Summary
Ce protocole décrit une méthodologie détaillée pour détecter H2O2 localisation au sein de spermatozoïdes Solea senegalensis en utilisant un fluorochrome sensible DHFC-DA ROS, une tache de mitochondries direct des mitochondries et DAPI pour les noyaux visualisation, respectivement. Le protocole est conçu pour être effectuée dans les 2 h avec spermatozoïdes fraîches ou décongelées.
Abstract
Le stress oxydatif est l’un des facteurs importants en diminuant la qualité du sperme. Élaboration de protocoles efficaces pour la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) de spermatozoïdes est très important dans toutes les espèces, mais ces méthodes sont rarement utilisés et encore moins en téléostéen. Cryoconservation est une technique utile en aquaculture à des fins différentes, y compris les banques de gènes et garanti la disponibilité de sperme tout au long de l’année. Procédures de gel/dégel pourrait causer la production de ROS et endommagent les cellules de sperme. Étant donné que les éventuels dommages qu’un excès de production de ROS pourrait provoquer dans les spermatozoïdes selon leur localisation, ici une méthodologie détaillée pour détecter H2O2 et évaluer sa localisation intracellulaire par microscopie confocale est fourni. À cette fin, une combinaison des 3 fluorochromes (2′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacétate (DHFC-DA), une tache de mitochondries direct et 4′, dichlorhydrate de 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI)) sont utilisées pour évaluer la co-localisation de H2O2 avec des noyaux de spermatozoïdes ou de mitochondries dans les échantillons de sperme de Solea senegalesis .
Introduction
La production d’espèces réactives de l’oxygène a été liée à la qualité du sperme récemment1. Bien que la production de ROS dans les mitochondries peut être considéré comme un processus physiologique normal, le stress oxydatif par un excès de production de ROS est une cause évidente de dommages dans les spermatozoïdes à différents niveaux. Chez l’humain, le stress oxydatif est associé à l’infertilité masculine, altérant la motilité et la possibilité de subir une capacitation des2; chez les mammifères, changement d’intégrité de l’ADN dans les échantillons de sperme congelé a été également lié à la synthèse de H2O23.
Cryoconservation est une technique courante pour gène bancaire en aquaculture. Cette technologie est particulièrement importante chez les espèces avec des problèmes de reproduction telles que Solea senegalensis. Cette espèce précieuse sur le marché montre un dysfonctionnement reproductif chez les individus nés en captivité en raison du manque de parade nuptiale. Ce fait rend la cryoconservation du sperme nécessaire d’avoir la disponibilité de sperme pour la fécondation artificielle. Toutefois, la cryoconservation pourrait être une source de stress oxydatif qui pourrait être néfaste pour les spermatozoïdes4 car des études ont révélé un effet bénéfique de la supplémentation en antioxydants. Inhibition de ROS par antioxydant mitochondrial ciblée est aurait été bénéfique pour la cryoconservation de sperme dans le poisson-chat jaune5.
Par conséquent, les niveaux de ROS dans les échantillons de sperme sont importants de savoir, surtout après cryoconservation6,7 , parce que ces molécules ont été reconnues comme un inconvénient pour la survie de sperme et fertilité8. En outre, étudier la distribution des ROS dans les cellules pourrait être crucial d’en déduire le niveau des dégâts potentiels. À titre d’exemple, on pouvait supposer des niveaux faibles de ROS dans les mitochondries normales et compatible avec la fonction spermatique, mais des niveaux élevés de ROS dans le noyau pourraient être indicateurs de dommages à l’ADN les spermatozoïdes. H2O2 est l’un des plus pertinents br qui pourraient être libérées de la mitochondrie et pénètrent le noyau parce que c’est une petite molécule sans frais9. Diacétate de dichlorofluorescéine (DHFC-DA) peut révéler spécifiquement intracellulaire peroxyde émettant une fluorescence verte. Dans cet article, un protocole détaillé pour détecter la localisation intracellulaire de H2O2 dans Solea senegalensis spermatozoïdes au microscope confocal est présenté.
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Protocol
NOTE : L’incubation Fluorochrome et confocale analyse prendra au moins 2-3 h pour un contrôle et un échantillon traité. Traitement des données n’est pas inclus dans ce calcul de temps. Matériel requis se trouvent dans la Table des matières. Ce protocole peut être appliqué aux spermatozoïdes frais ou cryopréservés. Solea senegalensis est une espèce de poisson qui se reproduit dans l’eau froide, travail toujours à froid (4-7 ° C). Voir la Figure 1 pour une vue d’ensemble du protocole.
1. travaux préparatoires avant l’expérience
- Préparer un 1 mM mitochondries tachent solution en qualité analytique DMSO.
- Préparer un 4′ de 1 μg/mL, solution 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) dans l’eau désionisée.
- Préparer une solution de Ringer mOsm/kg 200 (116 mM NaCl, KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH = 7,7 2,9 mM)
- Réaliser 4 mM 2′, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DHFC-DA) solution dans du méthanol de qualité analytique.
Remarque : Maintenez les solutions mères en aliquotes à-20 ° C jusqu'à ce que nécessaire. - Définir la microcentrifugeuse à 4-7 ° C.
2. préparation avant Incubation Fluorochrome
Remarque : Une manipulation douce des spermatozoïdes est souhaitable lorsque pipetage et resuspendant.
- Si vous travaillez avec des cellules cryoconservés, préparer un bain d’eau pour la décongélation à 40 ° C pour Solea senegalensis spermatozoïdes10. Immerger les échantillons de paille dans le bain d’eau pour 7 s.
- Utiliser des ciseaux pour couper, vider l’échantillon dans un tube à centrifuger et centrifuger à 1000 g, 4-7 ° C pendant 1 min.
- Retirer le plasma séminal ou le plasma séminal avec cryoprotecteurs l’échantillon cryopréservé de pipetage pour rejeter tout élément pouvant interférer avec le protocole de coloration.
- Remettre en suspension les cellules dans le 50-100 μL de 4 ° C 200 mOsm/kg, une solution de Ringer.
- Déterminer la concentration de spermatozoïdes avec un Neubauer ou une chambre de comptage similaire sous un microscope stéréoscopique.
- Diluer la suspension cellulaire jusqu’à 1-2 x 106 cellules/mL dans un volume final de 0,5 mL à 4 ° C, une solution de Ringer.
3. fluorochrome Incubation
Remarque : Les Fluorochromes doivent être manipulés en conditions de faible luminosité, surtout quand en solution.
- Ajouter 3,125 μL de solution mère de DHFC-DA (concentration finale dans l’échantillon : 25 μM) à la dilution d’échantillon de travail. Incuber à 4-7 ° C pendant 40 min à l’obscurité10.
- Après 30 min, ajouter 0,5 μL de la solution mère de DAPI (concentration finale dans l’échantillon : 2 μM) et 0,5 μL des mitochondries tacher la solution mère (concentration finale dans l’échantillon : 100 nM) à l’échantillon. Incuber les deux fluorochromes pendant 10 min dans l’obscurité.
4. préparation pour la microscopie confocale
- Après la période d’incubation, centrifuger la suspension cellulaire à 1000 x g, 4-7 ° C pendant 1 min.
- Éliminer le liquide surnageant avec soin par pipetage.
- Ajouter un μL de 10-20 de 200 mOsm/kg de solution de Ringer.
- Déposer 5 μl d’une suspension de cellules concentrées drop sur une diapositive.
- Soigneusement, mettre une diapositive de couverture sur la préparation et scellez-la avec vernis. Une fois le vernis sec, la préparation est prête pour la microscopie confocale.
5. confocal Setup avant l’expérience
Remarque : Selon le microscope, DHFC-DA puisse « brûler ». Mettre en place les meilleures conditions auprès d’un échantillon sans valeur marchande tout d’abord.
- Allumez le microscope, lasers, appareil photo et l’ordinateur qui exécute le microscope.
- Définissez des lasers à excitation prenant en compte les taux d’excitation et d’émission maximaux de chaque fluorochrome :
- Pour DAPI, utilisez un maximum d’excitation de 358 nm et une émission maximale de 465 nm.
- Pour la tache mitochondriale, utilisez un maximum d’excitation de 644 nm et une émission maximale de 662 nm.
- Pour DHFC-DA, utilisez un maximum d’excitation de 504 nm et une émission maximale de 525 nm.
- Commencer le travail avec 25 X, objectif de se concentrer sur les spermatozoïdes. Choisir le canal DAPI se concentrer car ce fluorochrome indique l’intensité la plus élevée. Une fois que les cellules sont concentrent, utiliser un objectif 63 X ou 100 X pour une évaluation approfondie parce que la taille des spermatozoïdes Solea senegalensis est autour de 2 μm.
- Pour chaque canal, optimiser le sténopé, le gain et la tension. De la même manière, régler l’offset numérique afin de réduire le fond. Une fois que tous les paramètres sont optimisés pour le fluorochrome utilisé, enregistrer les paramètres. Pour une expérience de routine pour un seul spermatozoïde Solea senegalensis , nous avons utilisé les éléments suivants (ces paramètres peuvent changer pour chaque expérience) : trou d’épingle de 1 et la gain de tension de 750 V.
6. l’acquisition d’Images
- Sélectionnez les conditions de la qualité voulue pour l’acquisition de l’image. Définissez les paramètres d’acquisition comme la profondeur de bits, format de l’image, l’épaisseur de la nappe de lumière, puis choisissez illumination face unique. Pour une expérience de routine pour un seul spermatozoïde Solea senegalensis , nous avons utilisé ce qui suit (ces paramètres peuvent changer pour chaque expérience) : cadre taille de 1024 px ; bits par pixel de 16 ans ; Vitesse de balayage de 2-4).
- Ouvrir et centre de la zone de numérisation afin de commencer et prendre une image du champ.
- À l’aide de l’outil de recadrage, sélectionnez la zone concernée, puis appuyez sur direct.
- Avec l’aide de l’outil indicateur de gamme, régler l’offset numérique afin de réduire le fond. Procéder ainsi pour chaque canal et prendre l’image.
- Vérifier la qualité des canaux individuels pour chaque fluorochrome et leurs combinaisons.
7. créer une Image 3D vidéo
- Paramètres d’acquisition Z-pile.
- Choisissez l’option Z-pile dans le logiciel.
- Sélectionnez la cellule unique, groupe de cellules ou d’une région d’intérêt et le focus.
- Délimiter la Z-pile avec les options « Première tranche » et « Dernière tranche » et établir l’étape z à intervalle de 0,2 µm avec l’aide de la mise au point fine. Choisir DAPI canal se concentrer parce que ce fluorochrome peut indiquer l’intensité la plus élevée et vous pouvez facilement sélectionner la tête entière de spermatozoïdes. Sélectionnez les paramètres d’acquisition optimal pour chaque canal et exécutez l’expérience.
- Exécuter l’expérience de Z-pile. Diviser les canaux et observer la localisation de chaque signal dans les cellules.
- Processus de Z-pile.
- Rendu de volume : une fois l’expérience est terminée, sélectionnez les options du logiciel Z-pile traitement et choisir le volume rend option. Sélectionnez le nombre d’étapes et les degrés de rotation (360°). Enregistrez le fichier avec l’extension vidéo.
- Stéréo anaglyphe : choisissez stéréo anaglyphe dans les options de la fenêtre processus. Cet outil permet de créer une image 3D vidéo avec canaux de split.
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Representative Results
Microscopie confocale est une méthode idéale pour l’évaluation de ROS intracellulaire dans le sperme chez les téléostéens. La combinaison des trois fluorochromes (DAPI, une tache de mitochondries et DHFC-DA) présentés dans cette étude (Figure 1) fournit de nombreuses informations utiles peuvent être appliquées dans la recherche fondamentale et pouvant avoir des applications dans l’amélioration des procédures utilisées dans plantes de l’aquaculture industrielle, tels que les protocoles de cryoconservation. Différents types d’analyse peuvent être effectués afin d’établir une corrélation entre la présence ROS intracellulaire et autres paramètres : motilité, viabilité, différents modèles entre les bons et les mauvais éleveurs, l’activation de la motilité ou les variations saisonnières de sperme parmi tant d’autres. Dans le présent travail, figurent deux différents modes de distribution intracellulaire de l’H2O2 dans les spermatozoïdes : colocalisés avec mitochondrie ou de propagation dans le noyau (Figures 2, 3). Ces spermatozoïdes montrant de faibles dommages potentiels produites par ROS a montré DHFC-DA étiquetage seulement dans les mitochondries, tandis que ceux qui souffrent de dommages à l’ADN ont montré DHFC-DA étiquetage également dans les noyaux. Logiciel de la microscopie confocale permet de créer des vidéos utiles et offrent des graphiques de colocalisation facile et rapide.
Figure 1 . Vue d’ensemble du protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Exemple d’acquisition d’image confocale. A. schéma de l’échantillon B. Canal DAPI (étiquetage ADNdb). C. mitochondries tachent canal (étiquetage mitochondrie). D. Tachent les mitochondries canal a fusionné avec canal DAPI. E. canal de Comminatoires-DH (étiquetage intracellulaire H2O2). F. canal Comminatoires-DH a fusionné avec canal DAPI. G. la fusion des trois canaux. Abréviations : n: noyaux, mt: mitochondries, f: flagelle et Mo: membrane. Barre d’échelle : 5 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Différents modèles d’intracellulaire H2O2 dans Solea senegalensis spermatozoïdes (rendu de Volume). Chaînes qui en résulte des spermatozoïdes montrant ROS intracellulaire dans la fosse nucléaire et de la mitochondrie (A, C, E). Chaînes qui en résulte des spermatozoïdes liste intracellulaire H2O2 également dans les noyaux (B, D, F). A et B: DAPI. C et D: DHFC-DA. E et F: tachent de mitochondries. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Il est bien connu que les mitochondries sont des organites essentiels pour le fonctionnement et la motilité des spermatozoïdes. Ces organites sont simultanément directement impliqués dans la production de ROS. Fait intéressant, les niveaux contrôlées des BR sont nécessaires pour sperme bonne fonction1. Des relations positives entre la fertilité et stress oxydatif ont été montrées dans les mammifères11 , mais un taux excessif affecte sperme qualité12. Un facteur crucial qui pourrait être décisif vers un effet positif ou négatif est non seulement les niveaux ROS, mais aussi la localisation intracellulaire ROS. Un des effets délétères de ROS est la production de dommages de l’ADN9 et par conséquent la présence nucléaire de ROS pourrait être un indicateur des dégâts potentiels dans le noyau tandis que les niveaux ROS pourraient être normales dans les mitochondries. Il est nécessaire de compléter les méthodes quantitatives (p. ex., cytométrie en flux) avec des techniques comme la microscopie confocale qui pourrait fournir des informations sur la localisation intracellulaire de ROS.
Microscopie confocale est une option optimale pour visualiser la localisation intracellulaire de ROS. L’utilisation de fluorochromes spécifiques tels qu’une tache de mitochondries direct et DAPI permet la visualisation des mitochondries et noyau respectivement, et la combinaison de ces molécules avec DHFC-DA permet la localisation intracellulaire de peroxyde.
Les étapes critiques au sein du protocole sont incubation fluorochrome et configuration confocale. Les deux étapes devraient être optimisés et réalisées avec soin afin d’obtenir des résultats reproductibles et cohérents. Modifications de la méthodologie doivent être effectuées à ces deux niveaux selon le liquide séminal utilisé. Par conséquent, il convient d’adapte incubation fluorochrome. Températures et conditions de stockage diffèrent significativement entre les échantillons de sperme, et la plupart des protocoles est optimisée pour les mammifères.
Ici, un protocole pour les échantillons de sperme chez les téléostéens, particulièrement pour les spermatozoïdes Solea senegalensis , est décrite (Figure 1). Un étiquetage réussie des noyaux et les mitochondries ont été réalisées en utilisant le protocole décrit et présence ROS a été révélé à l’aide de DHFC-DA (Figure 2). Les résultats indiquent que co-localisation d’H2O2 ont été trouvées dans les noyaux ou les mitochondries selon l’échantillon de sperme (Figure 3). Comme nous l’avons expliqué précédemment, ces échantillons avec un pourcentage élevé de spermatozoïdes affichant des niveaux élevés de ROS dans le noyau serait sujettes aux dommages d’ADN. Ce protocole a une limitation unique, l’exigence du matériel coûteux (microscope confocal), mais il pourrait avoir une utilité future dans la sélection des échantillons de sperme avec la faible présence des ROS dans le noyau à des fins de cryoconservation.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions l’Action COST AQUAGAMETE FA 1205. Ce travail a été soutenu financièrement par le projet AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce a été financé par la Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) et Fondo sociale Europeo. Auteurs reconnaissent le Dr Ana Riaza et Stolt Sea Farm S.A., m. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero et José Ramón Guiérrez. Nous remercions également Paula Fernández Colado vidéographie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
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