
5. конфокальный установки до эксперимента
Примечание: В зависимости от Микроскоп, DCFH-DA может быть «Засветила». Сначала создать лучшие условия с не ценный образец.
- Включите Микроскоп, лазеры, камеры и компьютера с микроскопом.
- Установите возбуждения лазеры, принимая во внимание возбуждения и выбросов максимумов каждого флюрохром:
- Для DAPI, используйте возбуждения максимум 358 Нм и выбросов максимум 465 Нм.
- Для митохондриального пятно, использовать максимум возбуждения 644 Нм и выбросов максимум 662 нм.
- Для DCFH-Да, использовать максимум возбуждения 504 нм и выбросов максимум 525 Нм.
- Начало работы с 25 X цель сосредоточить внимание на сперматозоиды. Выберите канал DAPI сосредоточиться, потому что эта флюрохром сообщает высокой интенсивности. После того, как клетки сосредоточены, используйте 63 X или 100 X цель для тщательной оценки потому что Solea senegalensis сперматозоидов размер около 2 мкм.
- Для каждого канала Оптимизируйте обскуры, усиление и напряжения. В то же время настройте цифровой смещение для уменьшения фона. После того как все параметры оптимизированы для использования флюрохром, сохраните настройки. Для обычной эксперимента для одного senegalensis солею сперматозоид мы использовали следующие (эти параметры могут изменяться в каждом эксперименте): обскуры 1 и усиления напряжения 750 V.
6. приобретение изображений
- Выберите желаемое качество условий для приобретения изображений. Определить параметры приобретения как битовую глубину, формат изображения, толщина листа света и выбрать один двусторонняя освещения. Для обычной эксперимента для одного senegalensis солею сперматозоидов мы использовали следующие (эти параметры могут изменяться в каждом эксперименте): рама размер 1024 px; бит на пиксель 16; скорость сканирования 2-4).
- Открыть и центральную область проверки, чтобы начать и принимать изображение поля.
- С помощью инструмента «Рамка», выберите регион интерес и нажмите живой.
- С помощью инструмента индикатор диапазона настройте цифровой смещение для уменьшения фона. Сделайте это для каждого канала и принимать изображения.
- Проверьте качество отдельных каналов для каждого флюрохром и их комбинаций.
7. Создание 3D изображения видео
- Z-стек приобретения параметры.
- Выберите параметр Z-стека в программном обеспечении.
- Выберите одну ячейку, группы клеток или региона интерес и сосредоточить его.
- Делимитация Z-стек с параметрами «Первый срез» и «Последний кусочек» и установить z шаг к интервалу до 0,2 мкм с помощью тонкой фокус. Выберите канал DAPI сосредоточить внимание потому, что этот флюрохром может сообщать высокой интенсивности и вы можете легко выбрать всю голову сперматозоидов. Выберите оптимальное приобретение параметры для каждого канала и запустить эксперимент.
- Запустите эксперимент Z-стека. Разделение каналов и наблюдать локализации каждого сигнала внутри клетки.
- Z-стека процесса.
- Объем буфера визуализации: после завершения эксперимента, выберите параметры обработки Z-стек программного обеспечения и выберите объем загрузки вариант. Выберите количество шагов и вращения градусов (360°). Сохраните файл с расширением видео.
- Стерео анаглиф: выбор стерео анаглиф в параметрах окна процесса. Этот инструмент позволяет создавать 3D изображения видео с разделить каналы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Конфокальная микроскопия является идеальным методом для внутриклеточная ROS оценки в костистых спермы. Сочетание трех флуорохромов (DAPI, митохондрии пятно и DCFH-DA), представленные в этом исследовании (рис. 1) содержит много полезной информации, которая может применяться в фундаментальные исследования и может иметь применение в совершенствовании процедур, используемых в промышленная аквакультура растений, таких как протоколы криоконсервирования. Различные виды анализа может осуществляться для того, чтобы соотнести внутриклеточная ROS присутствие и другие параметры: подвижность, жизнеспособность, переплетенными между хорошим и плохим заводчиков, активации сократительной способности или спермы сезонные вариации среди многих других. В настоящей работе, отображаются два различных моделей внутриклеточных H2O2 распределения в рамках сперматозоидов: выровненных с митохондрий или разворот в ядре (на рисунках 2, 3). Эти сперматозоидов, показаны низкий потенциальный ущерб, производимые ROS показали, DCFH-DA маркировки только в митохондриях, тогда как тех, кто страдает повреждение ДНК показали, DCFH-DA маркировки также в ядрах. Конфокальная микроскопия программное обеспечение позволяет создавать полезные видео и предоставляют легкий и быстрый colocalization графов.
Рисунок 1 . Общий обзор Протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Пример конфокальное изображение приобретения. A. схема образца б. DAPI канал (маркировка dsDNA). C. митохондрий пятно канал (маркировка митохондрий). D. Митохондрий пятно объединилась с DAPI канал канал. E. ответ-DH канал (маркировка внутриклеточных H2O2). F. ответ-DH канал слилась с DAPI канала. G. слияние трех каналов. Сокращения: n: ядер, mt: митохондрии, f: жгутика и mb: мембраны. Линейки: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Различные модели внутриклеточных H2O2 в солеа senegalensis сперматозоидов (объем рендеринга). Результате каналы сперматозоидов, показывая внутриклеточная ROS в ядерной ямки и митохондриях (A, C, E). Результате каналы сперматозоидов, показаны внутриклеточных H2O2 также внутри ядер (B, D, F). A и B: DAPI. C и D: DCFH-DA. E и F: митохондрии пятно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хорошо известно, что Митохондрии являются ключевыми органеллы для сперматозоидов и функции. Эти органеллы одновременно непосредственно участвуют в производстве рос. Интересно, что для надлежащего спермы функция1необходимы контролируемые уровни ROS. Позитивные отношения между рождаемостью и окислительного стресса были показаны в млекопитающих11 но чрезмерных уровней влияет на качество спермы12. Один решающим фактором, который может стать решающим направлении положительный или отрицательный эффект является не только уровень рос, но и ROS внутриклеточной локализации. Одним из пагубных последствий рос производит ДНК повреждения9 и поэтому ядерного присутствия ROS может быть показателем потенциального ущерба в ядре, тогда как рос уровней может быть нормальной в митохондриях. Это необходимо для дополнения существующих количественные методы (например, проточной цитометрии) с методами как confocal микроскопии, которые могли бы предоставить информацию о рос внутриклеточной локализации.
Конфокальная микроскопия-это оптимальный вариант для визуализации внутриклеточной локализации рос. Использование конкретных флуорохромов как живой митохондрий пятно и DAPI позволяет визуализацию митохондрии и ядро соответственно и сочетание этих молекул с DCFH-DA внутриклеточной локализации перекиси.
Важнейшие шаги в рамках Протокола являются флюрохром инкубации и конфокальный установки. Оба шаги должны быть оптимизированы и тщательно выполнены для получения воспроизводимых и последовательные результаты. Изменения методологии должны выполняться на этих двух уровнях в зависимости от семенных плазмы, используемый. Таким образом флюрохром инкубации должны быть адаптированы. Температуры и условия хранения значительно отличаются среди образцов спермы, и большинство протоколов оптимизированы для млекопитающих.
Здесь описывается протокол для образцов костистых спермы, особенно для senegalensis солею сперматозоидов, (рис. 1). Успешной маркировки ядер и митохондрии были выполнены с использованием описанных протокола и ROS присутствие было выявить, с помощью DCFH-DA (Рисунок 2). Результаты показывают, что Сопредседатель локализации H2O2 были найдены в ядрах или митохондрий в зависимости от образца спермы (рис. 3). Как уже говорилось эти образцы с высоким процентом сперматозоидов, показать высокий уровень рос внутри ядро будет подвержен повреждению ДНК. Этот протокол имеет уникальное ограничение, требование дорогостоящего оборудования (Конфокальный микроскоп), но он может иметь будущее утилита при отборе образцов спермы с низким присутствием рос внутри ядро для криоконсервирования целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Эта работа была финансовую поддержку проекта AGL201568330-C2-1-R (МИНЕКО/ФЕДЕР). David G. Valcarce финансировалась хунта-де-Кастилья и Леон (EDU1084/2012) и социальной Europeo Fondo. Авторы признают, что д-р Ана Риаса и Stolt ферме морского с.а., доктор Паулино де Пас, д-р Игнасио Мартинес Монтеро и Хосе Рамон Guiérrez. Мы также благодарим Паулы Фернандес Colado за видеосъемка.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
