Summary
Denne protokollen beskriver en detaljert metodikk for å oppdage H2O2 lokalisering i Solea senegalensis spermatozoa bruker en følsom fluorochrome DCFH-DA for ROS, en live mitokondrier flekk for mitokondrier og DAPI for kjerner visualisering, henholdsvis. Protokollen er utformet som skal utføres innen 2 timer med enten friske eller tinte spermatozoa.
Abstract
Oksidativt stress er en av de viktige faktorene i å redusere kvaliteten. Utvikle effektiv protokoller for å oppdage reaktive oksygen arter (ROS) i spermatozoa er av høy betydning noen arter, men disse metodene er sjelden brukt, og enda mindre i teleoster. Kryonisk bevaring er en nyttig teknikk i akvakultur for ulike formål, herunder genet bank og garantert sperm tilgjengelighet gjennom hele året. Frysing/tining prosedyrer kan forårsake ROS produksjon og skade sædceller. Vurderer den potensielle skade som kan et overskudd av ROS produksjon forårsake i spermatozoa avhengig av deres lokalisering, her en detaljert metode til å gjenkjenne H2O2 og evaluere sin intracellulær lokalisering av AC confocal mikroskopi tilbys. For dette formålet, en kombinasjon av 3 fluorochromes (2 ', 7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), en live mitokondrier flekk og 4, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)) brukes til å evaluere den co lokaliseringen av H2O2 med spermatozoa kjerner eller mitokondrier i Solea senegalesis sperm prøver.
Introduction
Reaktive oksygen arter produksjon har vært knyttet til kvaliteten nylig1. Selv om ROS produksjon i mitokondrier kan betraktes som en normal fysiologisk prosess, er oksidativt stress av et overskudd av ROS produksjon en klar årsak til skader i spermatozoa på ulike nivåer. Hos mennesker er oksidativt stress knyttet til mannlig infertilitet, endre motilitet og muligheten til å gjennomgå capacitation2; i pattedyr, har endring av DNA integritet i frossen sæd prøver også vært knyttet til syntese H2O23.
Kryonisk bevaring er en vanlig teknikk for genet i akvakultur. Denne teknologien er spesielt viktig i arter med reproduktive problemer som Solea senegalensis. Dette verdifulle arter i markedet viser reproduktive dysfunksjon i individer født i fangenskap skyldes manglende frieri. Dette faktum gjør sperm kryonisk bevaring må sperm tilgjengelighet for kunstig befruktning. Imidlertid kan kryonisk bevaring være en kilde til oksidativt stress som kan være skadelig for spermatozoa4 som studier har rapportert en gunstig effekt av antioksidant kosttilskudd. ROS hemming gjennom mitokondrie målrettede antioksidant var angivelig gunstig for sæden kryonisk bevaring i gul steinbit5.
Nivåene av ROS i sperm prøver er derfor viktig å vite, særlig etter kryonisk bevaring6,7 fordi disse molekylene har vært anerkjent som en ulempe for sperm overlevelse og fruktbarhet8. Videre kan studerer fordelingen av ROS i cellen være avgjørende å antyde hvilket skader. Som et eksempel, lave nivåer av ROS i mitokondrier kan antas normal og kompatibel med sperm funksjonen, men høye nivåer av ROS i kjernen kan være indikatorer spermatozoa DNA skade. H2O2 er en av de mest relevante ROS som kan frigis fra mitokondrier og trenge kjernen fordi det er en liten og gratis mindre molekyl9. Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) kan spesielt avsløre intracellulær peroxide emitting grønne fluorescens. En detaljert protokoll for å oppdage H2O2 intracellulær lokalisering i Solea senegalensis sæden med AC confocal mikroskopi er presentert i denne artikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Fluorochrome inkubasjon og AC confocal analyse vil ta minst 2-3 h for en kontroll og en behandlet prøve. Behandling er ikke inkludert i denne beregning. Nødvendig materiale kan finnes i Tabell for materiale. Denne protokollen kan brukes friske eller cryopreserved spermatozoa. Solea senegalensis er en fiskeart som gyter i kaldt vann, arbeid alltid under kalde forhold (4-7 ° C). Se figur 1 for en oversikt over protokollen.
1. forarbeidet før eksperimentet
- Forberede en 1 mM mitokondrier flekken lagerløsning i analytisk klasse DMSO.
- Forberede en 1 μg/mL 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) lager løsning i deionisert vann.
- Forberede en 200 mOsm/kg Ringer løsning (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.7)
- Forberede en 4 mM 2′, 7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) lagerløsning i analytisk klasse metanol.
Merk: Hold lager løsninger i dele på 20 ° C til nødvendig. - Angi microcentrifuge på 4-7 ° C.
2. prøven forberedelser før Fluorochrome inkubasjon
Merk: Forsiktig håndtering spermatozoa er ønskelig når pipettering og resuspending.
- Hvis arbeider med cryopreserved celler, forberede et vannbad tining ved 40 ° C i Solea senegalensis spermatozoa10. Fordype halm eksemplene i vannbad for 7 s.
- Ved hjelp av saks til å kutte, tomme prøven inn i et microfuge rør og sentrifuge 1000 x g, 4-7 ° C i 1 minutt.
- Fjerne banebrytende plasma eller banebrytende plasma med cryoprotectants fra cryopreserved eksempel ved pipettering å forkaste alle komponenter som kan forstyrre fargeprotokoll.
- Resuspend cellene i 50-100 μL 4 ° C 200 mOsm/kg Ringer løsning.
- Bestemme sperm konsentrasjonen med en Neubauer eller en lignende telling kammer under stereoskopisk mikroskop.
- Fortynne celle suspensjon opp til 1-2 x 106 celler/mL i et siste volum på 0,5 mL i 4 ° C Ringer løsning.
3. fluorochrome inkubasjon
Merk: Fluorochromes må håndteres i lite lys, spesielt når du er i løsningen.
- Tilsett 3,125 μL av DCFH-DA lagerløsning (siste konsentrasjon i utvalget: 25 μM) å arbeide prøve fortynning. Ruge på 4-7 ° C i 40 minutter i mørket10.
- Etter 30 min, tilsett 0,5 μL av DAPI lager løsningen (siste konsentrasjon i utvalget: 2 μM) og 0,5 μL mitokondrier flekken lagerløsning (siste konsentrasjon i utvalget: 100 nM) til prøven. Inkuber begge fluorochromes i 10 min i mørket.
4. eksempel forberedelse til AC Confocal mikroskopi
- Etter inkubasjon tiden, sentrifuge celle suspensjon på 1000 x g, 4-7 ° C i 1 minutt.
- Kast nedbryting nøye av pipettering.
- Legge til et 10-20 μL 200 mOsm/kg Ringer løsning.
- Sted 5 μL en konsentrert celle suspensjon slipp på et lysbilde.
- Nøye, sette et dekke lysbilde om utarbeidelse og forsegle den med polish. Når polske er tørt, er forberedelsene klar for AC confocal mikroskopi.
5. AC confocal oppsett før eksperimentet
Merk: Avhengig av mikroskopet, DCFH-DA kan være "brent". Opprette de beste forholdene med en ikke-verdifullt prøve først.
- Slå på mikroskopet, lasere, kamera og datamaskinen som kjører mikroskopet.
- Angi eksitasjon lasere som hensyn eksitasjon og utslipp maksimumsgrensene for hver fluorochrome:
- DAPI, bruke en eksitasjon maksimalt 358 nm og et utslipp maksimalt 465 nm.
- Bruk en eksitasjon maksimalt 644 for mitokondrie flekken, nm og et utslipp maksimalt 662 nm.
- DCFH-DA, bruke en eksitasjon maksimalt 504 nm og et utslipp maksimalt 525 nm.
- Begynne å jobbe med 25 X mål å fokusere på spermatozoa. Velg DAPI kanalen fokus fordi denne fluorochrome rapporterer høyest intensiteten. Når cellene er fokusert, bruke en 63 X eller 100 X målet for en grundig evaluering fordi Solea senegalensis spermatozoa er rundt 2 μm.
- For hver kanal, kan du optimere hullet, gevinst og spenning. På samme måte, kan du justere digital forskyvningen for å redusere bakgrunnen. Når alle parametere som er optimalisert for fluorochrome brukes, kan du lagre innstillingene. For en rutinemessig eksperiment for en enkelt Solea senegalensis sperm celle vi brukte følgende (disse parametrene kan endre i hvert eksperiment): pinhole 1 og gevinst spenningen på 750 V.
6. oppkjøpet av bilder
- Velg ønsket kvalitet betingelsene for bilde oppkjøpet. Oppkjøpet innstillinger som bitdybde, bildeformat, lys platetykkelse, og velg én sidede belysning. For en rutinemessig eksperiment for en enkelt Solea senegalensis spermatozoa vi brukte følgende (disse parametrene kan endre i hvert eksperiment): ramme størrelsen på 1024 px; biter per piksel 16; skanning fart av 2-4).
- Åpne og Midtstill skanneområdet å begynne og ta et bilde av feltet.
- Bruker beskjæringsverktøyet, Velg regionen rundt og trykk live.
- Justere forskyvningen av digital for å redusere bakgrunnen ved hjelp av verktøyet området indikator. Gjør dette for hver kanal og ta bildet.
- Sjekk kvaliteten på enkeltkanalene for hver fluorochrome og kombinasjoner.
7. opprette en 3D-bildet Video
- Z-stack oppkjøpet innstillinger.
- Velge Z stabel i programvaren.
- Velg enkelt cellen, cellegruppen eller området rundt og fokusere den.
- Avgrens Z-stabelen med 'Første sektor' og "Siste stykket" og etablere z trinnet til intervall til 0,2 µm ved hjelp av finskruen. Velg DAPI kanal å fokusere fordi denne fluorochrome kan rapportere høyeste intensiteten og du kan enkelt velge hele spermatozoa hodet. Velg optimal oppkjøpet parameterne for hver kanal og utføre eksperimentet.
- Kjør Z stabel eksperimentet. Delt kanalene og observere lokaliseringen av hver signal i cellene.
- Z-stack prosessen.
- Volum render: Når forsøket er ferdig, Velg alternativene behandlingsprogramvaren Z stabel og velg volumet gjengi alternativet. Velg antall trinn og rotasjon grader (360°). Lagre filen med filtypen video.
- Stereo anaglyph: Velg stereo anaglyph i alternativene process-vinduet. Dette verktøyet lar deg lage et 3D-bilde video med delt kanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AC confocal mikroskopi er en ideell måte intracellulær ROS evaluering i teleost sperm. Kombinasjonen av de tre fluorochromes (DAPI, mitokondrier flekken og DCFH-DA) presenteres i denne studien (figur 1) gir mange nyttige opplysninger som kan brukes i grunnforskning og kan ha programmer i å forbedre prosedyrer brukes i industriell oppdrett planter, for eksempel kryonisk bevaring protokoller. Ulike typer analyse kan gjennomføres for å koordinere intracellulær ROS tilstedeværelse og andre parametere: motilitet, levedyktighet, ulike mønstre mellom gode og dårlige oppdretter, aktivering av motilitet eller sesongmessige sperm variasjoner blant mange andre. Den nåværende arbeidet, to ulike mønstre av intracellulær H2O2 distribusjon innen spermatozoa vises: samlokalisert med mitokondrie eller oppslag i kjernen (tall 2, 3). Disse spermatozoa viser lav skader produsert av ROS viste DCFH-DA merking i mitokondrier mens de lider DNA skade viste DCFH-DA merking også i kjerner. AC confocal mikroskopi programvare til å opprette nyttige videoer og gir enkel og rask colocalization grafer.
Figur 1 . Generell oversikt over protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Eksempel på AC confocal bildeopptak. A. ordningen med prøven B. DAPI kanal (merking dsDNA). C. mitokondrier flekken kanal (merking mitokondrie). D. Mitokondrier flekken kanal sammen med DAPI kanal. E. DCFA-DH kanal (merking intracellulær H2O2). F. DCFA-DH kanal sammen med DAPI kanal. G. sammen av de tre kanalene. Forkortelser: n: kjerner, mt: mitokondrier, f: flagell og mb: membranen. Skala bar: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Ulike mønstre av intracellulær H2O2 i Solea senegalensis spermatozoa (volum gjengivelse). Resulterende kanaler spermatozoa viser intracellulær ROS i kjernefysiske fossa og mitokondrie (A, C, E). Resulterende kanaler spermatozoa viser intracellulær H2O2 også innen kjerner (B, D, F). A og B: DAPI. C og D: DCFH-DA. E og F: mitokondrier flekken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er velkjent at mitokondrier er viktige organelles for Spermiemotilitet og funksjon. Disse organeller er samtidig direkte involvert i ROS produksjon. Interessant, er kontrollert nivåer av ROS nødvendig for riktig sæd funksjon1. Positive relasjoner mellom fruktbarhet og oksidativt stress har blitt vist i pattedyr11 men overdreven nivåer påvirke sperm kvalitet12. En viktig faktor som kunne være avgjørende mot en positiv eller negativ effekt er ikke bare ROS nivåer, men også ROS intracellulær lokalisering. En av de skadelige virkningene av ROS produserer DNA skade9 og derfor kjernefysiske tilstedeværelsen av ROS kan være en indikator for mulig skade i kjernen mens ROS nivåer kan være normalt i mitokondrier. Er det nødvendig å supplere eksisterende kvantitative metoder (f.eks, flowcytometri) med teknikker som AC confocal mikroskopi som kan gi informasjon om ROS intracellulær lokalisering.
AC confocal mikroskopi er en optimal alternativ å visualisere den intracellulære lokaliseringen av ROS. Bruk av spesifikke fluorochromes som live mitokondrier flekken og DAPI tillater visualisering av mitokondrier og nucleus henholdsvis og kombinasjonen av disse molekyler med DCFH-DA lar den intracellulære lokaliseringen av peroxide.
De avgjørende skritt i protokollen er fluorochrome inkubasjon og AC confocal oppsett. Begge trinnene bør være optimalisert og nøye utført få reproduserbare og konsekvent resultater. Metodikk endringer skal utføres på disse to avhengig av banebrytende plasma brukes. Derfor bør fluorochrome inkubasjon være tilpasset. Temperaturer og lagringsforhold vesentlig forskjellige blant sperm prøver, og de fleste protokollene som er optimalisert for pattedyr.
Her, en protokoll for teleost sperm prøver, spesielt for Solea senegalensis spermatozoa, er beskrevet (figur 1). Vellykket merking av kjerner og mitokondrier er utført ved hjelp av beskrevet protokollen og ROS tilstedeværelse har blitt avsløre bruker DCFH-DA (figur 2). Resultatene tyder på at co lokalisering av H2O2 har blitt funnet i kjerner eller mitokondrier avhengig av sæd prøven (Figur 3). Som tidligere forklart, ville de prøvene med en høy andel av spermatozoa viser høye nivåer av ROS i kjernen være tilbøyelig til DNA skade. Denne protokollen har en unik begrensning, kravet om dyrt utstyr (AC confocal mikroskop), men det kunne ha fremtidige verktøy i å velge sperm prøver med lav forekomst av ROS i kjernen til kryonisk bevaring formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker AQUAGAMETE FA 1205 pris handling. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av AGL201568330-C2-1-R prosjektet (MINECO/FEDER). David G. Valcarce ble finansiert av Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) og Fondo sosiale Europeo. Forfatterne bekrefter Dr. Ana Riaza og Stolt havet Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero og José Ramón Guiérrez. Vi takker også Paula Fernández Colado for videography.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
