Summary
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה מפורט לגילוי H2O2 לוקליזציה בתוך Solea senegalensis spermatozoa באמצעות fluorochrome רגיש DCFH-DA ROS, כתם המיטוכונדריה בשידור חי עבור המיטוכונדריה, דאפי עבור גרעינים ויזואליזציה, בהתאמה. הפרוטוקול נועד להתבצע בתוך 2 h עם spermatozoa טריים או המופשרים.
Abstract
סטרס חמצוני הוא אחד הגורמים החשובים בהפחתת באיכות הזרע. פיתוח פרוטוקולי יעיל לגילוי מינים חמצן תגובתי (ROS) ב- spermatozoa היא בעלת חשיבות גבוהה בכל מין, אך שיטות אלה הן נדירות אפילו פחות teleost. הקפאה קריוגנית היא טכניקה שימושית בחקלאות ימית למטרות שונות, לרבות בנקאות ג'ין והבטיחה את הזרע זמינות לאורך כל השנה. הקפאה \ הפשרה הליכים יכול לגרום ROS הייצור, נזק לתאי הזרע. בהתחשב פוטנציאליים נזק זה עודף של ROS הפקה עלול לגרום ב spermatozoa תלוי לוקליזציה שלהם, הנה מתודולוגיה מפורט כדי לזהות2O H2 וכן להעריך שלה לוקליזציה תאיים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית מסופק. למטרה זו, שילוב של 3 fluorochromes (2 ′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), כתם המיטוכונדריה בשידור חי ו- 4 ′, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי)) משמשים להערכת ההתאמה שיתוף של H2O2 עם spermatozoa גרעינים או המיטוכונדריה דגימות זרע Solea senegalesis .
Introduction
ההפקה של מינים חמצן תגובתי נקשרה עם איכות זרע לאחרונה1. למרות ROS הייצור בתוך המיטוכונדריה יכול להיחשב תהליך פיזיולוגי נורמלי, סטרס חמצוני על-ידי עודף הייצור ROS הוא סיבה ברורה של פגיעה ב spermatozoa ברמות שונות. בבני אדם, סטרס חמצוני מזוהה עם בעיות פוריות הגבר, שינוי תנועתיות ואת היכולת לעבור capacitation2; ביונקים, שינוי של שלמות הדנ א דגימות זרע קפוא גם קשורה סינתזה של H-2O-2-3.
הקפאה קריוגנית היא טכניקה נפוצה עבור ג'ין בנקאות, חקלאות ימית. טכנולוגיה זו חשוב במיוחד במינים עם בעיות הרבייה כגון Solea senegalensis. מין זה יקר בשוק מראה תפקוד הרבייה אצל אנשים נולדו בשבי עקב מחסור של חיזור. עובדה זו הופכת את הזרע הקפאה קריוגנית חייב להיות זמינות הזרע להפריה מלאכותית. עם זאת, הקפאה קריוגנית יכול להיות מקור של סטרס חמצוני זה יכול להיות מזיקה spermatozoa4 כמו מחקרים דיווחו על השפעה מיטיבה של תוספי נוגדי חמצון. ROS עיכוב באמצעות נוגדי חמצון מיטוכונדריאלי במיקוד היה מועיל הדיווחים על הקפאה קריוגנית זרע שפמנון צהוב5.
לכן, הרמות של ROS דגימות זרע חשובים לדעת, במיוחד לאחר הקפאה קריוגנית6,7 כי מולקולות אלה הוכרו חיסרון זרע הישרדות, פוריות8. יתר על כן, לומד את ההפצה של ROS בתוך התא יכול להיות מכריע להסיק שרמת נזק פוטנציאלי. לדוגמה, רמות נמוכות של ROS בתוך המיטוכונדריה יכול להניח נורמלי ולא תואם עם פונקציית זרע, אך רמות גבוהות של ROS בתוך הגרעין יכול להיות סממנים של נזק לדנ א spermatozoa. H2O2 הוא אחד האבחון הרלוונטיים ביותר יכול להשתחרר מן המיטוכונדריה, לחדור לגרעין כי הוא מולקולה קטנה, תשלום-פחות9. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) באופן ספציפי יכול לחשוף מי חמצן תאיים פולטות קרינה פלואורסצנטית ירוק. במאמר זה, מוצג עבור מזהה H2O2 לוקליזציה תאיים Solea senegalensis הזרע באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פרוטוקול מפורט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: דגירה Fluorochrome וניתוח קונאפוקלית ייקח לפחות 2-3 h עבור פקד, מדגם שטופלו. חישוב זמן זה אינו כולל עיבוד נתונים. חומרים הדרושים ניתן למצוא את הטבלה של חומרים. פרוטוקול זה ניתן ליישם טריים או cryopreserved spermatozoa. Solea senegalensis הוא מין דג שמשריץ במים קרים, עבודה תמיד בתנאים קרים (4-7 ° C). ראה איור 1 מראה כללי של הפרוטוקול.
1. עבודת הכנה לפני הניסוי
- הכן 1 מ מ המיטוכונדריה כתם מניות פתרון אנליטי כיתה דימתיל סולפוקסיד.
- להכין עם 4 ′ 1 μg/mL, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי) פתרון מלאי במים יונים.
- להכין פתרון דומה מאוד mOsm/kg 200 (116 מ"מ NaCl, 2.9 מ"מ אשלגן כלורי, 1.8 מ"מ CaCl2, 5 מ מ. HEPES, pH 7.7)
- להכין 2 ′ 4 מ מ, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) מניות פתרון אנליטי כיתה מתנול.
הערה: שמור את הפתרונות מניות aliquots ב-20 ° C עד שהוא נדרש. - להגדיר את microcentrifuge ב 4-7 ° C.
2. דגימה ההכנה לפני Fluorochrome דגירה
הערה: טיפול עדין spermatozoa רצוי, כאשר pipetting ו- resuspending.
- אם עובדים עם תאים cryopreserved, להכין אמבט מים מפשיר ב 40 מעלות צלזיוס Solea senegalensis spermatozoa10. לטבול את הדגימות קש באמבט מים עבור 7 s.
- באמצעות מספריים לחתוך, לרוקן את הדגימה לתוך צינור microfuge, צנטריפוגה ב g x 1000, 4-7 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה.
- הסר פלזמה הזרע או פלזמה הזרע עם cryoprotectants מדגם cryopreserved על ידי pipetting כדי למחוק את רכיב כלשהו שעלולה להפריע פרוטוקול מוכתמים.
- Resuspend התאים ב- 50-100 μL של 4 ° C 200 mOsm/kg פתרון דומה מאוד.
- לקבוע ריכוז הזרע נויבאואר או חדר הספירה דומה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.
- לדלל התליה תא עד ל- 1-2 x 106 תאים למ"ל באמצעי אחסון הסופי של 0.5 מ ל 4 ° C הכפיל פתרון.
3. fluorochrome דגירה
הערה: חייבים להיות מטופלים Fluorochromes בתנאי אור נמוך, במיוחד כאשר בפתרון.
- להוסיף 3.125 μL של DCFH-DA פתרון מניות (הריכוז הסופי במדגם: 25 μM) כדי דילול דגימת עבודה. דגירה ב 4-7 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות חושך10.
- לאחר 30 דקות, להוסיף 0.5 μL של הפתרון מניות דאפי (הריכוז הסופי במדגם: 2 μM) ו- 0.5 μL של המיטוכונדריה כתם פתרון מניות (הריכוז הסופי במדגם: 100 ננומטר) לדגימת. דגירה בשני fluorochromes 10 דקות בחשכה.
4. לדוגמה כהכנה מיקרוסקופיה קונפוקלית
- לאחר זמן הדגירה, centrifuge התליה תא ב g x 1000, 4-7 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה.
- למחוק את תגובת שיקוע בקפידה על-ידי pipetting.
- הוסף של 10-20 μL של mOsm/kg 200 פתרון דומה מאוד.
- מקום 5 μL של השעיה תא מרוכז ירידה בשקופית.
- . בזהירות, לשים שקופית כיסוי על ההכנה, לאטום אותו עם פולין. ברגע הפולני הוא יבש, ההכנה הוא מוכן מיקרוסקופיה קונפוקלית.
5. קונאפוקלית ההתקנה לפני הניסוי
הערה: בהתאם המיקרוסקופ, DCFH-DA יכול להיות "שרוף". ליצור את התנאים הטובים ביותר עם מדגם שאינו יקר קודם.
- הפעל את המיקרוסקופ, לייזרים, מצלמה, המחשב פועל המיקרוסקופ.
- הגדר לייזרים עירור לוקח בחשבון את ערכים מרביים עירור, פליטה של כל fluorochrome:
- . דאפי, לשימוש של עירור היותר 358 nm ומקסימום של פליטה של 465 nm.
- לשימוש הכתם מיטוכונדריאלי, עירור של לכל היותר 644 nm ומקסימום של פליטה של 662 ננומטר.
- לשימוש DCFH-DA, מקסימום של עירור של 504 nm ומקסימום של פליטה של 525 ננומטר.
- התחל לעבוד במטרה X 25 למקד spermatozoa. בחרו בערוץ דאפי להתרכז בגלל fluorochrome הזה מדווח העוצמה הגבוהה ביותר. ברגע התאים ממוקדים, להשתמש 63 X או המטרה X 100 הערכה יסודית מכיוון Solea senegalensis spermatozoa גודל הוא כ-2 μm.
- בכל אחד מהערוצים, למטב את חריר, לרווח את המתח. באותו אופן, כוונון ההיסט של דיגיטלי כדי להפחית את הרקע. לאחר כל הפרמטרים הממוטבות את fluorochrome להשתמש, לשמור את ההגדרות. עבור ניסוי שגרתי בודד תא הזרע Solea senegalensis השתמשנו הבאות (פרמטרים אלה עשויים להשתנות ניסוי): חריר 1 ואת המתח רווח של 750 V.
6. רכישת תמונות
- בחר את התנאים באיכות הרצויה עבור רכישת התמונה. להגדיר הגדרות רכישה כמו עומק סיביות, פורמט התמונה, עובי גיליון האור ובחרו תאורה צדדית יחיד. עבור ניסוי שגרתי בודד Solea senegalensis spermatozoa השתמשנו הבאות (פרמטרים אלה עשויים להשתנות ניסוי): מסגרת בגודל 1024 px; סיביות לפיקסל 16; מהירות סריקה של 2-4).
- פתח, מרכז את אזור הסריקה כדי להתחיל לקחת תמונה של השדה.
- באמצעות הכלי ' חיתוך ', בחר את האזור עניין והקש בשידור חי.
- בעזרת הכלי מחוון טווח, כוונון ההיסט של דיגיטלי כדי להפחית את הרקע. לעשות את זה בכל אחד מהערוצים ולקחת את התמונה.
- בדוק את האיכות של ערוצים נפרדים עבור כל fluorochrome ושילובים שלהם.
7. יצירת וידאו תמונה תלת-ממדית
- Z-מחסנית רכישה הגדרות.
- בחר באפשרות Z-מחסנית בתוכנה.
- בחר בתא יחיד, קבוצה של תאים או אזור עניין ולהתמקד זה.
- מפריד את Z-המחסנית עם האפשרויות 'הראשון פרוסה' ו- 'הוגן' ולהקים הצעד z מרווח 0.2 מיקרומטר עם העזרה של המוקד משובחים. בחרו ' ערוץ דאפי כדי להתרכז בגלל fluorochrome הזה עשוי לדווח על העוצמה הגבוהה ביותר, באפשרותך לבחור בקלות את כל הראש spermatozoa. לבחור את הפרמטרים רכישה אופטימלית עבור כל ערוץ, להפעיל את הניסוי.
- הפעל את הניסוי Z-מחסנית. לפצל את הערוצים ולצפות הלוקליזציה של כל אות בתוך התאים.
- Z-מחסנית תהליך.
- רינדור נפח: לאחר סיום הניסוי, בחר את האפשרויות של התוכנה לעיבוד Z-מחסנית ובחרו אמצעי האחסון רינדור אפשרות. בחר את מספר צעדים, את מעלות סיבוב (360 מעלות). שמור את הקובץ עם סיומת. וידאו.
- טכנולוגיית סטריאו: לבחור את טכנולוגיית סטריאו אפשרויות חלון תהליך. כלי זה מאפשר ליצור תמונה 3D וידאו עם פצל ערוצים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקרוסקופיה קונפוקלית היא שיטה אידיאלית להערכה ROS תאיים זרע teleost. השילוב של שלוש fluorochromes (דאפי, הכתם המיטוכונדריה, DCFH-DA) שהוצגו במחקר זה (איור 1) מספק הרבה מידע שימושי, זה יכול להיות מיושם במחקר בסיסי ויש יישומים לשיפור תהליכי בשימוש חקלאות מים תעשייתי צמחים, כגון פרוטוקולים הקפאה קריוגנית. סוגים שונים של ניתוח עשוי להתבצע על מנת לתאם תאיים ROS בנוכחות ופרמטרים אחרים: תנועתיות, הכדאיות, דפוסים שונים בין טוב ורע מגדלים, הפעלה של תנועתיות או וריאציות עונתי זרע בקרב רבים אחרים. שני דפוסים שונים של התפלגות2 2O H תאיים בתוך spermatozoa העבודה הנוכחית, מוצגים: מספקת עם מיטוכונדריון או כפולה בגרעין (איורים 2, 3). אלה spermatozoa מציג נמוך נזק פוטנציאלי המיוצר על ידי ROS הראה DCFH-DA labelling רק בתוך המיטוכונדריה ואילו לאלו הסובלים נזק לדנ א הראה DCFH-DA labelling גם בהגרעינים. מיקרוסקופיה קונפוקלית התוכנה מאפשרת ליצור סרטונים שימושיים ולספק גרפים colocalization קלה ומהירה.
איור 1 . סקירה כללית של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . דוגמה של ייבוא תמונות קונפוקלי. ערכת א מדגם B. ערוץ דאפי (labelling dsDNA). ג. המיטוכונדריה כתם ערוץ (labelling מיטוכונדריון). ד המיטוכונדריה כתם ערוץ התמזגה עם דאפי ערוץ. אי DCFA-DH ערוץ (labelling תאיים H2O2). פ DCFA-DH ערוץ התמזגה עם דאפי ערוץ. ג למזג של שלושה ערוצי. קיצורים: n: גרעינים, mt: המיטוכונדריה, f: שוטון ו mb: ממברנה. סרגל קנה מידה: 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . דפוסים שונים של H תאיים2O2 ב- Solea senegalensis spermatozoa (נפח רינדור). ערוצים וכתוצאה מכך של spermatozoa מציג ROS תאיים פוסה גרעינית, מיטוכונדריון (A, C, E). ערוצים וכתוצאה מכך של spermatozoa מציג תאיים2O H2 גם בתוך האטומים (B, D, F). A ו- B: דאפי. C ו- D: DCFH-פרקליט המחוז E ו- F: כתם המיטוכונדריה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה ידוע כי המיטוכונדריה הם organelles מפתח עבור זרע תנועתיות ותפקוד. Organelles אלה מעורבים במקביל ישירות בייצור ROS. מעניין, רמות מבוקרת של ROS נדרשים עבור זרע תקין פונקציה1. יחסים חיוביים בין פוריות סטרס חמצוני הוכחו יונקים11 אך רמות מוגזמות להשפיע על איכות הזרע12. גורם מכריע אחד זה יכול להיות מכריע לקראת אפקט חיובי או שלילי הוא לא רק רמות ROS, אלא גם לוקליזציה תאיים ROS. אחת ההשפעות המזיקות של ROS מפיק DNA נזק9 , ולכן נוכחות הגרעין של ROS יכול להיות מצביע על נזק פוטנציאלי בגרעין ואילו רמות ROS יכול להיות נורמלי המיטוכונדריה. זה הכרחי להשלמת שיטות כמותיות קיימות (למשל, cytometry זרימה) עם טכניקות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית יכול לספק מידע על לוקליזציה תאיים ROS.
מיקרוסקופיה קונפוקלית הוא אופציה אופטימלית להמחיש לוקליזציה תאיים של ROS. השימוש fluorochromes ספציפיים כגון כתם המיטוכונדריה בשידור חי, דאפי מאפשר את הפריט החזותי של המיטוכונדריה, גרעין בהתאמה ומאפשרת השילוב של מולקולות אלה עם DCFH-DA לוקליזציה תאיים של מי חמצן.
השלבים הקריטיים בתוך הפרוטוקול הם fluorochrome הדגירה ולאחר ההתקנה קונפוקלי. שני צעדים צריך להיות מותאם וביצע בקפידה כדי להשיג תוצאות עקביות הדירים. שינויים המתודולוגיה צריכה להתבצע בשני מישורים אלה תלוי פלזמה הזרע המשמש. לכן, דגירה fluorochrome צריך להיות מותאם. טמפרטורות ותנאי אחסון משתנים בצורה משמעותית בין דגימות זרע, רוב הפרוטוקולים ממוטבים עבור יונקים.
כאן, עבור דגימות זרע teleost, במיוחד עבור spermatozoa Solea senegalensis , פרוטוקול המתואר (איור 1). תיוג מוצלחת של גרעינים, המיטוכונדריה בוצעו באמצעות פרוטוקול המתואר ולחשוף ROS בנוכחות יש כבר באמצעות DCFH-DA (איור 2). התוצאות מראות את לוקליזציה שיתוף של H2O התגלו2 גרעינים או המיטוכונדריה בהתאם דגימת זרע (איור 3). כמוסבר בעבר, את הדגימות עם אחוז גבוה של spermatozoa הצגת רמות גבוהות של ROS בתוך הגרעין יהיה נוטה נזק לדנ א. פרוטוקול זה יש הגבלה ייחודי, הדרישה של ציוד יקר (מיקרוסקופ קונפוקלי), אבל יכול להיות כלי העתיד בבחירת דגימות זרע עם נוכחות נמוכה של ROS בתוך הגרעין למטרות הקפאה קריוגנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים AQUAGAMETE פא 1205 עלות פעולה. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי פרויקט AGL201568330-C2-1-R (MINECO/פדר). דוד ג Valcarce מומן על ידי דה חונטה ולאון (EDU1084 2012) ו Fondo Europeo חברתית. מחברים מכיר ד ר אנה Riaza, האנרגטי לים חווה דרום אמריקה, ד ר פאולין דה פז, ד ר איגנסיו מרטינס מונטרו, חוסה רמון Guiérrez. אנו מודים גם פאולה פרננדז Colado עבור צילום וידאו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
