Summary
Det här protokollet beskriver en detaljerad metod för att upptäcka H2O2 lokalisering inom Solea senegalensis spermier med en känslig fluorokrom DCFH-DA för ROS, en levande mitokondrier fläcken för mitokondrier och DAPI för kärnor visualisering, respektive. Protokollet är avsett att utföras inom 2 h med antingen färska eller tinade spermier.
Abstract
Oxidativ stress är en av de viktigaste faktorerna för minskar spermiernas kvalitet. Utveckla effektiva protokoll för att upptäcka reaktiva syreradikaler (ROS) i spermier är av stor betydelse i alla arter, men dessa metoder är används sällan och ännu mindre i benfisk. Frysförvaring är en användbar teknik i vattenbruk för olika ändamål, inklusive gen bank och garanterad spermier tillgänglighet under hela året. Frysning/upptining förfaranden kan orsaka ROS produktion och skada spermacellerna. Med tanke på den potentiella skada som kan ett överskott av ROS produktion orsaka i spermatozoa beroende på deras localization, här en detaljerad metod att upptäcka H2O2 och utvärdera dess intracellulära lokalisering av konfokalmikroskopi tillhandahålls. För detta ändamål används en kombination av 3 fluorokromer (2′, 7-Dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA), en levande mitokondrier fläcken och 4′, 6-diamidin-2-fenylindol dihydroklorid (DAPI)) att utvärdera samtidig localizationen av H2O2 med spermier kärnor eller mitokondrier i Solea senegalesis spermier prover.
Introduction
Reaktivt syre arter produktionen har kopplats till spermiekvalitet nyligen1. Även om ROS produktion i mitokondrier kan anses vara en normal fysiologisk process, är oxidativ stress av ett överskott av ROS produktion en tydlig orsak till skador i spermier på olika nivåer. I människor associeras oxidativ stress med manlig infertilitet, förändra motilitet och en förmåga att genomgå capacitation2; hos däggdjur, har förändring av DNA integritet i frysta spermier prover varit också relaterade till syntesen av H2O23.
Frysförvaring är en vanlig teknik för gen banking i vattenbruk. Denna teknik är särskilt viktigt för arter med reproduktiva problem såsom Solea senegalensis. Denna värdefulla arter på marknaden visar reproduktiv dysfunktion i individer födda i fångenskap på grund av uppvaktning. Detta faktum gör spermier frysförvaring nödvändigt att ha spermier tillgänglighet för konstgjord befruktning. Frysförvaring kan dock en källa till oxidativ stress som kan vara skadliga för spermier4 som studier har rapporterat en gynnsam effekt av antioxidant tillskott. ROS hämning genom mitokondrie-riktade antioxidant var enligt uppgift fördelaktigt för Frysförvaring av spermier i gula havskatt5.
Nivåerna av ROS i spermier prover är därför viktigt att veta, särskilt efter frysförvaring6,7 eftersom dessa molekyler har erkänts som en nackdel för spermier överlevnad och fertilitet8. Dessutom kan det vara avgörande att härleda potentiella skadenivå studerar fördelningen av ROS i cellen. Som ett exempel, låga nivåer av ROS i mitokondrierna kunde antas normalt och kompatibel med spermier-funktionen, men höga nivåer av ROS inom kärnan kan vara indikatorer på spermier DNA-skador. H2O2 är en av de mest relevanta ROS som kunde frigöras från mitokondrierna och penetrera kärnan eftersom det är en liten och kostnad-mindre molekyl9. Dichlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) kan specifikt avslöja intracellulära peroxid avger grön fluorescens. I den här artikeln presenteras ett detaljerat protokoll för att upptäcka H2O2 intracellulära lokalisering i Solea senegalensis spermier med konfokalmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Fluorokrom inkubation och confocal analys tar minst 2-3 h för en kontroll och en behandlade provet. Behandling av uppgifter ingår inte i denna tidberäkning. Nödvändigt material kan hittas i Tabellen för material. Detta protokoll kan tillämpas på färskt eller nedfrysta spermier. Solea senegalensis är en fisk som leker i kallt vatten, arbete alltid under kalla förhållanden (4-7 ° C). Se figur 1 för en allmän bild av protokollet.
1. förberedande arbete innan experimentet
- Förbereda en 1 mM mitokondrier fläcken stamlösning i analyskvalitet DMSO.
- Förbereda en 1 μg/mL 4′, 6-diamidin-2-fenylindol dihydroklorid (DAPI) stamlösning i avjoniserat vatten.
- Bered en 200 mOsm/kg ringsignalen (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,7)
- Förbereda en 4 mM 2′, 7-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) stamlösning i analyskvalitet metanol.
Obs: Tänk på stamlösningar i alikvoter vid-20 ° C tills den behövs. - Ställ in mikrocentrifug på 4-7 ° C.
2. provberedning före fluorokrom inkubation
Obs: Varsam hantering av spermier är önskvärd vid pipettering och omblandning.
- Om arbetar med frysförvarade celler, Förbered ett vattenbad för upptining vid 40 ° C för Solea senegalensis spermier10. Sänk ner halmen proverna i vattenbad för 7 s.
- Klipper med sax, Töm provet i ett mikrofugrör och centrifugera vid 1000 x g, 4-7 ° C i 1 min.
- Ta bort seminalplasma eller seminalplasma med cryoprotectants från frysförvarade provet genom pipettering om du vill ignorera någon komponent som kan störa färgning protokollet.
- Att resuspendera cellerna i 50-100 μL av 4 ° C 200 mOsm/kg Ringer lösning.
- Bestämma spermiekoncentration med en Neubauer eller en liknande inventering kammare under en stereoskopisk Mikroskop.
- Späd cellsuspensionen upp till 1-2 x 106 celler/mL i en slutlig volym om 0,5 mL i 4 ° C Ringer lösning.
3. fluorokrom inkubation
Obs: Fluorokromer måste hanteras i svagt ljus, särskilt när i lösning.
- Tillsätt 3.125 μL av DCFH-DA stamlösning (slutliga koncentrationen i provet: 25 μM) till provet arbetsutspädningen. Inkubera vid 4-7 ° C i 40 min i mörker10.
- Efter 30 min, tillsätt 0,5 μL DAPI stamlösning (slutliga koncentrationen i provet: 2 μM) och 0,5 μL av mitokondrier fläcken stamlösning (slutliga koncentrationen i provet: 100 nM) till provet. Inkubera båda fluorokromer i 10 min i mörker.
4. prov förberedelse för konfokalmikroskopi
- Efter inkubationstiden, Centrifugera cellsuspension på 1000 x g, 4-7 ° C i 1 min.
- Kassera supernatanten noggrant genom pipettering.
- Lägga till en 10-20 μL av 200 mOsm/kg Ringer lösning.
- Placera 5 μL av en koncentrerad cellsuspension släpp på en bild.
- Lägg en cover bild på preparatet försiktigt, och försegla det med polska. När polskt är torr, är beredningen redo för konfokalmikroskopi.
5. confocal Setup innan experimentet
Obs: Beroende på mikroskopet, DCFH-DA kunde ”brännas”. Skapa de bästa förutsättningarna med ett icke-värdefull prov först.
- Slå på mikroskopet, lasrar, kameran och datorn som kör mikroskopet.
- Ange excitation lasrar med hänsyn till den excitation och utsläpp maximala storleken av varje fluorokrom:
- För DAPI, använda en magnetisering högst 358 nm och ett utsläpp på högst 465 nm.
- För mitokondriell fläcken, använda en magnetisering högst 644 nm och ett utsläpp på högst 662 nm.
- För DCFH-DA, använda en magnetisering högst 504 nm och ett utsläpp på högst 525 nm.
- Börja arbeta med 25 X mål att fokusera på spermier. Välj kanalen DAPI att fokusera eftersom detta fluorokrom rapporterar den högsta intensiteten. När cellerna är fokuserad, använda en 63 X eller 100 X-objektiv för en grundlig utvärdering eftersom Solea senegalensis spermier storlek är cirka 2 μm.
- För varje kanal, optimera pinhole, vinst och spänningen. På samma sätt, justera digital offset för att minska bakgrunden. När alla parametrar är optimerade för de fluorokrom används, spara inställningarna. För en rutinmässig experiment för en enda spermie Solea senegalensis vi använde följande (dessa parametrar kan ändras i varje experiment): hål 1 och vinst spänningen av 750 V.
6. förvärv av bilder
- Välj önskad kvalitet villkor för bild förvärv. Definiera förvärv inställningar som bitdjup, bildformat, ljus plåttjocklek och välja enstaka dubbelsidig belysning. För en rutinmässig experiment för en enda Solea senegalensis spermier vi använde följande (dessa parametrar kan ändras i varje experiment): RAM storlek 1024 px; bitar per pixel 16; Scan hastighet av 2-4).
- Öppna och centrera skanningsområdet för att börja och ta en bild av området.
- Beskärningsverktyget, välj regionen av intresse och tryck på live.
- Med hjälp av verktyget range indikator, justera digital offset för att minska bakgrunden. Gör detta för varje kanal och ta bilden.
- Kontrollera kvaliteten på enskilda kanaler för varje fluorokrom och deras kombinationer.
7. skapa en 3D-bild-Video
- Z-stack förvärv inställningar.
- Välj alternativet Z-stack i programvaran.
- Markera cellen, grupp av celler eller område av intresse och fokusera den.
- Avgränsa Z-stacken med 'Första Slice' och 'Senaste skiva' alternativ och fastställa z steget till intervall till 0,2 µm med hjälp av fina fokus. Välj DAPI kanal att fokusera eftersom detta fluorokrom kan rapportera högsta intensitet och du kan enkelt välja hela spermier huvudet. Välj de optimala förvärv parametrarna för varje kanal och köra experimentet.
- Köra Z-stacken experimentet. Dela kanaler och observera localizationen av varje signal inom cellerna.
- Z-stack processen.
- Volym render: när experimentet är klar, Välj alternativ av Z-stack bearbetning programvaran och välja volymen återge alternativet. Välj antal steg och rotation grader (360°). Spara filen med filnamnstillägget video.
- Stereo anaglyf: välja stereo anaglyf i alternativ processfönster. Detta verktyg kan skapa en 3D-bild video med split kanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konfokalmikroskopi är en idealisk metod för intracellulära ROS utvärdering i lever spermier. Kombinationen av de tre fluorokromer (DAPI, mitokondrier fläcken och DCFH-DA) presenteras i denna studie (figur 1) ger många användbar information som kan användas i grundforskning och kan ha program för att förbättra förfaranden som används i industriella vattenbruk växter, såsom frysförvaring protokoll. Olika typer av analyser kan utföras för att korrelera intracellulära ROS närvaro och andra parametrar: motilitet, livskraft, olika mönster mellan bra och dåliga uppfödare, aktivering av motilitet eller säsongsbetonade spermier variationer bland många andra. Den nuvarande arbetet, visas i två olika mönster av intracellulära H2O2 fördelning inom spermier: sammanhängande med mitokondrien eller spridning i kärnan (figurerna 2, 3). De spermier som visar låg potentiella skador som produceras av ROS visade DCFH-DA märkning endast i mitokondrierna medan de som lider av DNA-skada visade DCFH-DA märkning också i kärnor. Konfokalmikroskopi programvara tillåter att skapa användbara videor och ger enkel och snabb colocalization grafer.
Figur 1 . Allmän översikt över protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Exempel på confocal bild förvärvandet. A. systemet av provet B. DAPI kanal (märkning dsDNA). C. mitokondrier fläcken kanal (märkning mitokondrien). D. Mitokondrier fläcken kanal samman med DAPI kanal. E. DCFA-DH kanal (märkning intracellulära H2O2). F. DCFA-DH kanal samman med DAPI kanal. G. sammanslagning av de tre kanalerna. Förkortningar: n: kärnor, mt: mitokondrier, f: flagellen och mb: membran. Skalstapeln: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Olika mönster av intracellulära H2O2 i Solea senegalensis spermier (volym render). Resulterande kanaler av spermier visar intracellulära ROS i den nukleära fossa och mitokondrien (A, C, E). Resulterande kanaler av spermier visar intracellulära H2O2 också inom atomkärnor (B, D, F). A och B: DAPI. C och D: DCFH-DA. E och F: mitokondrier fläcken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är väl känt att mitokondrierna är viktiga organeller för spermiernas rörlighet och funktion. Dessa organeller är samtidigt direkt involverade i ROS produktion. Intressant, behövs kontrollerade nivåer av ROS för korrekt spermier funktion1. Positiva relationer mellan fertilitet och oxidativ stress har visats i däggdjur11 men alltför höga halter påverka spermier kvalitet12. En avgörande faktor som kan vara avgörande för en positiv eller negativ effekt är inte bara ROS nivåer men också ROS intracellulära lokalisering. En av de skadliga effekterna av ROS producerar DNA skador9 och därför nukleära förekomsten av ROS kan vara en indikator på potentiella skador i kärnan ROS nivåer kunna vara normala i mitokondrier. Det är nödvändigt att komplettera befintliga kvantitativa metoder (t.ex., flödescytometri) med tekniker som konfokalmikroskopi som kan ge information om ROS intracellulära lokalisering.
Konfokalmikroskopi är ett optimalt alternativ att visualisera den intracellulära lokaliseringen av ROS. Användningen av specifika fluorokromer som en levande mitokondrier fläcken och DAPI kan visualisering av mitokondrier och nucleus respektive och kombinationen av dessa molekyler med DCFH-DA tillåter intracellulära localizationen av peroxid.
Kritiska steg i protokollet är fluorokrom inkubation och confocal setup. Båda stegen bör optimerad och noggrant utfört för att erhålla reproducerbara och konsekvent resultat. Metod ändringar bör utföras på dessa två nivåer beroende på seminal plasma används. Fluorokrom inkubation bör därför anpassas. Temperaturer och lagringsförhållanden avsevärt skiljer sig åt mellan spermier prover, och de flesta av protokoll som är optimerade för däggdjur.
Här, ett protokoll för lever spermier prover, särskilt för Solea senegalensis spermier, beskrivs (figur 1). Framgångsrika märkning av kärnor och mitokondrier har utförts genom att använda protokollet beskrivs och ROS närvaro har varit avslöjar använder DCFH-DA (bild 2). Resultaten tyder på att samtidig lokalisering av H2O2 har hittats i kärnor eller mitokondrier beroende på sperma provet (figur 3). Som tidigare förklarats, skulle dessa prover med en hög andel spermier visar höga nivåer av ROS inom kärnan vara benägna att DNA-skador. Detta protokoll har en unik begränsning som kravet på dyr utrustning (confocal Mikroskop), men det kunde ha framtida verktyg att välja spermier prover med låg förekomst av ROS inom kärnan för frysförvaring ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Detta arbete fick ekonomiskt stöd av AGL201568330-C2-1-R project (MINECO/FEDER). David G. Valcarce finansierades av Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) och Fondo Social Europeo. Författarna erkänner Dr Ana Riaza och Stolt Sea Farm S.A., Dr Paulino de Paz, Dr Ignacio Martínez Montero och José Ramón Guiérrez. Vi tackar också Paula Fernández Colado för videography.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
