Summary
Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methodologie voor het opsporen van H2O2 localisatie binnen Solea senegalensis spermacellen met behulp van een gevoelige fluorescerende DCFH-DA ROS, een levende mitochondriën vlek voor mitochondria en DAPI voor kernen visualisatie, respectievelijk. Het protocol is ontworpen om te worden uitgevoerd binnen de 2 uur met verse of ontdooide spermacellen.
Abstract
Oxidatieve stress is één van de belangrijkste factoren in het verminderen van de kwaliteit van het sperma. Het ontwikkelen van efficiënte protocollen voor het opsporen van reactieve zuurstof soorten (ROS) in spermacellen is van groot belang in alle soorten, maar deze methoden zijn zelden gebruikte en nog minder in teleost. Cryopreservatie is een nuttige techniek in de aquacultuur voor verschillende doeleinden, met inbegrip van gene bancaire en gegarandeerde sperma beschikbaarheid gedurende het hele jaar. Invriezen/ontdooien procedures kunnen veroorzaken ROS productie en schadelijk voor de zaadcellen. Gezien de potentiële die schade zou kunnen een overmaat van ROS productie veroorzaken bij spermacellen afhankelijk van hun lokalisatie, hier een gedetailleerde methodologie te detecteren H2O2 en te evalueren van de intracellulaire lokalisatie door confocale microscopie wordt verstrekt. Voor dit doel, een combinatie van 3 fluorochromes (2′, 7-Dichlorodihydrofluorescein DIACETAAT (DCFH-DA), een live mitochondriën vlek en 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI)) worden gebruikt om te evalueren van de co lokalisatie van H2O2 met spermacellen kernen of mitochondriën in Solea senegalesis spermastaaltje.
Introduction
De productie van reactieve zuurstof soorten is in verband gebracht met de kwaliteit van het sperma onlangs1. Hoewel ROS productie in mitochondriën kan worden beschouwd als een normale fysiologische proces, is oxidatieve stress door een overmaat aan ROS productie een duidelijke oorzaak van de schade in spermacellen op verschillende niveaus. Bij de mens wordt oxidatieve stress geassocieerd met mannelijke infertiliteit, wijzigen van de beweeglijkheid en de mogelijkheid om het ondergaan van de rechtsbevoegdheid2; bij zoogdieren, heeft verandering van DNA integriteit in ingevroren sperma monsters ook verband met de synthese van H2O23.
Cryopreservatie is een gemeenschappelijke techniek voor gen bankbedrijf in de aquacultuur. Deze technologie is met name belangrijk in soorten met vruchtbaarheidsproblemen zoals Solea senegalensis. Deze waardevolle soorten op de markt toont reproductieve dysfunctie in individuen geboren in gevangenschap als gevolg van een gebrek aan verkering. Dit feit maakt sperma cryopreservatie noodzakelijk dat sperma beschikbaarheid voor kunstmatige bevruchting. Cryopreservatie zou echter een bron van oxidatieve stress die schadelijk voor spermacellen4 zou kunnen zijn, zoals studies hebben een gunstig effect van antioxidant suppletie gemeld. ROS remming door middel van mitochondriale-gerichte antioxidant was naar verluidt gunstig voor sperma cryopreservatie in gele meerval5.
De niveaus van ROS in spermastaaltje zijn daarom belangrijk om te weten, vooral na cryopreservatie6,7 , omdat deze moleculen zijn erkend als een nadeel voor zaadcellen overleven en vruchtbaarheid8. Bovendien, het bestuderen van de verdeling van de ROS binnen de cel kan doorslaggevend zijn voor afleiden van het niveau van de potentiële schade. Als voorbeeld, lage niveaus van ROS in de mitochondriën kunnen worden aangenomen, normale en compatibel met sperma functie, maar hoge niveaus van ROS binnen de kern zou indicatoren van de schade van DNA van spermacellen. H2O2 is een van de meest relevante ROS die kunnen vrijkomen uit de mitochondriën en het doordringen van de kern, want het is een kleine en lading-minder molecuul9. Dichlorofluorescein DIACETAAT (DCFH-DA) kan specifiek intracellulaire peroxide uitstoten groene fluorescentie onthullen. In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol voor het opsporen van H2O2 intracellulaire lokalisatie in Solea senegalensis sperma met behulp van de confocal microscopie gepresenteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Fluorescerende incubatie en confocal analyse zal duren ten minste 2-3 uur voor een besturingselement en een behandelde monster. Verwerking van gegevens is niet opgenomen in de berekening van deze tijd. Benodigde materialen kunnen worden gevonden in de Tabel van materialen. Dit protocol kan worden toegepast op vers of cryopreserved spermacellen. Solea senegalensis is een vissoort die in koud water, werk altijd onder koude omstandigheden (4-7 ° C paait). Zie afbeelding 1 voor een algemeen beeld van het protocol.
1. voorbereidende werkzaamheden voor het Experiment
- Bereiden een 1 mM mitochondriën vlek stockoplossing in p.a. DMSO.
- Bereiden een 1 μg/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI) stockoplossing in gedeïoniseerd water.
- Bereid een 200 mOsm/kg Ringer-oplossing (116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.7)
- Bereiden een 4 mM 2′, 7-dichlorodihydrofluorescein DIACETAAT (DCFH-DA) voorraad oplossing in methanol p.a..
Opmerking: Houd de voorraadoplossingen in aliquots bij-20 ° C totdat het nodig is. - Instellen van de microcentrifuge bij 4-7 ° C.
2. monstervoorbereiding voordat fluorescerende incubatie
Opmerking: Zachte behandeling van spermatozoïden is wenselijk wanneer pipetting en resuspending.
- Als u werkt met cryopreserved cellen, voorbereiden op een waterbad ontdooien bij 40 ° C voor Solea senegalensis spermacellen10. Dompel de stro monsters in het waterbad voor 7 s.
- Met behulp van schaar te knippen, het leegmaken van het monster in een microfuge buis samen en centrifugeer bij 1000 x g, 4-7 ° C gedurende 1 minuut.
- Rudimentaire plasma of rudimentaire plasma met cryoprotectant uit het cryopreserved monster verwijderen door pipetteren om te negeren van elke component die met het protocol van de kleuring interfereren kan.
- Resuspendeer de cellen in de 50-100 μl van 4 ° C 200 mOsm/kg Ringer-oplossing.
- Bepaal de concentratie sperma met een Neubauer of een soortgelijk tellen kamer onder een stereoscopische Microscoop.
- Verdun de celsuspensie van 1-2 x 106 cellen/mL in een eindvolume van 0,5 mL in 4 ° C Ringer-oplossing.
3. fluorescerende incubatie
Opmerking: Fluorochromes moet worden omgegaan in omstandigheden met weinig licht, vooral wanneer in oplossing.
- Toevoegen van 3.125 μL van DCFH-DA-stockoplossing (eindconcentratie in de steekproef: 25 μM) tot de werkverdunning monster. Incubeer bij 4-7 ° C gedurende 40 min. in duisternis10.
- Na 30 min, Voeg 0,5 μL van de DAPI-stockoplossing (eindconcentratie in de steekproef: 2 μM) en 0,5 μL van de mitochondriën vlek stockoplossing (eindconcentratie in de steekproef: 100 nM) aan het monster. Incubeer beide fluorochromes gedurende 10 minuten in de duisternis.
4. monstervoorbereiding voor confocale microscopie
- Centrifugeer de celsuspensie bij 1000 x g, 4-7 ° C gedurende 1 minuut na de incubatietijd.
- Verwijder het supernatant zorgvuldig door pipetteren.
- Het toevoegen van een 10-20 μL van 200 mOsm/kg Ringer-oplossing.
- Plaats 5 μl van een geconcentreerde celsuspensie op een dia neerzet.
- Zorgvuldig, zet een deksel dia over de voorbereiding en zegel met lak. Zodra de Poolse droog is, is de voorbereiding is klaar voor confocale microscopie.
5. confocal Setup voorafgaand aan het Experiment
Opmerking: Afhankelijk van de Microscoop, DCFH-DA kon worden "verbrand". Eerst bij het vaststellen van de beste voorwaarden met een niet-waardevolle steekproef.
- Inschakelen van de Microscoop, lasers, camera en de computer met de Microscoop.
- Excitatie lasers, rekening houdend met de excitatie en emissie-maxima voor elke fluorescerende instellen
- Gebruik voor de DAPI, een maximum van de excitatie van 358 nm en een maximum emissie van 465 nm.
- Gebruik voor de mitochondriale vlek, een maximum van de excitatie van 644 nm en een maximum emissie van 662 nm.
- Voor DCFH-DA, gebruiken een excitatie maximaal 504 nm en een maximum emissie van 525 nm.
- Aan de slag met 25 X doelstelling te richten op de spermacellen. Kies de DAPI kanaal te richten omdat deze fluorescerende de hoogste intensiteit rapporteert. Zodra de cellen zijn gericht, gebruik een 63 X of 100 X doelstelling voor een grondige evaluatie omdat Solea senegalensis spermacellen grootte ongeveer 2 μm is.
- Voor elk kanaal door het gaatje, de winst en de spanning te optimaliseren. Aanpassen op dezelfde manier, de digitale offset ter vermindering van de achtergrond. Zodra alle parameters zijn geoptimaliseerd voor de fluorescerende gebruikt, moet u de instellingen opslaan. Voor een routine experiment voor een enkele zaadcel Solea senegalensis gebruikten we de volgende (deze parameters kunnen veranderen in elk experiment): gaatje van 1 en de spanning van de winst van 750 V.
6. verwerving van beelden
- Selecteer de gewenste kwaliteit criteria voor de verwerving van de afbeelding. Overname-instellingen zoals bitdiepte, beeldformaat, lichte plaatdikte definiëren en kies één dubbelzijdige verlichting. Voor een routine experiment voor een enkele Solea senegalensis spermacellen gebruikten we de volgende (deze parameters kunnen veranderen in elk experiment): framegrootte van 1024 px; bits per pixel van 16; Scansnelheid voor 2-4).
- Open en centreer het scangebied om te beginnen en een afbeelding van het veld.
- Met behulp van het gereedschap Uitsnijden, selecteer de regio van belang en druk leven.
- Aanpassen met behulp van het hulpprogramma bereik indicator, de digitale offset ter vermindering van de achtergrond. Doe dit voor elk kanaal en het beeld te nemen.
- Controleer de kwaliteit van de afzonderlijke kanalen voor elke fluorescerende en combinaties daarvan.
7. het maken van een 3D-beeld-Video
- Z-stack overname-instellingen.
- Kies de optie van de Z-stack in de software.
- Selecteer een enkele cel, de groep cellen of de regio van belang en richten.
- Scheiden van de Z-stapel met de opties 'Eerste segment' en 'Laatste Slice' en de z-stap interval tot 0,2 µm met behulp van de fijne focus te zetten. Kies DAPI kanaal te richten omdat deze fluorescerende de hoogste intensiteit melden kan en u gemakkelijk het hele hoofd van de spermacellen kunt. Kies de optimale overname parameters voor elk kanaal en voer het experiment uit.
- Voer het experiment Z-stack. De kanalen splitsen en observeren van de lokalisatie van elk signaal binnen de cellen.
- Z-stapel proces.
- Volume render: zodra het experiment is voltooid, selecteert u de opties van de Z-stapel verwerking software en kies het volume renderen optie. Selecteer het aantal stappen en de rotatie graden (360°). Sla het bestand met de extensie video.
- Stereo anaglyph: Kies stereo anaglyph in de opties proces venster. Deze tool laat maken van een 3D-beeld video met kanalen splitsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Confocale microscopie is een ideale methode voor intracellulaire ROS beoordeling in teleost sperma. De combinatie van de drie fluorochromes (DAPI mitochondriën vlek en een DCFH-DA) gepresenteerd in deze studie (Figuur 1) biedt veel nuttige informatie die kan worden toegepast bij het basisonderzoek en kan hebben toepassingen in de verbetering van de methoden die worden toegepast in industriële aquacultuur planten, zoals cryopreservatie protocollen. Verschillende soorten analyse kunnen worden uitgevoerd om te correleren intracellulaire ROS aanwezigheid en andere parameters: beweeglijkheid, de levensvatbaarheid, de verschillende patronen tussen goede en slechte fokkers, activering van beweeglijkheid of seizoensgebonden sperma variaties onder vele anderen. In het huidige werk, twee verschillende patronen van intracellulaire H2O2 verdeling binnen de spermacellen staan: collocated met mitochondrion of spread in de kern (figuren 2, 3). Deze spermacellen tonen lage potentiële schade geproduceerd door ROS toonde DCFH-DA etikettering alleen in de mitochondriën overwegende dat degenen die DNA schade lijdt hebben aangetoond DCFH-DA etikettering ook in de kernen. Confocale microscopie software kunt maken van handige video's en bieden gemakkelijke en snelle colocalization grafieken.
Figuur 1 . Algemeen overzicht van het protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Voorbeeld van de confocal Beeldacquisitie. A. regeling van het monster B. DAPI kanaal (etikettering dsDNA). C. Mitochondria vlek kanaal (etikettering mitochondrion). D. Mitochondriën vlek kanaal samengevoegd met DAPI kanaal. E. DCFA-DH kanaal (etikettering intracellulaire H2O2). F. DCFA-DH kanaal samengevoegd met DAPI kanaal. G. samenvoeging van de drie kanalen. Afkortingen: n: kernen, mt: mitochondriën, f: flagellum en mb: membraan. Schaal bar: 5 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Verschillende patronen van intracellulaire H2O2 in Solea senegalensis spermacellen (Volume render). Resulterende kanalen van spermatozoïden intracellulaire ROS in de nucleaire fossa en mitochondrion (A, C, E) tonen. Resulterende kanalen van spermatozoïden toont intracellulaire H2O2 ook in het kader van de kernen (B, D, F). A en B: DAPI. C en D: DCFH-DA. E en F: Mitochondria vlek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is algemeen bekend dat mitochondriën belangrijke organellen voor de beweeglijkheid van de zaadcellen en functie zijn. Deze organellen zijn gelijktijdig direct betrokken bij de productie van ROS. Interessant, zijn gecontroleerde niveaus van ROS nodig voor goede zaadcellen functie1. Positieve relaties tussen vruchtbaarheid en oxidatieve stress zijn aangetoond in zoogdieren11 maar buitensporige niveaus beïnvloeden sperma kwaliteit12. Een cruciale factor die doorslaggevend kan zijn naar een positief of negatief effect is niet alleen een ROS niveaus, maar ook een ROS intracellulaire lokalisatie. Een van de schadelijke gevolgen van de ROS is het produceren van DNA schade9 en daarom de nucleaire aanwezigheid van ROS zou een indicator van potentiële schade in de kern overwegende dat ROS niveaus zou normaal in de mitochondriën. Het is noodzakelijk ter aanvulling van bestaande kwantitatieve methoden (bijvoorbeeld, stroom cytometry) met technieken zoals confocale microscopie die informatie over de intracellulaire lokalisatie ROS verschaffen kan.
Confocale microscopie is een optimale optie te visualiseren de intracellulaire lokalisatie van ROS. Het gebruik van specifieke fluorochromes zoals een levende mitochondriën vlek en DAPI maakt de visualisatie van de mitochondriën en kern respectievelijk en de combinatie van deze moleculen met DCFH-DA zorgt ervoor dat de intracellulaire lokalisatie van peroxide.
De kritische stappen in het protocol zijn fluorescerende incubatie en confocal setup. Beide stappen moeten worden geoptimaliseerd en zorgvuldig uitgevoerd om reproduceerbare en consistente resultaten te verkrijgen. Methodologie wijzigingen moeten worden uitgevoerd op deze twee niveaus afhankelijk van de rudimentaire plasma gebruikt. Fluorescerende incubatie moet derhalve worden aangepast. Temperaturen en opslagcondities aanzienlijk verschilt de spermastaaltje, en allermeest naar de protocollen zijn geoptimaliseerd voor zoogdieren.
Hier, een protocol voor teleost spermastaaltje, met name voor Solea senegalensis spermacellen, wordt beschreven (Figuur 1). Succesvolle etikettering van kernen- en mitochondriën zijn uitgevoerd met behulp van het protocol beschreven en ROS aanwezigheid heeft geweest onthullen met behulp van DCFH-DA (Figuur 2). Resultaten wijzen erop dat mede lokalisatie H2O2 zijn gevonden in de kernen of mitochondriën afhankelijk van het spermastaaltje (Figuur 3). Zoals eerder uitgelegd zou die monsters met een hoog percentage spermatozoïden weergeven van hoge niveaus van ROS binnen de nucleus naar voren gebogen aan DNA schade. Dit protocol heeft een unieke beperking, de eis van dure apparatuur (confocal microscoop), maar kon er toekomstige nut bij het selecteren van spermastaaltje met lage aanwezigheid van ROS in de kern voor cryopreservatie doeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Dit werk werd financieel ondersteund door AGL201568330 + C2 + 1 + R project (MINECO/FEDER). David G. Valcarce werd gefinancierd door de Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) en Fondo sociale Europeo. Auteurs erkennen Dr. Ana Riaza en Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero en José Ramón Guiérrez. Wij danken ook Paula Fernández Colado voor videografie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
