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Chemistry

एक एच एस-MRM परख के ठहराव के लिए मेजबान कोशिका प्रोटीन में प्रोटीन क्रोमैटोग्राफी आयन गतिशीलता द्वारा QTOF जन स्पेक्ट्रोमेट्री

Published: April 17, 2018 doi: 10.3791/55325
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Waters Corporation
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक क्रोमेटोग्राफिक एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी में नुकीला पेप्टाइड मानकों के ठहराव के लिए पेप्टाइड टुकड़े का पता लगाने के बाद उच्च संकल्प (~ ३०,०००) एमएस-के बाद आयन गतिशीलता जुदाई के साथ मिलकर परख का वर्णन डाइजेस्ट.

Abstract

कम स्तर के विश्लेषण (1-100 पीपीएम) प्रोटीन अशुद्धियों (जैसे, मेजबान सेल प्रोटीन (HCPs)) में प्रोटीन है एक चुनौतीपूर्ण उच्च संवेदनशीलता और एक व्यापक गतिशील रेंज की आवश्यकता परख है । बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटीन के लिए ठहराव परख आम तौर पर शामिल प्रोटीन पाचन चयनात्मक प्रतिक्रिया की निगरानी के द्वारा पीछा किया/मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (टेक्सटाइल्स/MRM) ठहराव का उपयोग कर पेप्टाइड्स के एक कम संकल्प (रु ~ १,०००) मिलकर quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर । इस दृष्टिकोण की सीमाओं में से एक है जब ब्याज की पेप्टाइड "एक ही" प्रणेता और टुकड़ा द्रव्यमान (m/z मूल्यों के संदर्भ में) के रूप में अंय सह eluting पेप्टाइड्स नमूना में मौजूद है (एक 1-Da विंडो के भीतर) मनाया हस्तक्षेप घटना है । इस घटना से बचने के लिए, हम एक वैकल्पिक जन spectrometric दृष्टिकोण, एक उच्च selectivity (एच एस) MRM परख है कि उच्च संकल्प के साथ पेप्टाइड पुरोगामी के आयन गतिशीलता जुदाई को जोड़ती है प्रस्ताव (Rs ~ ३०,०००) पेप्टाइड अंशों का पता लगाने MS । हम कम मात्रा में एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब) में नुकीला मानकों को पचाने के लिए इस दृष्टिकोण की क्षमताओं का पता लगाया और यह दर्शाता है कि यह संवेदनशीलता और गतिशील रेंज है (परिमाण के ंयूनतम 3 आदेश) आम तौर पर HCP में प्राप्त विश्लेषण. सभी छह पेप्टाइड मानकों सांद्रता पर पाया गया के रूप में कम के रूप में ०.१ एनएम (एक २.१-mm आईडी क्रोमेटोग्राफिक कॉलम पर लोड 1 femtomole) एक उच्च बहुतायत पेप्टाइड पृष्ठभूमि की उपस्थिति में (एक मॉब डाइजेस्ट के 2 µ जी पर लोड-कॉलम) । जब इस मेगावाट के खरगोश phosphorylase (९७.२ केडीए), जहां से नुकीला पेप्टाइड्स प्राप्त किया गया था पर विचार, इस परख के LOQ से कम है ५० पीपीएम । सापेक्ष मानक विचलन (RSD) पीक क्षेत्रों (n = 4 प्रतिकृति) इस अध्ययन में (0.1-100 एनएम या 1-1000 पीपीएम) की जांच की पूरी एकाग्रता सीमा पार 15% से कम थे ।

Introduction

औद्योगिक सेटिंग्स में बड़े ठहराव अणुओं (प्रोटीन) की वर्तमान में immunoassays (जैसे, एलिसा), मुख्य रूप से कई फायदों के कारण: संवेदनशीलता, उच्च प्रवाह, आसानी से उपयोग करते हैं, और प्रति नमूना कम लागत पर आधारित है । जब कम बहुतायत प्रोटीन अशुद्धियों का विश्लेषण करने के लिए लागू (1-100 पीपीएम के मेजबान सेल प्रोटीन (HCPs)) प्रोटीन चिकित्सकीय में मौजूद, इन जैविक परख आमतौर पर कुल HCP एकाग्रता प्रदान (आमतौर पर पीपीएम या एनजी HCP में व्यक्त/मॉब), लेकिन वे व्यक्तिगत HCP संदूषणों की पहचान और माप नहीं सकता । कई एमएस आधारित परख हाल ही में एलिसा पूरक या जानकारी है कि एलिसा1,2,3,4,5,6 की पेशकश करने में विफल प्रदान करने के लिए विकसित किया गया है , 7 , 8 , 9. क्योंकि नमूना जटिलता और एकाग्रता में एक व्यापक गतिशील रेंज भर HCP पेप्टाइड्स का पता लगाने के लिए आवश्यकता की (परिमाण के ंयूनतम 3 आदेश), बहुआयामी क्रोमेटोग्राफिक तरीकों व्यापक नमूना भिन्नीकरण टेण्डर है पारंपरिक रूप से कम बहुतायत HCPs1,2,3,4,5,6,7की पहचान करने में मदद करने के लिए नियोजित किया गया है ।

HCP पहचान और सत्यापन के बाद एक प्राकृतिक कदम HCP ट्रैकिंग (निगरानी) के कई बैचों में है । इस स्थिति में, एकल-आयाम नियंत्रण रेखा/MS विधियों का नमूना प्रवाह8,9में सुधार करने के लिए प्रस्तावित किया गया है । हालांकि, सटीकता और HCP माप की गतिशील रेंज एक डी सी नियंत्रण रेखा/एमएस परख में प्रभावित हो सकता है की भारी उपस्थिति द्वारा-फार्मास्युटिकल पेप्टाइड्स । एक बहुआयामी जुदाई की तुलना में, संकेत हस्तक्षेप के लिए संभावित19,20,21,22 एक एकल आयाम क्रोमेटोग्राफिक जुदाई में वृद्धि हुई है क्योंकि के लिए संभावना अधिक पेप्टाइड पुरोगामी सह होने के लिए eluting वृद्धि हुई है । ओर्थोगोनल का निगमन क्रोमेटोग्राफिक जुदाई समय विस्तार के बिना पेप्टाइड अग्रदूतों को अलग करने के लिए मतलब स्पष्ट रूप से लाभप्रद होगा । यात्रा लहर आयन गतिशीलता (TWIM)10 मिलीसेकंड में भीड़भाड़ एमएस स्पेक्ट्रा को हल करने की क्षमता है । लगभग ५०० गतिशीलता जुदाई एक पेप्टाइड के रेफरेंस के दौरान प्रदर्शन किया जा सकता है, एक पूर्ण क्रोमेटोग्राफिक चोटी की चौड़ाई संभालने 10 एस और विचार है कि आयन गतिशीलता साधन पर एक IM जुदाई के रनटाइम 20 ms.

प्रोटीन ठहराव के लिए मास spectrometric परख सफलतापूर्वक पिछले एक दशक से अधिक विकसित किया गया है अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते है चयनित (एकाधिक) प्रतिक्रिया निगरानी दृष्टिकोण (टेक्सटाइल्स/MRM विधि) मिलकर जन स्पेक्ट्रोमीटर11पर कार्यांवित का उपयोग कर, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23. इस कम संकल्प जन spectrometric परख की सीमाओं में से एक हस्तक्षेप घटना19,20,21,22 मनाया जब ब्याज की पेप्टाइड "एक ही है" नमूने में मौजूद अन्य सह-eluting पेप्टाइड्स के रूप में प्रणेता और टुकड़ा द्रव्यमान (एक 1-Da विंडो के भीतर). टेक्सटाइल्स/MRM तरीकों की सटीकता को बेहतर बनाने के दो तरीके हैं: एक विकल्प पूर्ववर्ती आयनों हस्तक्षेप को दूर करने के लिए अग्रदूत के स्तर पर एक अतिरिक्त जुदाई कदम शामिल है, जबकि अन्य विकल्प के लिए अग्रदूत/टुकड़ा का पता लगाने के एमएस संकल्प को बढ़ाने के लिए है अतिव्यापी एमएस संकेतों से बचें । उच्च-selectivity (एच एस) MRM अधिग्रहण मोड यहां वर्णित उच्च संकल्प के साथ पेप्टाइड पुरोगामी की आयन गतिशीलता जुदाई युग्मन द्वारा इन तरीकों के दोनों का लाभ लेता है (Rs ~ ३०,०००) पेप्टाइड अंशों का पता लगाने के एमएस । परख यहां वर्णित परिमाण, जो गतिशील रेंज आमतौर पर टेक्सटाइल्स में मनाया/MRM प्रोटियोमिक् प्रयोगों17,18,24के कम से तीन आदेश शामिल हैं ।

HCP ठहराव के लिए एच एस-MRM परख की उपयोगिता छह पेप्टाइड मानकों द्वारा उत्पादित संकेत की रैखिकता की निगरानी द्वारा प्रदर्शन किया गया था (०.१-१००-एनएम रेंज के लिए) एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी डाइजेस्ट में अलग सांद्रता पर नुकीला ।

Protocol

1. infliximab डाइजेस्ट की तैयारी (~ 24 एच प्रक्रिया)

  1. ५० मिमी अमोनियम बिकारबोनिट के नए सिरे से समाधान तैयार करें, 1% anionic surfactant में ५० एमएम nh4HCO3, ५०० एमएम dithiothreitol (डीटीटी) में ५० एमएम एनएच4HCO3, और ५०० एमएम iodoacetamide (IAM) में ५० एमएम एनएच4HCO3.
  2. करने के लिए ७५० µ एल के ५० मिमी NH4HCO3, जोड़ें २०० µ एल के infliximab मॉब (10 मिलीग्राम/एमएल) और ५० µ एल के 1% anionic surfactant समाधान और 15 मिनट के लिए प्रोटीन पर ६० डिग्री सेल्सियस की उपस्थिति में ०.०५% anionic surfactant ।
  3. ५०० mm डीटीटी के ४० µ एल जोड़ें और 20 मिमी डीटीटी की उपस्थिति में ६० डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए नमूना कम ।
  4. ५०० mm IAM के 20 µ l जोड़ें और alkylate की उपस्थिति में अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए नमूना ~ 10 मिमी IAM ।
  5. microcentrifuge ट्यूब की सामग्री एक ग्लास शीशी एमएस अनुक्रमण के 20 µ g युक्त करने के लिए ग्रेड Lys सी/trypsin और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए नमूने को पचाने में जोड़ें ।
  6. एक दूसरा एंजाइम aliquot (20 µ g) एक और ग्लास शीशी एमएस sequencing के 20 µ जी ग्रेड Lys c/Trypsin से युक्त एक और नमूना (12-15 एच) ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर पचा नमूना स्थानांतरित करके जोड़ें ।
  7. रात भर प्रोटियोलिसिस के बाद, १००% फार्म का एसिड (एफए) के 5 µ एल जोड़ने और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए डाइजेस्ट गर्मी एसिड labile anionic surfactant को विघटित करने के लिए ।
  8. anionic surfactant के अघुलनशील घटक हाला करने के लिए एक केंद्रापसारक में ४,००० x g पर 15 मिनट के लिए डाइजेस्ट नीचे स्पिन ।
  9. infliximab डाइजेस्ट के ~ १,००० µ एल पुनर्प्राप्त करें और यह एक नियंत्रण रेखा ऑटो नमूना शीशी में जगह; डाइजेस्ट एकाग्रता ~ 2 मिलीग्राम/एमएल होना चाहिए । डाइजेस्ट में एक फ्रीजर में स्टोर-20 ° c जब तक नियंत्रण रेखा/एमएस प्रणाली विश्लेषण के लिए तैयार है ।

2. पेप्टाइड मानकों के Spiking (~ 30 मिनट)

  1. कमरे के तापमान पर एक बेंच पर कांच की शीशी में जमे हुए नमूने को रखकर infliximab डाइजेस्ट को पिघला दे ।
  2. एक खरगोश phosphorylase बी (फोटो) में ०.१% एफए के 1 मिलीलीटर में जोड़ें 1-µ एम स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए फोटो से सभी छह पेप्टाइड मानकों के लिए शीशी में निहित (शीशी प्रत्येक पेप्टाइड के 1 nmol शामिल हैं).
  3. ०.१, 1, 10, और १०० एनएम पेप्टाइड युक्त समाधान प्राप्त करने के लिए फोटो शेयर समाधान के 4 एक्स 1 मिलीलीटर कमजोर पड़ने तैयार, कमजोर पड़ने विलायक के रूप में ०.१% एफए का उपयोग कर । ग्लास शीशियों (नियंत्रण रेखा ऑटो नमूना शीशियों) में सभी कमजोर पड़ने तैयार है और सभी शीशियों को पृष्ठभूमि मैट्रिक्स के रूप में infliximab डाइजेस्ट के १०० µ एल जोड़ें । प्रत्येक 10-µ एल इंजेक्शन के साथ-कॉलम पर डाइजेस्ट पृष्ठभूमि के 2 µ g लोड । एक खाली नमूना है कि पतला infliximab डाइजेस्ट शामिल (एक ही 1:10 कमजोर पड़ने), कोई नुकीला पेप्टाइड्स के साथ तैयार करें ।

3. LC/HDMS E डेटा प्राप्ति पद्धति का सेटअप

नोट: कोई HS-MRM प्राप्ति सेट करने के लिए आवश्यक चरणों का सारांश वर्कफ़्लो आरेख 1 में दर्शाया गया है और अनुभागों 3-6 में विवरण में वर्णन किया गया है । एक डेटा-स्वतंत्र HDMSE डेटासेट का अधिग्रहण प्रत्येक मॉनिटर पेप्टाइड का अवधारण समय स्थापित करने के लिए आवश्यक है, electrospray ionization के बाद सबसे प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड आयन के जनक एम/जेड, और इसी सीसीएस (टकराव पार अनुभाग) आयन गतिशीलता जुदाई से व्युत्पंन । इसके अलावा, डेटा-स्वतंत्र डेटासेट प्रत्येक पेप्टाइड प्रणेता के लिए तीन सबसे प्रचुर मात्रा में टुकड़ा आयनों के एम/जेड के बारे में जानकारी प्रदान करता है । कार्यप्रवाह के दूसरे चरण में (CE अनुकूलन), परख की संवेदनशीलता टक्कर सेल ऊर्जा ट्यूनिंग प्रत्येक टुकड़ा आयन के लिए उच्चतम आयन तीव्रता प्राप्त करने के द्वारा वृद्धि हुई है । अंत में, अंतिम चरण में, सभी मापदंडों ऊपर वर्णित प्रत्येक पेप्टाइड निगरानी के लिए एच एस-MRM विधि संपादक के लिए पेश कर रहे हैं ।

  1. एक quadrupole समय की उड़ान पर नियंत्रण रेखा/MS प्रयोगों (QTOF) मास एक अल्ट्रा प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली एक डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण पद्धति (HDMSई) का उपयोग करने के लिए युग्मित स्पेक्ट्रोमीटर.
    नोट: साधन विन्यास के बारे में अधिक जानकारी सामग्री अनुभाग में शामिल हैं. यह यंत्र पेप्टाइड पुरोगामी की जुदाई के लिए एक यात्रा लहर आयन गतिशीलता डिवाइस का उपयोग करता है10.
  2. दो मोबाइल पानी में ०.१% एफए (विलायक एक) और acetonitrile (विलायक बी) में ०.१% एफए युक्त चरणों को तैयार करें ।
    नोट: नुकीला मॉब डाइजेस्ट की जुदाई के लिए एक चार्ज किया सतह संकर (CSH) C18 कॉलम (२.१ x १५० mm, १.७-µm कणों के साथ पैक) का उपयोग करें ।
  3. डेटा अर्जन सॉफ्टवेयर में, "बनाएँ/विश्लेषण विधि" पर क्लिक करें और "एक अधिग्रहण और प्रसंस्करण विधि उत्पन्न." चुनें विधि नाम टाइप करें, विधि फ़ोल्डर (निर्देशिका) के लिए ब्राउज़ करें, और "अगला."
  4. "विश्लेषण प्रकार के लिए," चुनें "पेप्टाइड मानचित्र (आईएमएस)," और "साधन प्रणाली" टैब में, "चतुर्धातुक विलायक प्रबंधक" साधन का चयन करें । २०० µ l/मिनट की एक प्रवाह दर पर पेप्टाइड पृथक्करण प्राप्त करने के लिए ग्रेडिएंट सेटिंग्स संपादित करें एक ग्रैडिएंट रेफरेंस का उपयोग 1 से ४०% विलायक बी 30min में एक 2-ंयूनतम कॉलम धोने और एक 9 मिनट equilibration, ५० मिनट के कुल रनटाइम के साथ द्वारा पीछा किया । इन प्रायोगिक परिचय नियंत्रण रेखा विधि संपादक में पैरामीटर ।
  5. "साधन प्रणाली" टैब में, "नमूना प्रबंधक" साधन का चयन करें. 10 डिग्री सेल्सियस और ६० डिग्री सेल्सियस के लिए स्तंभ तापमान के लिए नमूना तापमान सेट करें ।
  6. QTOF जन स्पेक्ट्रोमीटर सकारात्मक आयन ईएसआई संवेदनशीलता मोड में, ३०,००० FWHM के एक ठेठ संपति शक्ति के साथ काम करते हैं ।
    नोट: LC/HDMSE एक डेटा-स्वतंत्र प्राप्ति (व्यास) मोड है जो एक कम ऊर्जा (एमएस चैनल 1 स्कैन के लिए 6 वी) और एक ऊंचा ऊर्जा (15-करने के लिए ४०-वी रैंप के बीच) बारी टक्कर ऊर्जा के साथ तेजी से स्कैन का संग्रह द्वारा संचालित है एमएस चैनल 2 में प्रणेता चयन के बिना विखंडन स्पेक्ट्रा का उत्पादन ।
    1. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में डिफ़ॉल्ट स्रोत से संबंधित एमएस पैरामीटर दर्ज करें: "मेरा काम/साधन प्रणाली" से, "वियॉन आईएमएस Qtof" टैब का चयन करें, और "उपकरण" मेनू में, इन मापदंडों दर्ज करें: ३.० केवी केशिका वोल्टेज, १०० ° c स्रोत तापमान, १०० V स्रोत ऑफसेट, ५० एल/एच शंकु गैस का प्रवाह, और ४० V शंकु वोल्टेज । desolvation तापमान सेट करने के लिए २५० ° c, desolvation गैस प्रवाह दर करने के लिए ५०० L/एच, और संदर्भ केशिका वोल्टेज करने के लिए ३.० केवी.
    2. डेटा अर्जन सॉफ्टवेयर में, "बनाएँ/विश्लेषण विधि" पर क्लिक करें और "एक अधिग्रहण और प्रसंस्करण विधि उत्पन्न." चुनें विधि का नाम लिखें और विधि फ़ोल्डर (निर्देशिका) के लिए ब्राउज़ करें, और उसके बाद "अगला."
    3. "विश्लेषण प्रकार के लिए," चुनें "पेप्टाइड मानचित्र (आईएमएस)," और "साधन प्रणाली" टैब में, "वियॉन आईएमएस QTof" साधन का चयन करें. "समाप्त" क्लिक करें ।
      नोट: नई बनाई गई LC/HDMSE विधि स्वचालित रूप से "इंस्ट्रूमेंट विधि कॉंफ़िगरेशन" स्क्रीन में खुलती है ।
    4. "सेटिंग्स" टैब में, इन पैरामीटर्स दर्ज करें: ३.० केवी केशिका वोल्टेज, १०० ° c स्रोत तापमान, २५० ° c desolvation तापमान, ५० एल/एच शंकु गैस का प्रवाह, और ५०० एल/एच desolvation गैस के प्रवाह ।
    5. "प्रयोग" टैब सेटिंग में, "उच्च परिभाषा MSE" चुनें और "विश्लेषण विधि रनटाइम" चुनें । "स्कैन सेटिंग्स" टैब में, इन पैरामीटर्स दर्ज करें: निंन मास, १००; उच्च जन, २,०००; और स्कैन समय, ४०० ms. "CE" टैब में, निम्न-ऊर्जा सेटिंग के लिए "6 v" टाइप करें और 15 से ४० वी के लिए एक उच्च-ऊर्जा रैंप का चयन करें. सुनिश्चित करें कि "डेटा में कमी को अक्षम करें" की जांच की है ।
    6. ५० एनजी/एमएल leucine enkephalin (LE) ०.१% एफए के साथ ५०% acetonitrile में तैयार 10 µ एल के एक प्रवाह की दर से (ले) के एक समाधान को अस्वीकार-मास अंशांकन के दौरान डाटा अधिग्रहण के लिए ।
      नोट: लॉक-मास डेटा हर 5 एक ही जन सीमा पर एक ही अधिग्रहण दर का उपयोग कर मिनट का अधिग्रहण किया है ।
  7. 10 एनएम का विश्लेषण, फोटो-नियंत्रण रेखा/HDMSई परख नमूना के 10 µ एल इंजेक्शन द्वारा ऊपर वर्णित का उपयोग कर (पर लोड की गई राशि-कॉलम प्रत्येक पेप्टाइड मानक के लिए १०० fmol है) ।

4. टक्कर ऊर्जा (CE) अनुकूलन के लिए तोफ-MRM विधि का सेटअप

  1. LC/HDMSE डेटासेट से, अवधारण समय, अग्रदूत, और प्रत्येक फोटो पेप्टाइड के लिए टुकड़ा आयन m/z प्राप्त करें । एम/जेड और सबसे प्रचुर मात्रा में अग्रदूत आयन और इसी तीन सबसे प्रचुर मात्रा में टुकड़ा आयनों के लिए प्रभारी राज्य बनाए रखें ।
    नोट: कम ऊर्जा और उच्च ऊर्जा स्पेक्ट्रा आमतौर पर नियंत्रण रेखा/HDMSE परख द्वारा दर्ज की एक उदाहरण चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है ।
  2. एक टेक्सटाइल्स/MRM प्रयोग में टक्कर ऊर्जा (CE) अनुकूलन का प्रयोग करें प्रत्येक पेप्टाइड के लिए सबसे अच्छा संकेत प्राप्त करने के लिए23।
    1. डेटा अर्जन सॉफ्टवेयर में, "बनाएँ/विश्लेषण विधि" पर क्लिक करें और "एक अधिग्रहण और प्रसंस्करण विधि उत्पन्न." चुनें विधि नाम टाइप करें, विधि फ़ोल्डर (निर्देशिका) के लिए ब्राउज़ करें, और "अगला."
    2. "विश्लेषण प्रकार" के लिए, "बढ़ाता है" चुनें । उठाओ "यों परख तोफ 2d क्रोमेटोग्राफिक" और क्लिक करें "अगला." "साधन प्रणाली" टैब में, का चयन करें "वियॉन आईएमएस QTof" और क्लिक करें "समाप्त."
      नोट: नई बनाई गई तोफ-MRM विधि स्वचालित रूप से "इंस्ट्रूमेंट विधि कॉन्फ़िगरेशन" स्क्रीन में खुलता है ।
    3. "सेटिंग्स" टैब में, इन पैरामीटर्स दर्ज करें: ३.० केवी केशिका वोल्टेज, १०० ° c स्रोत तापमान, २५० ° c desolvation तापमान, ५० एल/एच शंकु गैस का प्रवाह, और ५०० एल/एच desolvation गैस के प्रवाह ।
    4. "प्रयोग" टैब सेटिंग में, "फ़ंक्शन तालिका" का चयन करें और "एक या अधिक MS, MSMS या MRM फ़ंक्शंस" चुनें. नीचे तीर का उपयोग करना, तीन "संक्रमण" (सबसे प्रचुर मात्रा में अग्रदूत और इसके सबसे प्रचुर मात्रा में टुकड़े आयनों के तीन संयोजनों के युग्म) द्वारा प्रत्येक पेप्टाइड के लिए एक "तोफ-MRM" समारोह की स्थापना की ।
      नोट: तोफ-MRM मोड में, उच्चतम संवेदनशीलता एक अनुसूचित MRM दृष्टिकोण का उपयोग कर हासिल की है ।
    5. "तोफ-MRM" समारोह संपादक में, प्रत्येक पेप्टाइड के लिए एक प्रतिधारण समय खिड़की का चयन (कम से कम 1 मिनट), पेप्टाइड रेफरेंस आदेश के अनुसार की व्यवस्था की. "तोफ-MRM" फ़ंक्शन संपादक में, डालें पेप्टाइड के प्रणेता m/z और उत्पाद m/ "कम" (4-दा विंडो) के रूप में ट्रैक्टर अलगाव विंडो का चयन करें पेप्टाइड अग्रदूत के लिए; १०० ms के एक निश्चित स्कैन समय का चयन करें; और 14-36 वी की सीमा में बारह अलग टक्कर ऊर्जा मूल्यों का चयन करें, इस प्रकार है: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, ३२, ३४, और ३६, के रूप में चित्रा 3 से उदाहरण में दिखाया गया है ।
      नोट: के साथ तोफ-MRM विधि ऊपर वर्णित है, क्रोमेटोग्राफिक पीक प्रति कम से कम 10 डेटा बिंदुओं प्रत्येक निर्दिष्ट CE में प्रत्येक संक्रमण के लिए एकत्र कर रहे हैं । डेटा फ़ाइल आकार को कम करने के लिए, टुकड़ा आयन के संकेत के लिए "वाइड" विकल्प (6-दा विंडो) का चयन करें । CE-ऑप्टिमाइज़ किया गया मान के उदाहरण तालिका 2 में दिखाए जाते हैं ।
    6. 10-एनएम, फोटो-नुकीला नमूना का उपयोग कर तोफ-MRM नमूने के 10 µ एल इंजेक्शन द्वारा ऊपर वर्णित परख (पर लोड की गई राशि-कॉलम प्रत्येक पेप्टाइड मानक के लिए १०० fmol है) का विश्लेषण ।

5. अंतिम एच एस-MRM अधिग्रहण विधि के लिए पेप्टाइड ठहराव का उपयोग आयन गतिशीलता जुदाई पेप्टाइड पुरोगामी का सेटअप

  1. डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के "जांच" मेनू में, सभी 11 क्रोमेटोग्राफिक हर पेप्टाइड के लिए प्रत्येक CE के लिए उत्पंन निशान प्रदर्शन और "एकीकृत" प्रसंस्करण विकल्प से बटन का उपयोग चोटियों को एकीकृत/ उच्चतम शिखर क्षेत्र के प्रत्येक संक्रमण के लिए सबसे अच्छा CE का संकेत होगा.
  2. नेत्रहीन प्रत्येक पेप्टाइड के 3 टुकड़े के लिए सबसे अच्छा पीक क्षेत्रों की तुलना और केवल सबसे अच्छा "संक्रमण" (टुकड़ा आयन कि सबसे तीव्र संकेत पैदा करता है) बनाए रखने; तालिका 2 चार फोटो पेप्टाइड्स से प्राप्त सबसे अच्छा "संक्रमण" प्रदर्शित करता है ।
  3. एक एच एस-MRM विधि एक पेप्टाइड प्रति केवल एक टुकड़ा आयन युक्त सेटअप । LC/HDMSE डेटासेट से प्रत्येक पेप्टाइड प्रणेता के सीसीएस मूल्यों का उपयोग करें ।
    1. "तोफ-MRM" फ़ंक्शन के बजाय "HS-MRM" फ़ंक्शन का चयन करके पिछले अनुभाग (खंड 4) में बनाई गई तोफ-MRM विधि को संशोधित करें ।
    2. "HS-MRM" फ़ंक्शन संपादक में, निम्न प्रणेता-संबंधित पैरामीटर दर्ज करें: m/z, quadrupole संकल्प: कम (4 डीए), प्रभारी राज्य, प्रणेता सीसीएस मूल्य और अग्रदूत सीसीएस संकल्प: कम । उत्पाद आयन के लिए, अपने एम/जेड, इष्टतम टक्कर ऊर्जा दर्ज करें, ०.४ s के एक स्कैन समय चुनें और एक "व्यापक" स्पेक्ट्रम सेटिंग (6 डीए) का चयन करने के लिए अपनी आइसोटोप के सभी शामिल हैं. सभी चार पेप्टाइड्स के लिए अंतिम HS-MRM प्राप्ति विधि का एक उदाहरण चित्रा 4 में प्रस्तुत किया गया है ।
  4. एच एस-MRM विधि का उपयोग कर सभी नमूनों का विश्लेषण, मॉब डाइजेस्ट खाली (गैर नुकीला नमूना) के साथ शुरू, 4 दोहराने इंजेक्शन के बाद (10 µ एल प्रत्येक) निम्नलिखित सांद्रता के: ०.१, 1, 10 और १०० एनएम फोटो पेप्टाइड्स.

6. HS-MRM डेटासेट के विश्लेषण के लिए एक प्रोसेसिंग विधि का निर्माण

  1. HS-MRM dataset के विश्लेषण के लिए कोई संसाधन विधि बनाएँ ।
    1. "HS-MRM" डेटा प्राप्ति पद्धति के लिए बनाए गए विश्लेषण विधि में, "उद्देश्य" टैब पर क्लिक करें और "घटक प्रबंधित करें" चुनें.
    2. "प्रयोग प्रकार," के अंतर्गत ड्रॉपडाउन मेनू से "hs ms/ms/hs-MRM" विकल्प का चयन करें ।
    3. पर क्लिक करें "बनाएं/नई प्रविष्टि" और संसाधन विधि संपादक में निंन पैरामीटर परिचय: पेप्टाइड अवधारण समय (RT), प्रणेता प्रभारी राज्य, प्रणेता एम/z, और अग्रदूत बहाव समय (DT) । टुकड़ा आयन के लिए, इसके m/z और प्रभारी राज्य दर्ज करें और "XIC" ट्रेस निष्कर्षण मोड के रूप में निर्दिष्ट करें ।
    4. "उद्देश्य" टैब में एक ही "HS-MRM" अधिग्रहण विधि, पर क्लिक करें "डिफ़ॉल्ट मात्रा" और निम्नलिखित सांद्रता दर्ज: ०.१, 1, 10, और १०० एनएम फोटो पेप्टाइड्स.
    5. "संसाधन/निष्कर्षण सेटिंग्स" में निंन पैरामीटर दर्ज करें: डिफ़ॉल्ट जन सहिष्णुता, 10 पीपीएम (सभी टुकड़ा आयनों के एम/जेड के लिए) और डिफ़ॉल्ट बहाव समय, 5%; फोटो पेप्टाइड प्रोसेसिंग विधि का एक उदाहरण चित्रा 5 में दिखाया गया है ।
    6. अंशांकन प्रकार के लिए, 1/X2 भार के साथ रैखिक वक्र फिटिंग चुनें ।
  2. सभी chromatograms को एकीकृत करने के लिए और प्रत्येक फोटो पेप्टाइड के अंशांकन curves का निर्माण करने के लिए HS-MRM डेटा संसाधित करें ।

Representative Results

फोटो पेप्टाइड मिश्रण में निहित छह phosphorylase बी पेप्टाइड मानकों के व्यक्तिगत अनुक्रम, तालिका 1 में दिखाए जाते हैं, उनके अवधारण समय और उनके सबसे प्रचुर मात्रा में HDMSई प्रयोग में मनाया के साथ । एक उच्च selectivity (एच एस) MRM परख के विकास में पहला कदम एक HDMSE डेटासेट के अधिग्रहण के लिए प्रत्येक फोटो पेप्टाइड के रेफरेंस टाइंस की स्थापना है, साथ अपनी इसी सबसे प्रचुर मात्रा में अग्रदूत और तीन सबसे प्रचुर मात्रा में टुकड़े के साथ । चित्रा 2 infliximab डाइजेस्ट में नुकीला फोटो पेप्टाइड्स (पेप 6) में से एक के लिए HDMSई स्पेक्ट्रा अधिग्रहीत प्रदर्शित करता है । प्रत्येक पेप्टाइड के लिए 3 सबसे अच्छा "संक्रमण" (प्रणेता और टुकड़ा जनता के संयोजन) की स्थापना के बाद, एक तोफ-MRM प्रयोग प्रत्येक पेप्टाइड के लिए उत्पन्न संकेतों को अधिकतम करने के लिए इष्टतम टकराव ऊर्जा खोजने के लिए किया जाता है । CE अनुकूलन प्रयोग के परिणाम तालिका 2 में संक्षेप हैं । अंतिम एच एस-MRM परख (चित्र देखें 4) प्रत्येक पेप्टाइड के लिए केवल सबसे अच्छा "संक्रमण" बरकरार रखती है और सभी नुकीला नमूनों का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है । सभी सांद्रता भर में 4 फोटो पेप्टाइड्स के लिए उत्पन्न HS-MRM chromatograms के उदाहरणों चित्रा 7 में प्रस्तुत कर रहे हैं. चार अंशांकन घटता एच एस-MRM चोटियों के एकीकरण के बाद प्रत्येक पेप्टाइड के लिए प्राप्त चित्रा 7 में प्रकाश डाला गया चित्र 8 में प्रदर्शित कर रहे हैं. इसके अलावा, पीक क्षेत्र सापेक्ष मानक विचलन, 4 प्रतिकृति इंजेक्शन के आधार पर परिकलित, तालिका 3 में दिखाए गए 4 तालिकाओं में संक्षेप है ।

पेप्टाइड पेप्टाइड अवधारण प्रभारी राज्यों
Id अनुक्रम समय (min) + १ + 2 + 3 + 4
स्फूर्ति 1 VLYPNDNFFEGK १९.४ १४४२.६९५१ ७२१.८५१२ ४८१.५६९९ ३६१.४२९२
स्फूर्ति २ TCAYTNHTVLPEALER १६.० १८७४.९०६५ ९३७.९५६९ ६२५.६४०४ ४६९.४८२१
पेप 3 IGEEYISDLDQLRK १८.९ १६७८.८६४६ ८३९.९३६० ५६०.२९३१ ४२०.४७१६
पेप 4 LLSYVDDEAFIR २१.१ १४४०.७३६९ ७२०.८७२१ ४८०.९१७२ ३६०.९३९७
पेप 5 LITAIGDVVNHDPVVGDR १९.७ १८९०.००८० ९४५.५०७६ ६३०.६७४२ ४७३.२५७४
पेप 6 VFADYEEYVK १७.७ १२६२.५९३९ ६३१.८००६ ४२१.५३६२ ३१६.४०३९

तालिका 1. फोटो पेप्टाइड मानकों infliximab डाइजेस्ट में नुकीला बड़े पैमाने पर प्रस्तुत करने का मिश्रण में निहित. पेप्टाइड अवधारण समय और उनके सबसे प्रचुर मात्रा में पुरोगामी (बोल्ड में हाइलाइट किया गया) तालिका स्वरूप में प्रदर्शित होते हैं ।

पेप्टाइड पेप्टाइड अवधारण पेप्टाइड प्रणेता सबसे प्रचुर मात्रा में टुकड़ा आयनों/ इष्टतम
Id अनुक्रम समय (min) m/जेड और प्रभारी बहाव समय (एमएस) मैं द्वितीय Iii CE (V)
स्फूर्ति २ TCAYTNHTVLPEALER १६.० ६२५.६४०४ (+ 3) ६.२ ७१४.३७८१ (+ 1) ८०७.४१७७ (+ 2) ८२७.४६२१ (+ 1) 24
पेप 4 LLSYVDDEAFIR २१.१ ७२०.८७२१ (+ 2) ७.५ ८६५.४०५० (+ 1) ९६४.४७३४ (+ 1) १२१४.५६८८ (+ 1) 22
पेप 5 LITAIGDVVNHDPVVGDR १९.७ ६३०.६७४२ (+ 3) ६.३ ६४२.३५७० (+ 1) ६८९.८३९१ (+ 2) ८३२.४२३६ (+ 2) 20
पेप 6 VFADYEEYVK १७.७ ६३१.८००६ (+ 2) ७.० ८३०.३९३१ (+ 1) ९४५.४२०० (+ 2) १०१६.४५७१ (+ 1) 24

तालिका 2. तोफ-MRM अनुकूलन प्रयोग के परिणाम: इस अध्ययन में प्रत्येक फोटो पेप्टाइड quantified के तीन सबसे प्रचुर मात्रा में टुकड़े, इसी अनुकूलित टकराव ऊर्जा के साथ संकेत कर रहे हैं ।

सान्द्र राशि पेप 2 पीक क्षेत्रों (तालिका 3 ए)
एनएम) ऑन-कॉलम (fmoles) Rep01 Rep02 Rep03 Rep04 मतलब RSD (%)
०.१ 1 ४९० ४३९ ४६२ ४३१ ४५६ ५.८
1 10 ५१२१ ४८४२ ५१९८ ४८४२ ५००१ ३.७
10 १०० ६३८५३ ६४२७९ ६६१११ ६२५०९ ६४१८८ २.३
१०० १००० ६१२३९२ ६०५५५३ ६१३२२९ ६११००४ ६१०५४५ ०.६
सान्द्र राशि पेप 4 पीक क्षेत्रों (तालिका 3 बी)
एनएम) ऑन-कॉलम (fmoles) Rep01 Rep02 Rep03 Rep04 मतलब RSD (%)
०.१ 1 २७५ ३५९ ३२५ २८८ ३१२ १२.२
1 10 ३५५९ ३६९४ ३२८७ ३७५४ ३५७४ ५.८
10 १०० ४५२५९ ४५७७५ ४२९७६ ४५५४८ ४४८९० २.९
१०० १००० ४५९३७४ ४६७९२७ ४३६२७२ ४५८९९४ ४५५६४२ ३.०
सान्द्र राशि पेप 5 पीक क्षेत्रों (तालिका 3 सी)
एनएम) ऑन-कॉलम (fmoles) Rep01 Rep02 Rep03 Rep04 मतलब RSD (%)
०.१ 1 ३१९४ ३२४३ ३२०२ ३२५७ ३२२४ १.०
1 10 ३१४६४ ३११५० ३१४६४ ३१४३३ ३१३७८ ०.५
10 १०० ३१३६३८ ३२०७१२ ३११९४३ ३११९४३ ३१४५५९ १.३
१०० १००० २८४५७३६ २८४००३१ २८८२००६ २८६४०५२ २८५७९५६ ०.७
सान्द्र राशि पेप 6 पीक क्षेत्रों (तालिका 3d)
एनएम) ऑन-कॉलम (fmoles) Rep01 Rep02 Rep03 Rep04 मतलब RSD (%)
०.१ 1 ४९० ५८३ ४४० ४४० ४८८ १३.८
1 10 ६४२९ ६४२९ ६८४८ ६६२३ ६५८२ ३.०
10 १०० ७१२९५ ७०४०० ७१५६३ ७०४०० ७०९१५ ०.९
१०० १००० ७०७६४० ७०७६४० ६९४४६१ ७२९४९० ७०९८०८ २.०

तालिका 3. तालिका एच एस-MRM chromatograms के शिखर क्षेत्रों से युक्त 4 फोटो पेप्टाइड्स (स्फूर्ति 2, 4, 5, और 6) के लिए प्रत्येक नियंत्रण रेखा/ms इंजेक्शन (16 नियंत्रण रेखा के लिए दर्ज की गई और 4 सांद्रता परीक्षण) ।
सापेक्ष मानक विचलन की जांच की पूरी एकाग्रता रेंज पर सभी पेप्टाइड्स के लिए 15% से बेहतर था ।

Figure 1
चित्र 1. एक HS-MRM प्राप्ति विधि सेट अप करने के लिए आवश्यक तीन चरणों का सारांश वर्कफ़्लो आरेख. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 1
चित्र 2. HDMSE डेटा का उदाहरण:
(क) कम ऊर्जा स्पेक्ट्रम स्फूर्ति 6 प्रणेता आयन दिखा । (ख) एक ही पेप्टाइड के उच्च ऊर्जा विखंडन स्पेक्ट्रम, शीर्ष 3 सबसे प्रचुर मात्रा में टुकड़ा आयनों प्रदर्शित (घेरे) तोफ-MRM टकराव ऊर्जा अनुकूलन के लिए चयनित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 1
चित्र 3. एक तोफ-MRM अनुकूलन प्रयोग स्थापित करने के लिए प्रयुक्त पैरामीटर्स ।
प्रत्येक संक्रमण के लिए, ग्यारह टकराव ऊर्जा (16 से ३६ वी की सीमा में) का परीक्षण किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 1
चित्र 4. अंतिम HS-MRM विधि का उदाहरण ।
कई मापदंडों प्रत्येक "संक्रमण के लिए आवश्यक हैं," पेप्टाइड प्रणेता एम सहित/जेड, अपने प्रभारी राज्य और आयन गतिशीलता बहाव समय, सबसे प्रचुर मात्रा में टुकड़ा आयन के एम/जेड, इष्टतम टक्कर ऊर्जा, और एमएस अधिग्रहण समय । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 5. HS-MRM dataset का विश्लेषण करने के लिए संसाधन विधि द्वारा उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स ।
प्रत्येक पेप्टाइड एक एकल "संक्रमण" द्वारा वर्णित की निगरानी की है पेप्टाइड प्रणेता m/z, प्रभारी राज्य, और उंमीद प्रतिधारण समय के साथ, सबसे प्रचुर मात्रा में टुकड़ा और उसके प्रभारी राज्य के एम/जेड के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 6. आयन गतिशीलता जन स्पेक्ट्रोमीटर के आरेख ।
एच एस-MRM अधिग्रहण मोड में, quantified जा रहा है कि पेप्टाइड के अग्रदूतों आयन गतिशीलता सेल में अन्य सह-eluting (हस्तक्षेप) पेप्टाइड पुरोगामी से अलग कर रहे हैं, quadrupole द्वारा पृथक, और में एक निश्चित टक्कर ऊर्जा के साथ खंडित टक्कर सेल । पेप्टाइड टुकड़ा आयनों द्वारा उत्पादित संकेत धक्का आवृत्ति का समायोजन करके बढ़ाया है, और पेप्टाइड ठहराव उच्च एमएस संकल्प का उपयोग किया जाता है (> 30, 000) प्रत्येक पेप्टाइड के सबसे तीव्र टुकड़ा आयन द्वारा उत्पादित संकेतों. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 7. एच एस-MRM chromatograms 4 अलग सांद्रता पर 4 फोटो पेप्टाइड्स के लिए दर्ज की परिमाण के 3 आदेश फैले (०.१, 1, 10, और १०० एनएम) ।
(क) स्फूर्ति २ chromatograms, (ब) स्फूर्ति ४ chromatograms, (ग) स्फूर्ति ५ chromatograms, तथा (घ) स्फूर्ति ६ chromatograms । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 1
चित्र 8. 4 अलग सांद्रता (०.१, 1, 10, और १०० एनएम) भर में 4 फोटो पेप्टाइड्स के लिए अंशांकन घटता है ।
प्रत्येक वक्र के अंतर्गत तालिकाएँ प्रत्येक इंजेक्शन के लिए रिकॉर्ड किए गए व्यक्तिगत पीक क्षेत्रों (Y-मानों) को प्रदर्शित करती हैं, जबकि प्रत्येक तालिका से दूसरा स्तंभ अपेक्षित रेखीय प्रतिसाद से प्रतिशत विचलन दिखाता है. (A) स्फूर्ति 2 अंशांकन, (ख) स्फूर्ति 4 अंशांकन, (ग) स्फूर्ति 5 अंशांकन, और (D) स्फूर्ति 6 अंशांकन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

उच्च संकल्प (रुपये > 20, 000) मास स्पेक्ट्रोमेट्री नियमित रूप से साधन प्लेटफार्मों की एक किस्म पर चिकित्सकीय प्रोटीन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए प्रयोग किया जाता है । इसके विपरीत, MS-आधारित प्रोटीन ठहराव को आम तौर पर टेक्सटाइल्स/MRM द्वारा कम-रिज़ॉल्यूशन (Rs ~ १,०००) पर निष्पादित किया जाता है quadrupole जन स्पेक्ट्रोमीटर प्रोटीन के एंजाइमी दरार द्वारा उत्पन्न हस्ताक्षर पेप्टाइड्स का उपयोग करते हुए11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. के रूप में एकल आयाम क्रोमेटोग्राफिक जुदाई पूरी तरह से जटिल पेप्टाइड एंजाइमी पाचन द्वारा उत्पादित मिश्रण को हल नहीं कर सकते, पेप्टाइड सह-रेफरेंस एक आम घटना है, यहां तक कि एक एकल प्रोटीन डाइजेस्ट के मामले में । बहुत जटिल प्रोटीन डाइजेस्ट के लिए (जैसे, चिकित्सीय प्रोटीन द्वारा उत्पादित पेप्टाइड-युक्त पृष्ठभूमि की उपस्थिति में HCPs के 1-100 ppms के ठहराव के लिए), संवेदनशीलता, सटीकता, या इस टेक्सटाइल्स की रैखिकता/MRM परख से प्रभावित हो सकते हैं हस्तक्षेप.

टेक्सटाइल्स/MRM परख संकते selectivity है, केवल एक "अद्वितीय" अग्रदूत के संयोजन के पर निर्भर/ इस कारण से, इन परख स्थितियों में विफल जब पेप्टाइड पृष्ठभूमि अप्रत्याशित रूप से बदलताहै (उदा, विभिंन शोधन प्रक्रियाओं से प्राप्त करने के लिए, अंय दवाओं के नमूनों के लिए) । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम यहां एक उच्च selectivity (एच एस) MRM परख एक आयन गतिशीलता पर लागू-सक्षम उच्च संकल्प quadrupole समय के उड़ान (QTOF) संकर जन स्पेक्ट्रोमीटर (साधन आरेख के लिए, चित्र 6 देखें) ।

साधन अंय सह eluting से ब्याज की पेप्टाइड के अग्रदूतों को अलग करता है (हस्तक्षेप) आयन गतिशीलता सेल में पेप्टाइड अग्रदूत, quadrupole में अग्रदूत साबित की पूरी isotopic लिफाफा अलग, और यह एक निश्चित CE के साथ टुकड़ों में... टक्कर सेल । इसके सबसे प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड टुकड़ा द्वारा उत्पादित संकेत आगे एक पूर्ण स्कैन के साथ के रूप में, बजाय सभी आयनों, उड़ान ट्यूब में ब्याज की बड़े पैमाने पर क्षेत्रों धक्का है जो, पुश आवृत्ति (लक्ष्य वृद्धि) का समायोजन करके बढ़ाया है. पेप्टाइड ठहराव उच्च-MS-संकल्प का उपयोग किया जाता है (Rs ~ ३०,०००) इस टुकड़े आयन द्वारा उत्पादित संकेत । टेक्सटाइल्स के साथ तुलना/MRM परख, एच एस-MRM परख selectivity के दो अतिरिक्त स्तर प्रदान करता है: एक प्रणेता स्तर आयन गतिशीलता जुदाई द्वारा प्रदान की जाती है, जबकि दूसरी तोफ विश्लेषक की वृद्धि हुई जन संकल्प द्वारा की पेशकश की है । इन selectivity सुधार द्वारा लाया परिणाम एच एस-MRM chromatograms में प्रदर्शित चित्र 7 में दिखाई दे रहे हैं, जो परिमाण के तीन आदेशों में हस्तक्षेप से मुक्त हैं ।

टेक्सटाइल्स के विपरीत/MRM परख, वहां कई पैरामीटर है कि एच एस-MRM परख का अनुकूलन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है: पेप्टाइड अग्रदूत के आसपास आरटी खिड़की (आमतौर पर ०.२ मिनट में सेट), quadrupole अलगाव विंडो (4 डीए), बहाव-समय खिड़की के आसपास प्रणेता (इसी आयन mobilogram से प्रणेता शिखर का ± FWHM), और अंश आयन (20000-40000) का एमएस रेजोल्यूशन । एच एस-MRM परख बहुत संवेदनशील होते हैं: प्रत्येक फोटो पेप्टाइड्स के लिए सबसे कम पहचान की गई राशि है 1 femtomole पर-स्तंभ (या ०.१ एनएम के संदर्भ में पेप्टाइड एकाग्रता). जब पेप्टाइड मेगावाट पर विचार (सटीक मेगावाट बिजली के लिए तालिका 1 देखें), पर पता चला राशि कॉलम 1-2 स्नातकोत्तर के आदेश पर है, जबकि कॉलम एक काफी अधिक राशि (2 µ जी) मॉब डाइजेस्ट से पृष्ठभूमि पेप्टाइड्स के साथ भरी हुई है ।

पूर्ण लंबाई फोटो प्रोटीन के आणविक वजन (९७.२ केडीए), जहां से नुकीला पेप्टाइड्स व्युत्पंन थे पर विचार करके, परख के लिए उच्च बहुतायत पृष्ठभूमि आयनों की उपस्थिति में एक प्रोटीन नापाक की ५० पीपीएम का पता लगाने में सक्षम है । पता लगाने की निचली सीमाएं (5-10 पीपीएम) कम आणविक भार HCPs (10-20 केडीए) के लिए प्राप्त कर रहे हैं । परख परिमाण के तीन आदेश शामिल है (जैसा कि 8 चित्रा से अंशांकन curves में दिखाया गया है), जिसका अर्थ है कि यह 1 में HCPs उपाय कर सकते है-1000 पीपीएम रेंज । इसके अलावा, एच एस के reproducibility-MRM परख, 3 तालिका में सचित्र, छोटे अणु टेक्सटाइल्स के reproducibility के साथ बहुत अच्छी तरह से मेल खाता है/MRM परख, चोटी क्षेत्र RSDs 15% से बेहतर है ।

हम एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी में नुकीला पेप्टाइड मानकों के ठहराव के लिए एक उपंयास परख की क्षमताओं का पता लगाया (मॉब) डाइजेस्ट और अपनी संवेदनशीलता और उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए व्यापक गतिशील रेंज कवर (परिमाण के ंयूनतम तीन आदेश) आम तौर पर HCP विश्लेषण में सामने आया । सभी छह पेप्टाइड मानकों सांद्रता पर पाया गया के रूप में कम के रूप में ०.१ एनएम (एक २.१-mm आईडी क्रोमेटोग्राफिक कॉलम पर लोड 1 femtomole) एक उच्च बहुतायत पेप्टाइड पृष्ठभूमि की उपस्थिति में (एक मॉब डाइजेस्ट के 2 µ जी पर लोड-कॉलम) । दोनों लक्षित HRMS और आयन गतिशीलता प्रणेता जुदाई को शामिल करके, एच एस-MRM परख एक तेजी से बनने के लिए महान क्षमता है, उच्च प्रवाह कई HCPs के लिए निगरानी परख के कई बैचों में ।

Disclosures

सभी लेखक जल निगम के कर्मचारी हैं, जो इस लेख में प्रयुक्त कई रिएजेंट और उपकरणों के निर्माता हैं.

Acknowledgments

लेखक Lesley Malouin और टोनी Catlin जल निगम से पांडुलिपि का आंकड़ा 6 तैयार करने के लिए धंयवाद देना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vion IMS Qtof mass spectrometer Waters 186009214
Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM) Waters 186015041
Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM) Waters 186015040
Acquity H-Class Column Manager (CM) Waters 186015043
Acetonitrile (ACN) Fisher Chemical A996-4
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 40867-50G-F
2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 µm particles Waters 186005298
Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich D5545-5G
Formic acid, eluent additive for LC/MS Sigma Aldrich 56302-10X1ML-F
Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard Waters 186006011
Iodoacetamide (IAM) Sigma Aldrich I-1149-5G
LC vials (12x32 mm glass vials, screw neck) Waters 186000327c
Leucine Enkephalin acetate salt hydrate Sigma Aldrich L9133-10MG
Protein LoBind 2.0 mL tubes (2x50) Eppendorf 22431102
RapiGest SF Waters 186001861
Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 µg) Promega V5073
Water, LC/MS grade Sigma Aldrich 39253-1L-R

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