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Developmental Biology

Solea Senegalensis精子中活性氧的细胞内定位评价

Published: March 11, 2018 doi: 10.3791/55323
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Molecular Biology, University of León, 2INDEGSAL, University of León, 3Planta de Cultivos el Bocal, Spanish Institute of Oceanography (IEO)

Summary

此协议描述了一个用于检测Solea senegalensis精子中的 H2O2本地化的详细方法, 使用敏感的 fluorochrome DCFH-DA 为 ROS、线粒体的活线粒体染色和细胞核的 DAPI可视化, 分别。该协议的设计是在2小时内进行, 无论是新鲜或解冻精子。

Abstract

氧化应激是降低精子质量的重要因素之一。开发有效的检测精子中活性氧 (ROS) 的协议在任何物种中都是非常重要的, 但是这些方法在硬骨鱼类中很少使用, 甚至更少。冷冻保存是水产养殖的一种有用的技术, 为不同的目的, 包括基因银行和保证精子的可用性全年。冷冻/解冻程序可能导致 ROS 的产生和损伤精子细胞。考虑到过量的 ROS 生产可能导致精子的潜在损害取决于它们的定位, 这里有一个详细的方法来检测 H2O2和评估其细胞内定位的共焦显微镜提供。为此, 采用3荧光 (-2′-、7′-Dichlorodihydrofluorescein 双乙酸 (DCFH DA)、活线粒体染色和4′-、6-Diamidino-2-苯基吲哚二盐酸盐 (DAPI)) 来评价H2 O 2 的协同定位与精子细胞核或线粒体在Solea senegalesis精子样本。

Introduction

活性氧种类的生产已与精子质量最近的1。虽然线粒体中的 ros 生产可以被认为是正常的生理过程, 但氧化应激是由过量的 ros 产生的, 是导致精子在不同水平上损伤的明显原因。在人类中, 氧化应激与男性不育、改变运动和接受精子2的能力有关;在哺乳动物中, 冷冻精子样品中 DNA 完整性的变化也与 H2O23的合成有关。

冷冻保存是水产养殖中的一种常用的基因银行技术。这种技术在具有生殖问题 (如Solea senegalensis) 的物种中尤为重要。这个市场上有价值的物种显示, 由于缺乏求爱, 在圈养的个体中繁殖功能失调。这一事实使精子的超低温保存必须有精子可用性的人工受精。然而, 冷冻保存可能是氧化应激的来源, 可能是有害的精子4 , 因为研究报告了有益的效果, 补充抗氧化剂。据报道, 通过线粒体靶向抗氧化剂的活性氧抑制有助于黄鲶鱼的精子超低温保存5。

因此, 精子样本中 ROS 的含量是很重要的, 特别是在保存6、7之后, 因为这些分子被认为是精子生存和生育能力8的一个缺点。此外, 研究细胞中 ROS 的分布对于推断潜在损伤的程度是至关重要的。例如, 线粒体中的低活性氧能被认为是正常的, 与精子功能相容, 但细胞核内的高活性氧含量可能是精子 DNA 损伤的指标。H2O2是最相关的 ROS 之一, 可以从线粒体中释放出来, 穿透细胞核, 因为它是一个小而无电荷的分子9。Dichlorofluorescein 双乙酸 (DCFH) 可以明确揭示胞内过氧化物发光的绿色荧光。本文介绍了用共聚焦显微镜检测Solea senegalensis精子中 H2O2细胞内定位的详细协议。

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Protocol

注: Fluorochrome 孵化和共焦分析将采取至少2-3 小时的控制和治疗样品。在这个时间计算中不包括数据处理。所需材料可在材料表中找到。本协议可应用于新鲜或冷冻保存的精子。Solea senegalensis是一种在冷水中产生的鱼类, 通常在寒冷的环境下工作 (4-7 摄氏度)。有关协议的一般视图, 请参见图 1 。

1. 实验前的准备工作

  1. 在分析级二甲基亚砜上制备1毫米线粒体染色液。
  2. 在去离子水中制备1微克/毫升 4′-, 6-diamidino 2-苯基吲哚盐酸盐 (DAPI) 溶液。
  3. 准备一个 200 mOsm/千克响铃解决方案 (116 毫米氯化钠, 2.9 毫米氯化钾, 1.8 毫米 CaCl2, 5 毫米 HEPES, pH 7.7)
  4. 在分析级甲醇上制备4毫米-2′-、7′-dichlorodihydrofluorescein 双乙酸 (DCFH DA) 溶液。
    注: 保持库存解决方案在整除数-20 摄氏度, 直到需要。
  5. 将离心设置为4-7 摄氏度。

2. Fluorochrome 孵化前的样品准备

注意: 当吹打和 resuspending 时, 对精子的温和处理是可取的。

  1. 如果使用保存的细胞, 准备一个水浴为解冻在40°c 为Solea senegalensis精子10。将秸秆样品浸入水浴中7秒。
  2. 使用剪刀切割, 把样品空成一个离心管, 离心机在 1000 x g, 4-7 摄氏度为1分钟。
  3. 用吹打从冷冻保存的样品中取出精浆或精浆冷冻保护剂, 丢弃任何可能干扰染色协议的成分。
  4. 并用重悬细胞在 50-100 ul 4 °c 200 mOsm/公斤响铃解决方案。
  5. 用 Neubauer 或类似的计数室在立体显微镜下测定精子浓度。
  6. 将细胞悬浮液稀释至 1-2 x 106细胞/mL, 在4摄氏度的溶液中最终体积为0.5 毫升。

3. Fluorochrome 孵化

注: 荧光必须在低光照条件下处理, 特别是在溶液中。

  1. 添加 3.125 ul DCFH-DA 股票溶液 (最后浓度在样品:25 微米) 到工作样品稀释。在黑暗中孵化4-7 摄氏度40分钟 (10。
  2. 在30分钟以后, 增加 0.5 ul DAPI 存货解答 (最后的集中在样品: 2 微米) 和 0.5 ul 线粒体污点存货解答 (最后的集中在样品: 100 毫微米) 对样品。在黑暗中孵化两荧光10分钟。

4. 共焦显微术的样品准备

  1. 潜伏期后, 离心机的细胞悬浮在 1000 x g, 4-7 摄氏度为1分钟。
  2. 吹打小心地丢弃上清。
  3. 添加 10-20 ul 的 200 mOsm/公斤的铃声解决方案。
  4. 放置 5 ul 的浓缩细胞悬浮下降在幻灯片上。
  5. 小心, 把封面幻灯片上的准备, 并密封它与波兰。一旦波兰人干了, 准备准备为共焦显微镜。

5. 实验前共聚焦设置

注: 根据显微镜, DCFH 可能被 "烧伤"。先用非贵重样品建立最佳条件。

  1. 打开显微镜、激光、照相机和运行显微镜的电脑。
  2. 设置励磁激光器, 考虑到每个 fluorochrome 的激发和发射最大度:
    1. 对于 DAPI, 使用的激发最大值为 358 nm, 发射最大值为 465 nm。
    2. 对于线粒体染色, 使用最多 644 nm 的激发和发射最大值为 662 nm。
    3. 对于 DCFH, 使用的激发最大值为 504 nm, 发射最大值为 525 nm。
  3. 开始使用25X 目标, 专注于精子。选择要集中的 DAPI 通道, 因为此 fluorochrome 报告的强度最高。一旦单元格集中, 请使用63X 或100X 目标进行彻底评估, 因为Solea senegalensis精子大小约为2微米。
  4. 对于每个通道, 优化针孔, 增益和电压。同样地, 调整数字偏移量以减少背景。为所使用的 fluorochrome 优化所有参数后, 保存设置。对于单个Solea senegalensis精子细胞的常规实验, 我们使用了以下方法 (这些参数可能会在每个实验中发生变化): 针孔1和增益电压 750 v。

6. 图像的采集

  1. 为图像获取选择所需的质量条件。定义采集设置, 如钻头深度, 图像格式, 光片厚度, 并选择单面照明。对于单个Solea senegalensis精子的常规实验, 我们使用了以下方法 (这些参数可能在每个实验中发生变化): 1024年像素的帧大小;位每像素 16;扫描速度为 2-4)。
  2. 打开并居中扫描区域以开始并采取该字段的图像。
  3. 使用裁剪工具, 选择感兴趣的区域并按 "实时"。
  4. 在 "范围指示器" 工具的帮助下, 调整数字偏移量以减少背景。为每个通道执行此项, 并采取该图像。
  5. 检查每个 fluorochrome 及其组合的各个通道的质量。

7. 创建3D 图像视频

  1. Z 堆栈捕获设置。
    1. 在软件中选择 Z 堆栈选项。
    2. 选择单个单元格、一组单元格或感兴趣的区域并将其聚焦。
    3. 使用 "第一个切片" 和 "最后一个切片" 选项分隔 z 堆栈, 并在精细焦点的帮助下, 将 z 步骤设置为间隔为0.2 µm。选择 DAPI 频道集中, 因为这 fluorochrome 可能报告的最高强度, 你可以很容易地选择整个精子头。选择每个通道的最佳采集参数并运行实验。
  2. 运行 Z 堆栈实验。拆分通道并观察单元格内每个信号的定位。
  3. Z 堆栈过程。
    1. 卷渲染: 实验完成后, 选择 Z 堆栈处理软件的选项, 然后选择 "音量渲染" 选项。选择步骤数和旋转度数 (360°)。使用视频扩展名保存文件。
    2. 立体声浮雕: 在 "选项" 过程窗口中选择 "立体声浮雕"。此工具允许使用分割通道创建3D 图像视频。

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Representative Results

共焦显微术是硬骨鱼类精子细胞内 ROS 评价的理想方法。这项研究 (图 1) 中提出的三荧光 (DAPI、线粒体染色和 DCFH) 的组合提供了许多有用的信息, 可应用于基础研究, 并可应用于改进工业水产养殖植物, 如冷冻保存协议。可以进行不同类型的分析, 以关联细胞内 ROS 的存在和其他参数: 运动, 生存能力, 不同模式之间的良好和不良育种, 活化运动或季节性精子变化之间的许多其他。在目前的工作中, 两种不同模式的胞内 H2O2分布在精子内显示: 与线粒体或扩散在细胞核 (图 2, 3)。这些精子显示, ROS 产生的潜在损害很低显示 DCFH 仅在线粒体, 而那些遭受 DNA 损伤的人也显示 DCFH 的标签也在细胞核。共焦显微软件允许创建有用的视频和提供简单快速的定位图。

Figure 1
图 1.议定书的一般概览.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.共焦图像采集示例.示例B的A.方案DAPI 通道 (标签 dsDNA)。C.线粒体染色通道 (标记线粒体)。与 DAPI 通道合并的D.线粒体染色通道。E. DCFA-DH 通道 (标记胞内 H2O2)。F. DCFA 通道与 DAPI 通道合并。G.合并三通道。缩写: n: 核, mt: 线粒体, f: 鞭毛和mb: 膜。刻度条: 5 微米。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.不同模式的胞内 H2O2 在 Solea senegalensis 精子 (卷渲染).结果显示细胞核窝和线粒体中胞内 ROS 的精子通道 (A、C、E)。产生的精子通道显示胞内 H2O2也在原子核内 (B, D, F)。A和B: DAPI。C和D: DCFH。E和F: 线粒体着色。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

众所周知, 线粒体是精子运动和功能的关键细胞器。这些细胞器同时直接参与 ROS 的生产。有趣的是, 适当的精子功能需要控制的活性氧含量为1。在哺乳动物中, 生育率和氧化应激之间的正相关关系已显示在11中, 但过度的水平影响精子质量12。一个关键的因素, 可能是决定性的积极或消极的影响, 不仅是 ros 水平, 而且 ros 细胞内定位。ros 的有害影响之一是产生 DNA 损伤9 , 因此 ros 的核存在可能是核的潜在损伤的指示, 而 ros 水平可能是正常的线粒体。有必要补充现有的定量方法 (例如, 流式细胞术), 技术, 如共焦显微镜, 可以提供有关 ROS 细胞内定位的信息。

共焦显微术是可视化 ROS 细胞内定位的最佳选择。使用特定的荧光, 如活线粒体染色和 DAPI, 使线粒体和细胞核的可视化, 这些分子与 DCFH 的结合, 使过氧化物的细胞内定位。

协议中的关键步骤是 fluorochrome 孵化和共聚焦设置。这两个步骤都应进行优化和仔细执行, 以获得可重现和一致的结果。应根据所用的精浆, 在这两个层次上进行方法学的修改。因此, 应适应 fluorochrome 孵化。在精子样本中, 温度和贮存条件显著不同, 大多数的协议都是针对哺乳动物进行优化的。

在这里, 描述了一个硬骨鱼类精子样本的协议, 特别是对于Solea senegalensis 精子的方法(图 1)。使用描述的协议对细胞核和线粒体进行了成功的标记, 并使用 DCFH (图 2) 揭示了 ROS 的存在。结果表明, 根据精子样本 (图 3), 在细胞核或线粒体中发现了 H2O2的联合定位。如前所述, 那些在细胞核内显示高浓度 ROS 的精子的样本很容易发生 DNA 损伤。该协议具有独特的局限性, 昂贵的设备 (共焦显微镜) 的要求, 但它可能有未来的效用, 选择低存在的活性氧在细胞核内为超低温保存目的。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢 AQUAGAMETE 1205 的成本行动。这项工作得到了 AGL201568330-C2-1-R 项目 (MINECO/菲德) 的财政支持。大卫 g. Valcarce 由 EDU1084/2012 和 Fondo 社会 Europeo 资助。作者承认安娜 Riaza 博士和 Stolt 海洋农场, Paulino 博士, 拉巴斯博士蒙特罗和何塞拉蒙 Guiérrez。我们还感谢宝拉. 费尔南德斯. Colado 为录像。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)  Sigma-Aldrich D6883
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)  Sigma-Aldrich D9542
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 
Confocal Microscopy Zeiss LSM800
Cover slips Thermo Fisher Scientific 12-541B
DMSO, Analytical Grade Sigma-Aldrich W387520
HEPES Sigma-Aldrich H3375
KCl Sigma-Aldrich P9541
Methanol, Analytical Grade Sigma-Aldrich 34860
MitoTrackerDeep Red  Thermo Fisher Scientific M22426
Microcentrifuge (refrigerated) Thermo Fisher Scientific 75002441
NaCl Sigma-Aldrich S7653 
Neubauerchamber Sigma-Aldrich BR717810
Slides Thermo Fisher Scientific 10143562BEF

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References

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发育生物学 问题 133 Solea Senegalensis 精子 线粒体 超低温保存 线粒体染色 DCFH-DA DAPI 共焦显微术
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Valcarce, D. G., Robles, V.… More

Valcarce, D. G., Robles, V. Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa. J. Vis. Exp. (133), e55323, doi:10.3791/55323 (2018).

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