Summary
Este protocolo descreve uma metodologia detalhada para detectar a localização de2 H2O dentro Solea senegalensis espermatozoides usando um fluorocromo sensível Diniz Melo-para ROS, uma mancha de mitocôndrias ao vivo para a mitocôndria e DAPI para núcleos visualização, respectivamente. O protocolo é projetado para ser realizada até 2 horas com espermatozoides descongelados ou frescos.
Abstract
Estresse oxidativo é um dos fatores importantes na diminuição da qualidade do esperma. Desenvolvimento de protocolos eficientes para a detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) de espermatozoides é de grande importância em qualquer espécie, mas esses métodos são usados raramente e ainda menos em teleósteos. Criopreservação é uma técnica útil na aquicultura para diferentes finalidades, incluindo bancos de genes e disponibilidade de esperma ao longo do ano. Procedimentos de congelamento/descongelamento pode causar a produção de ROS e danificar as células de esperma. Considerando os potenciais danos que um excesso de produção de ROS poderia causar em espermatozoides, dependendo da sua localização, aqui uma metodologia detalhada para detectar H2O2 e avaliar sua localização intracelular por microscopia confocal é fornecido. Para este efeito, uma combinação de 3 fluorochromes (2 ′, diacetato de 7 '-Dichlorodihydrofluorescein (Diniz Melo-DA), uma mancha de mitocôndrias ao vivo e 4 ′, dicloridrato 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) são usados para avaliar a localização co de H2O2 com núcleos de espermatozoides ou mitocôndrias em amostras de esperma de Solea senegalesis .
Introduction
A produção de espécies reativas de oxigênio tem sido associada com a qualidade do esperma recentemente1. Embora a produção de ROS na mitocôndria pode ser considerada um processo fisiológico normal, estresse oxidativo, por um excesso de produção de ROS é uma clara causa de danos no espermatozoide em diferentes níveis. Em humanos, estresse oxidativo está associado com a infertilidade masculina, alterando a motilidade e a capacidade de se submeter a capacitação2; em mamíferos, alteração da integridade do DNA em amostras de esperma congelado tem sido também relacionada à síntese de H2O23.
Criopreservação é uma técnica comum para gene bancário na aquicultura. Esta tecnologia é particularmente importante em espécies com problemas reprodutivos como Solea senegalensis. Esta espécie valiosa no mercado mostra disfunção reprodutiva em indivíduos nascidos em cativeiro devido à falta de namoro. Este fato torna a criopreservação de esperma necessário ter disponibilidade de esperma para fertilização artificial. No entanto, criopreservação poderia ser uma fonte de estresse oxidativo que pode ser prejudicial para espermatozoides4 como estudos relataram um efeito benéfico da suplementação antioxidante. Inibição de ROS através de antioxidante mitocondrial-alvo foi supostamente benéfica para criopreservação de esperma em bagre amarelo5.
Portanto, os níveis de ROS em amostras de esperma são importantes para saber, particularmente após a criopreservação6,7 , porque estas moléculas foram reconhecidas como uma desvantagem para a sobrevivência de esperma e fertilidade8. Além disso, estudando a distribuição de ROS dentro da célula pode ser crucial para inferir o nível de dano potencial. Por exemplo, baixos níveis de ROS na mitocôndria poderiam ser assumidos normal e compatível com a função de esperma, mas altos níveis de ROS dentro do núcleo podem ser indicadores de danos de DNA de espermatozoides. H2O2 é um do mais relevante ROS que poderia ser libertado da mitocôndria e penetrar no núcleo, porque é uma molécula pequena e sem carga9. Diacetato de diclorofluoresceína (Diniz Melo-DA) especificamente pode revelar peróxido intracelular emitindo fluorescência verde. Neste artigo, é apresentado um protocolo detalhado para a detecção de H2O2 intracelular localização no esperma de Solea senegalensis usando microscopia confocal.
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Protocol
Nota: Incubação fluorocromo e confocal análise levará pelo menos 2-3 h para um controle e uma amostra tratada. Processamento de dados não está incluído no cálculo deste tempo. Os materiais necessários podem ser encontrados na Tabela de materiais. Este protocolo pode ser aplicado a espermatozoides frescos ou criopreservados. Solea senegalensis é uma espécie de peixe que desova em água fria, trabalho sempre sob condições de frio (4-7 ° C). Veja a Figura 1 para uma visão geral do protocolo.
1. os preparativos antes do experimento
- Prepare um 1mm mitocôndrias mancham solução stock em qualidade analítica DMSO.
- Prepare um 4 ′ 1 μg/mL, solução estoque de dicloridrato de 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) em água desionizada.
- Preparar uma solução de Ringer 200 mOsm/kg (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5mm HEPES, pH 7,7)
- Prepare um 4 mM 2 ', 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetato (Diniz Melo-DA) solução estoque em metanol de grau analítico.
Nota: Manter as soluções estoque em alíquotas a-20 ° C até ser necessário. - Definir a microcentrifuga 4-7 ° c.
2. amostra preparação antes de incubação fluorocromo
Nota: Suave manipulação de espermatozoides é desejável quando pipetagem e resuspending.
- Se trabalhar com células criopreservadas, prepare um banho de água para descongelar a 40 ° C para Solea senegalensis espermatozoides10. Mergulhe as amostras palha num banho de água durante 7 s.
- Usando uma tesoura para cortar, esvaziar a amostra para um tubo de microcentrífuga e centrifugar a 1000 x g, 4-7 ° C por 1 min.
- Remova o plasma seminal ou plasma seminal com crioprotectores da amostra criopreservada pipetando para descartar qualquer componente que possa interferir com o protocolo de coloração.
- Ressuspender as células em 50-100 μL de 4 ° C 200 mOsm/kg solução de Ringer.
- Determine a concentração de espermatozoides com um Neubauer ou uma câmara de contagem semelhante ao microscópio estereoscópico.
- Dilua a suspensão de células acima de 1-2 x 106 células/mL em um volume final de 0,5 mL em 4 ° C solução de Ringer.
3. fluorocromo incubação
Nota: Fluorochromes devem ser manipulados em condições de pouca luz, especialmente quando em solução.
- Adicionar 3.125 μL de solução Diniz Melo-DA-mãe (concentração final na amostra: 25 μM) para a diluição da amostra de trabalho. Incube a 4-7 ° C por 40 min na escuridão10.
- Depois de 30 min, adicionar 0,5 μL da solução-mãe DAPI (concentração final na amostra: 2 μM) e 0,5 μL das mitocôndrias manchar a solução-mãe (concentração final na amostra: 100 nM) para a amostra. Incube os dois fluorochromes por 10 min na escuridão.
4. amostra preparação para a microscopia Confocal
- Após o tempo de incubação, centrifugar a suspensão de eritrócitos a 1000 x g, 4-7 ° C por 1 min.
- Desprezar o sobrenadante cuidadosamente por pipetagem.
- Adicione uma 10-20 μL de solução de Ringer de 200 mOsm/kg.
- Lugar 5 μL de uma suspensão concentrada de células uma gota em um slide.
- Com cuidado, colocar um slide de capa sobre a preparação e selá-lo com o polonês. Quando o esmalte estiver seco, a preparação está pronta para a microscopia confocal.
5. confocal Setup antes do experimento
Nota: Dependendo do microscópio, Diniz Melo-DA pode ser "queimada". Primeiro, estabelece as melhores condições com uma amostra não-valiosa.
- Ligue o microscópio, lasers, câmera e o computador que executa o microscópio.
- Conjunto de lasers de excitação, tendo em conta os máximos da excitação e emissão de cada fluorocromo:
- Para DAPI, usar um máximo de excitação de 358 nm e um máximo de emissão de 465 nm.
- Para a mancha mitocondrial, usar um máximo de excitação de 644 nm e um máximo de emissão de 662 nm.
- Para Diniz Melo-DA, usar um máximo de excitação de 504 nm e um máximo de emissão de 525 nm.
- Começa a trabalhar com o objectivo de X 25 para concentrar os espermatozoides. Escolha o canal DAPI para foco porque este fluocromo informa a intensidade mais elevada. Uma vez que as células estão focadas, use um 63 X ou 100 X de objectivo para uma avaliação completa porque Solea senegalensis espermatozoides tamanho é cerca de 2 μm.
- Para cada canal, otimize o pinhole, o ganho e a tensão. Da mesma forma, ajuste o deslocamento digital para reduzir o plano de fundo. Uma vez que todos os parâmetros são otimizados para o fluorocromo usado, salve as configurações. Para um experimento de rotina para uma única célula de esperma de Solea senegalensis , usamos o seguinte (esses parâmetros podem ser alterado em cada experimento): pinhole de 1 e a ganho de tensão de 750 V.
6. aquisição de imagens
- Selecione as condições de qualidade desejada para a aquisição de imagem. Definir configurações de aquisição como profundidade de bits, formato de imagem, espessura de folha de luz e escolher a iluminação de face única. Para um experimento de rotina para um único espermatozoide Solea senegalensis , usamos o seguinte (esses parâmetros podem ser alterado em cada experimento): frame com tamanho de 1024 px; bits por pixel de 16; velocidade de digitalização de 2-4).
- Abri e centralizar a área de varredura para iniciar e levar uma imagem do campo.
- Usando a ferramenta Corte Demarcado, selecione a região de interesse e pressione ao vivo.
- Com a ajuda da ferramenta de indicador de intervalo, ajuste o deslocamento digital para reduzir o plano de fundo. Fazer isso para cada canal e levar a imagem.
- Verifica a qualidade dos canais individuais para cada fluorocromo e suas combinações.
7. criar um vídeo 3D imagem
- Configurações de aquisição de Z-pilha.
- Escolha a opção Z-pilha no software.
- Selecione a célula única, grupo de células ou região de interesse e concentrá-la.
- Delimitar a Z-pilha com as opções de 'Primeira fatia' e 'Última fatia' e estabelecer o passo de z para intervalo de 0,2 µm, com a ajuda do foco fino. Escolha o canal DAPI se concentrar, porque este fluocromo pode relatar a maior intensidade e você pode facilmente selecionar a cabeça inteira de espermatozoides. Escolha os parâmetros de aquisição ideal para cada canal e executar o experimento.
- Execute o experimento de Z-pilha. Dividir os canais e observar a localização de cada sinal dentro das células.
- Processo de Z-pilha.
- Renderização de volume: uma vez terminado o experimento, selecione as opções de software de processamento da Z-pilha e escolher o volume processar opção. Selecione o número de etapas e os graus de rotação (360°). Salve o arquivo com uma extensão de vídeo.
- Anáglifo: escolher o anáglifo nas opções de janela de processo. Esta ferramenta permite para criar uma imagem 3D vídeo com separação de canais.
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Representative Results
Microscopia confocal é um método ideal para avaliação de ROS intracelular em teleósteos esperma. A combinação de três fluorochromes (DAPI, uma mancha de mitocôndrias e Diniz Melo-DA) apresentado neste estudo (Figura 1) fornece muitas informações úteis que podem ser aplicados em pesquisa básica e podem ter aplicações em melhorar os procedimentos utilizados na plantas industriais de aquicultura, como protocolos de criopreservação. Diferentes tipos de análise podem ser efectuados para correlacionar a presença ROS intracelular e outros parâmetros: motilidade, viabilidade, diferentes padrões entre criadores de boas e más, ativação da motilidade ou variações sazonais de esperma, entre muitos outros. No presente trabalho, são mostrados dois padrões diferentes de intracelular distribuição de2 2O H dentro do espermatozoide: colocado com mitocôndria ou propagação no núcleo (figuras 2, 3). Os espermatozoides apresentando baixo dano potencial produzido por ROS mostraram Diniz Melo-DA rotulagem apenas nas mitocôndrias, Considerando que aqueles que sofrem dano de DNA mostraram Diniz Melo-DA rotulagem também nos núcleos. Microscopia confocal software permite criar vídeos úteis e fornecer gráficos colocalization fácil e rápido.
Figura 1 . Visão geral do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Exemplo de aquisição de imagens confocal. R. regime da amostra B. Canal DAPI (rotulagem dsDNA). C. mitocôndria mancha canal (rotulagem mitocôndria). M. Mitocôndrias mancham canal fundiu-se com o canal DAPI. E. canal de DCFA-DH (rotulagem intracelular H2O2). F. canal DCFA-DH fundiu-se com o canal DAPI. G. a fusão dos três canais. Abreviaturas: n: núcleos, mt: mitocôndrias, f: flagelo de mb: membrana. Barra de escala: 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Diferentes padrões de intracelular H2O2 no Solea senegalensis espermatozoides (renderização de Volume). Canais resultantes de espermatozoides mostrando ROS intracelular na fossa nuclear e na mitocôndria (A, C, E). Canais resultantes de espermatozoides apresentando intracelular H2O2 também dentro dos núcleos (B, D, F). A e B: DAPI. C e D: Diniz Melo-promotor. E e F: mancham de mitocôndrias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
É sabido que as mitocôndrias são organelas chaves para motilidade espermática e função. Estas organelas estão simultaneamente diretamente envolvidas na produção de ROS. Curiosamente, níveis controlados de ROS são necessários para esperma adequado função1. Relações positivas entre fertilidade e estresse oxidativo tem sido demonstradas em mamíferos11 mas níveis excessivos afetam esperma qualidade12. Um fator crucial que pode ser decisivo para um efeito positivo ou negativo é não só a níveis ROS, mas também a localização intracelular de ROS. Um dos efeitos deletérios da ROS está produzindo DNA danos9 e, portanto, a presença nuclear de ROS pode ser um indicador de potenciais danos no núcleo, Considerando que os níveis ROS podem ser normais na mitocôndria. É necessário para complementar os métodos quantitativos existentes (por exemplo, citometria de fluxo) com técnicas como a microscopia confocal que poderia fornecer informações sobre a localização intracelular de ROS.
Microscopia confocal é uma óptima opção para visualizar a localização intracelular de ROS. O uso de fluorochromes específicos, tais como uma mancha de mitocôndrias ao vivo e DAPI permite a visualização de mitocôndrias e núcleo respectivamente e a combinação destas moléculas com Diniz Melo-DA permite a localização intracelular do peróxido.
Os passos críticos dentro do protocolo são incubação fluorocromo e instalação confocal. As duas etapas devem ser otimizadas e executadas cuidadosamente para obter resultados consistentes e reprodutíveis. Modificações da metodologia devem efectuar-se a estes dois níveis dependendo do plasma seminal utilizado. Portanto, incubação de fluorocromo deve ser adaptada. Temperaturas e condições de armazenamento significativamente diferem entre as amostras de esperma, e a maioria dos protocolos é otimizada para mamíferos.
Aqui, um protocolo para amostras de esperma teleósteos, particularmente para espermatozoides de Solea senegalensis , é descrito (Figura 1). Sucesso de rotulagem dos núcleos e mitocôndrias foram executadas usando o protocolo descrito e presença ROS tem sido revelar usando Diniz Melo-DA (Figura 2). Os resultados indicam a localização co de H2O2 foram encontrados nos núcleos ou mitocôndrias dependendo da amostra de esperma (Figura 3). Como explicado anteriormente, as amostras com uma elevada percentagem de espermatozoides exibindo elevados níveis de ROS dentro do núcleo seria propensas a danos no DNA. Este protocolo tem uma única limitação, a exigência de equipamento caro (microscópio confocal), mas pode ter futuro utilitário na seleção de amostras de esperma com baixa presença de ROS dentro do núcleo para fins de criopreservação.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a AQUAGAMETE FA 1205 custo de ação. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo projeto AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce foi financiado pela Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) e Fondo Social Europeo. Os autores reconhecem a Dr. Ana Riaza e Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero e José Ramón Guiérrez. Agradecemos também a Paula Fernández Colado pela videografia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
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