Summary
Här, beskriver vi en kromatografisk analys tillsammans med ion rörlighet avskiljandet av peptid prekursorer följt av högupplösta (~ 30,000) MS-detektion av peptidfragment för kvantifiering av spetsiga peptid standarder i en monoklonal antikropp Digest.
Abstract
Analysen av lågaktivt (1-100 ppm) protein orenheter (t.ex. värdcellen proteiner (sjukvårdspersonal)) i protein biotherapeutics är en utmanande analys som kräver hög känslighet och ett brett dynamiskt omfång. Mass spectrometry-baserade kvantifiering analyser för proteiner omfattar vanligtvis protein matsmältningen följt av selektiv reaktion övervakning/flera reaktionen övervakning (SRM/MRM) kvantifiering av peptider med en lågupplöst (~ 1000 Rs)-tandem quadrupole masspektrometer. En av begränsningarna med denna metod är fenomenet störningar observerats när peptiden sevärdheter har ”samma” föregångare och fragment massan (när det gäller m/z-värden) som andra co eluerande peptider i provet (inom en 1-Da fönster). För att undvika detta fenomen, vi föreslår ett alternativt massa spektrometriska tillvägagångssätt, en analys av hög selektivitet (HS)-MRM som kombinerar ion rörlighet avskiljandet av peptid prekursorer med högupplösta (Rs ~ 30,000) MS detektion av peptidfragment. Vi utforskade funktionerna i denna strategi att kvantifiera låg-överflöd peptid standarder spetsade i en monoklonal antikropp (mAb) digest och visat att det har känslighet och dynamiskt omfång (minst 3 tiopotenser) vanligtvis uppnås i HCP analys. Alla sex peptid standarder upptäcktes vid koncentrationer så låg som 0,1 nM (1 femtomole lastas på en 2,1-mm ID HPLC-kolonn) i närvaro av en hög-överflöd peptid bakgrund (2 µg av en mAb digest lastas på-kolumn). När man överväger MW av kanin phosphorylase (97,2 kDa), från vilken de spetsade peptiderna har framställts, är Kvantifieringsgränsen för denna analys lägre än 50 ppm. Relativa standardavvikelser (RSD) peak områden (n = 4 replikat) var mindre än 15% över hela koncentrationen undersökt (0,1-100 nM eller 1-1000 ppm) i denna studie.
Introduction
Kvantifiering av stora biomolekyler (proteiner) i industriella miljöer bygger för närvarande på immunanalyser (t.ex. ELISA-test), främst på grund av flera fördelar: känslighet, hög genomströmning, välbefinnande-av-använda och låg kostnad per prov. När tillämpas för att analysera de låg-överflöd protein föroreningarna (1-100 ppm av värdcellen proteiner (sjukvårdspersonal)) som förekommer i protein therapeutics, ger dessa biologiska testmetoder normalt den totala HCP koncentrationen (oftast uttryckt i ppm eller ng HCP/mg mAb), men de kan inte identifiera och mäta enskilda HCP föroreningar. Flera MS-baserade analyser har nyligen utvecklats att komplettera ELISAs eller att tillhandahålla information som ELISAs misslyckas att erbjuda1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. på grund av provet komplexitet och kravet på att upptäcka HCP peptider över ett brett dynamiskt omfång i koncentration (minst 3 tiopotenser), flerdimensionella kromatografiska metoder anbudsförfarande omfattande prov fraktionering har traditionellt använts för att identifiera låg-överflöd sjukvårdspersonal1,2,3,4,5,6,7.
Ett naturligt steg efter HCP identifiering och validering är HCP spårning (övervakning) över flera partier av biologiska läkemedel. I det här fallet har enda dimension LC/MS-metoder föreslagits att förbättra prov genomströmning8,9. Noggrannhet och dynamiskt utbud av HCP mätningar kan dock påverkas i en 1D LC/MS-analys av överväldigande förekomsten av biofarmaceutiska peptider. Jämfört med en flerdimensionell separation, potentialen för signal störningar19,20,21,22 ökas i en enda dimension kromatografisk separation eftersom sannolikheten för Mer peptid prekursorer vara co eluerande ökas. Införlivandet av ortogonal betyder för att separera peptid prekursorer utan förlänger kromatografisk separation tiden vore klart fördelaktigt. Reser våg ion rörlighet (TWIM)10 har förmågan att lösa överbelastade MS spectra i millisekunder. Cirka 500 rörlighet separationer kan utföras under elueringen av en enda peptid, förutsatt att en full kromatografiska topp bredd 10 s och med tanke på att körningen av ett IM separation på ion rörlighet instrumentet är 20 ms.
Massa spektrometriska analyser för protein kvantifiering har utvecklats framgångsrikt under senaste decenniet använder den väl accepterade valt (flera) reaktion övervakning tillvägagångssätt (SRM/MRM metod) genomförs på tandem masspektrometrar11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23. En av begränsningarna i denna lågupplösta massa spektrometriska analys är störningar fenomen19,20,21,22 observerats när peptiden sevärdheter har ”samma” föregångare och fragment finns massa andra co eluerande peptider i provet (inom en 1-Da fönster). Det finns två sätt att förbättra noggrannheten av SRM/MRM metoder: en alternativ innebär ett extra separation steg på föregångaren nivå ta bort störande föregångare joner, medan det andra alternativet är att öka MS upplösningen av föregångare/fragment upptäckt att Undvik överlappande MS signaler. Den hög-selektivitet (HS) MRM förvärv läge beskrivs här tar fördel av båda dessa metoder av koppling ion rörlighet avskiljandet av peptid prekursorer med högupplösta (Rs ~ 30,000) MS detektion av peptidfragment. Analysen beskrivs här täcker minst tre storleksordningar, som är det dynamiska omfånget vanligen observerats i SRM/MRM proteomik experiment17,18,24.
Nyttan av HS-MRM analysen för HCP kvantifiering demonstrerades genom att övervaka signalen produceras av sex peptid standarder spetsade vid olika koncentrationer (0,1 - till 100-nM räckvidd) i en monoklonal antikropp digest linearitet.
Protocol
1. beredning av infliximab digest (~ 24 h förfarande)
- Förbereda färska lösningar av 50 mM hjorthornssalt, 1% anjon-ytaktivt ämne i 50 mM NH4HCO3, 500 mM Ditiotreitol (DTT) i 50 mM NH4HCO3och 500 mM iodoacetamide (IAM) i 50 mM NH4HCO3.
- Till 750 μl 50 mM NH4HCO3, tillsätt 200 µL av infliximab mAb (10 mg/mL) och 50 µL av 1% anjoniska ytaktiva lösning och denaturera proteinet för 15 min vid 60 ° C i närvaro av 0,05% anjon-ytaktivt ämne.
- Tillsätt 40 µL 500 mM DTT och minska urvalet för 60 min vid 60 ° C i närvaro av 20 mM DTT.
- Tillsätt 20 µL av 500 mM IAM och Alkylatbensin provet för 30 min i rumstemperatur i mörkret i närvaro av ~ 10 mM IAM.
- Lägg till innehållet i mikrocentrifug röret i en injektionsflaska av glas innehållande 20 µg av MS sekvensering-klass Lys C/trypsin och smälta provet för 3 h vid 37 ° C.
- Lägga till en andra enzym alikvotens (20 µg) genom att överföra smält provet till en annan injektionsflaska av glas innehållande 20 µg MS sekvensering-klass Lys C/Trypsin och digest provet över natten (12-15 h) vid 37 ° C.
- Efter den natten proteolys, tillsätt 5 µL av 100% myrsyra (FA) och inkubera digest under 30 minuter vid 37 ° C sönderdelas den sura labila anjon-ytaktivt ämnen.
- Snurra ner digest för 15 min vid 4000 x g i en centrifug utfällning olösliga komponenten av de anjon-ytaktivt ämnen.
- Återställa ~ 1000 µL av infliximab digest och placera den i en LC auto-sampler injektionsflaska; digest koncentrationen bör ~ 2 mg/mL. Förvaras digest i frys vid-20 ° C tills det LC/MS-systemet är redo för analys.
2. tillsatta av peptid standarder (~ 30 min)
- Tina infliximab digest genom att placera frusna provet i glasflaskan på en bänk vid rumstemperatur.
- Tillsätt 1 mL 0,1% FA i H2O en kanin phosphorylase b (PHO) digest injektionsflaska att förbereda 1 µM stamlösningar för alla sex peptid standarder från PHO innehöll i injektionsflaskan (injektionsflaskan innehåller 1 nmol av varje peptid).
- Förbered 4 x 1 mL utspädningar av PHO stamlösning att erhålla lösningar innehållande 0,1, 1, 10 och 100 nM peptider, med 0,1% FA som utspädning lösningsmedlet. Förbereda alla utspädningar i injektionsflaskor av glas (LC auto-sampler flaskor) och tillsätt 100 µL av infliximab digest som matrisen bakgrunden till alla injektionsflaskor. Belastning 2 µg sammanfattad bakgrund på-kolumn för varje 10-µL injektion. Förbereda ett blindprov som innehåller den utspädda infliximab digest (samma 1:10 utspädning), med inga spetsiga peptider.
3. inställning av förvärvsmetoden LC/HDMS E data
Obs: Arbetsflödet sammanfatta stegen som krävs för att ställa in ett HS-MRM förvärv som avbildas i figur 1 och beskrivs i detalj i avsnitt 3-6. Förvärvet av en data-oberoende HDMSE datamängd är skyldig att upprätta retentionstiden för varje övervakade peptid, förälder m/z av de vanligast förekommande peptid Jon efter elektrospray jonisering, och motsvarande CCS (lett kors avsnitt) härrör från ion rörlighet separation. Data-oberoende datamängden innehåller dessutom information om m/z av de tre vanligast förekommande fragment jonerna för varje peptid föregångare. I det andra steget i arbetsflödet (CE optimization) ökas analysens känslighet genom att trimma kollision cell energi för att få högsta ion intensiteten för varje fragment ion. Slutligen, i det sista steget, alla parametrar beskrivs ovan introduceras till HS-MRM metod redaktör för varje peptid som övervakas.
- Utföra LC/MS experiment på en quadrupole time-of-flight (QTOF) masspektrometer kopplad till ett ultra-Vätskekromatografisystem använda en data-oberoende förvärvsmetoden (HDMSE).
Obs: Mer detaljer om instrumentet konfiguration finns i avsnittet Material. Detta instrument använder ett resande våg ion förflyttningshjälpmedel för separation av peptid prekursorer10. - Förbered två mobila faser som innehåller 0,1% FA i vatten (lösningsmedel A) och 0,1% FA i acetonitril (lösningsmedel B).
Obs: Använd en laddad yta hybrid (CSH) C18 kolumn (2,1 x 150 mm, packad med 1,7 µm partiklar) för separation av de spetsiga mAb smälter. - I data förvärv programvaran, klicka på ”Skapa/analys-metod” och välja – generera ett förvärv och bearbetningsmetod. Skriv metodens namn, bläddra till mappen metod (katalog) och klicka på ”Nästa”.
- Om ”typ av analys”, välja ”peptid karta (IMS)”, och välj ”Kvartära lösningsmedel Manager” instrumentet i fliken ”Instrument System”. Redigera de övertoningsinställningarna att uppnå peptid separation med en flödeshastighet av 200 µL/min. Använd en gradient eluering från 1 till 40% lösningsmedel B i 30min följt av en 2-min kolumn tvätt och en 9-min Jämviktstiden, med en total körtid av 50 min. införa dessa experimentella parametrar i redigeraren för LC-metoden.
- Välj instrumentet ”Sample Manager” i fliken ”Instrument System”. Ange provtemperaturen till 10 ° C och kolumnen temperaturen till 60 ° C.
- Driva den QTOF masspektrometer i positiv Jon ESI känslighet läge, med en typisk upplösningsstyrka 30.000 FWHM.
Obs: LC/HDMSE är ett data-oberoende förvärv (DIA) läge som fungerar genom att snabbt samla skanningar med omväxlande kollision energier (i cellen kollision) mellan en låg energi (6 V för MS kanal 1 scannar) och en förhöjd energi (15 - till 40-V ramp till producera den fragmentering spectra utan föregångare val i MS kanal 2).- Ange standardparametrar källa-relaterade MS i programvaran data förvärv: ”mitt arbete/Instrument System”, Välj fliken ”Vion IMS Qtof” och ange dessa parametrar i menyn ”Verktyg”: 3,0 kV kapillär spänning, 100 ° C källkod temperatur, 100 V källa 50 L/h offset, och kon gasflödet och 40 V kon spänning. Ställa in desolvering temperaturen till 250 ° C, desolvering gasflödet till 500 L/h och den kapillära referensspänningen till 3,0 kV.
- I data förvärv programvaran, klicka på ”Skapa/analys-metod” och välja – generera ett förvärv och bearbetningsmetod. Ange metodnamnet och bläddra till mappen metod (katalog) och klicka sedan på ”Nästa”.
- Om ”typ av analys”, välja ”peptid karta (IMS)”, och välj ”Vion IMS QTof” instrumentet i fliken ”Instrument System”. Klicka på ”Finish”.
Obs: Metoden nyskapade LC/HDMSE öppnas automatiskt på skärmen ”instrumentet metod Configuration”. - Ange dessa parametrar i fliken ”Inställningar”: 3,0 kV kapillär spänning 100 ° C källkod temperatur, 250 ° C desolvering temperatur, 50 L/h kon gasflödet och 500 L/h desolvering gasflödet.
- Inställningarna på fliken ”Experiment”, Välj ”High Definition MSE” och välj ”analys metod runtime”. Ange dessa parametrar i fliken ”Scan settings”: låg massa, 100; Högmässa, 2,000; och scan tid, 400 ms. i fliken ”CE” skriver du ”6 V” för låg energi och välja en high-energy ramp från 15 till 40 V. se till att ha ”inaktivera data minskning” kontrolleras.
- Ingjuta en lösning av 50 ng/mL leucin enkephalin (LE) beredd i 50% acetonitril med 0,1% FA med en flödeshastighet av 10 µL/min för lås-massa kalibrering under datainsamling.
Obs: Lås-massa data förvärvas varje 5 min med samma förvärv takt över samma massa intervall.
- Analysera 10-nM, PHO-spetsade provet med LC/HDMSE analys beskrivs ovan genom att injicera 10 µL prov (lastas på-kolumnen är 100 fmol för varje peptid som standard).
4. inställning av Tof-MRM metoden för kollision energioptimering (CE)
- Från LC/HDMSE datamängden, få retentionstiden, föregångare och fragment ion m/z för varje PHO peptid. Behålla m/z och tillståndet kostnad för den vanligast förekommande föregångare ion och de motsvarande tre vanligast förekommande fragmenterar joner.
Observera: Ett exempel på låg energi och high-energy spectra normalt inspelad av LC/HDMSE analysen presenteras i figur 2. - Använda kollision energioptimering (CE) i SRM/MRM experiment för att få den bästa signalen för varje peptid23.
- I data förvärv programvaran, klicka på ”Skapa/analys-metod” och välja – generera ett förvärv och bearbetningsmetod. Skriv metodens namn, bläddra till mappen metod (katalog) och klicka på ”Nästa”.
- Om ”typ av analys”, välja ”kvantifiera”. Plocka ”kvantifiera Assay Tof 2D kromatografiska” och klicka ”Nästa”. Markera ”Vion IMS QTof” i fliken ”Instrument System” och klicka på ”Finish”.
Obs: Metoden nyskapade Tof-MRM öppnas automatiskt på skärmen ”instrumentet metod Configuration”. - Ange dessa parametrar i fliken ”Inställningar”: 3,0 kV kapillär spänning 100 ° C källkod temperatur, 250 ° C desolvering temperatur, 50 L/h kon gasflödet och 500 L/h desolvering gasflödet.
- I inställningarna på fliken ”Experiment”, Välj ”funktionen Table” och välja ”en eller flera MS, maskinförare eller MRM funktioner”. Med nedåtpilarna, ställa in en ”Tof-MRM” funktion för varje peptid genom att ange tre ”övergångar” (kombinationer av de vanligast förekommande föregångaren och tre av dess mest överflödande fragment-joner).
Obs: I Tof-MRM-läge, den högsta känsligheten uppnås med en schemalagd MRM-metod. - I redigeraren ”Tof-MRM” funktion, välja en kvarhållande tidsfönster för varje peptid (minst 1 min lång), ordnat enligt ordern peptid eluering. I redigeraren ”Tof-MRM” funktion, infoga peptid föregångare m/z och produkten m/z; Välj fönstret quad isolering som ”låg” (4-Da fönster) för peptid föregångaren; Välj en fast bildläsningstid av 100 ms; och välja tolv olika kollision energivärden i intervallet 14-36 V, som följer: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 och 36, som visas i exemplet från figur 3.
Obs: Med Tof-MRM metoden som beskrivs ovan, minst 10 datapunkter per kromatografiska topp samlas för varje övergång på varje CE som anges. För att minska storleken på data-fil, Välj alternativet ”brett” (6-Da fönster) för signalera av fragmentet jonen. Exempel på CE-optimerade värden visas i tabell 2. - Analysera 10-nM, PHO-spetsade provet med Tof-MRM analys beskrivs ovan genom att injicera 10 µL prov (lastas på-kolumnen är 100 fmol för varje peptid som standard).
5. inställning av slutliga HS-MRM förvärvsmetoden för peptid kvantifiering med hjälp ion rörlighet separation av peptid prekursorer
- I menyn ”undersöka” av programvaran data förvärv, Visa alla 11 kromatografiska spår genereras för varje CE för varje peptid och integrera topparna med hjälp av ”integrera” knappen från verktygsfältet ”bearbetning alternativ/operationer”; högsta topp område indikerar den bästa CE för varje övergång.
- Visuellt jämföra de bästa topp-områdena för 3 fragment av varje peptid och behålla endast bästa ”övergången” (fragment jonen som producerar mest intensiva signalen); Tabell 2 visar bästa ”övergångar” erhålls från fyra PHO peptider.
- Setup en HS-MRM metod som innehåller endast ett fragment ion per peptid. Använda CCS värdena för varje peptid föregångare från LC/HDMSE datamängden.
- Ändra metoden Tof-MRM skapade i föregående avsnitt (avsnitt 4) genom att välja funktionen ”HS-MRM” istället för ”Tof-MRM” funktionen.
- I redigeraren ”HS-MRM” funktionen, ange följande föregångare-relaterade parametrar: m/z, quadrupole upplösning: låg (4 Da), debitera staten, föregångare CCS värde och föregångare CCS upplösning: låg. För den produkt ion, ange dess m/z, den optimala kollision energin, välja en bildläsningstid av 0,4 s och välj ”spektrum” inställningen (6 Da) att omfatta alla dess isotoper. Ett exempel på slutliga HS-MRM förvärvsmetoden för alla fyra peptider presenteras i figur 4.
- Analysera alla prover med metoden HS-MRM börjar med mAb digest tomt (icke-spetsade prov), följt av 4 replikera injektioner (10 µL varje) av följande koncentrationer: 0,1, 1, 10 och 100 nM PHO peptider.
6. skapandet av en metod för analys av HS-MRM datamängden
- Skapa en metod för analys av HS-MRM datamängden.
- Klicka på fliken ”syfte” i analysmetod som skapats för förvärvsmetoden ”HS-MRM” data, och välj ”Hantera komponenter”.
- Från den nedrullningsbara menyn under ”Experiment Type”, Välj alternativet ”HS MS/MS/HS-MRM”.
- Klicka på ”Skapa/New Entry” och införa följande parametrar i redigeraren bearbetning metod: peptid retentionstid (RT), föregångare kostnad stat, föregångare m/z och föregångare drift tid (DT). För fragment jonen, ange dess m/z och avgift tillstånd och ange ”XIC” tracen som läge för utvinning.
- I fliken ”syfte” i samma ”HS-MRM” förvärvsmetoden, klicka på ”Default belopp” och ange följande koncentrationer: 0,1, 1, 10 och 100 nM PHO peptider.
- Ange följande parametrar i ”bearbetning/extraktion inställningar”: massa Standardtoleransen, 10 ppm (för m/z av alla fragment joner) och standard glida tid, 5%. ett exempel på den PHO peptid bearbetningsmetod visas i figur 5.
- Välj linjär kurva montering med 1 / X2 viktning för typ av kalibrering.
- Behandla HS-MRM uppgifterna att integrera alla kromatogram och konstruera kalibreringskurvorna av varje PHO peptid.
Representative Results
De enskilda sekvenserna av sex phosphorylase b peptid standarderna i PHO peptid blandningen visas i tabell 1, tillsammans med deras retentionstider och deras vanligast förekommande prekursorer som observerats i HDMSE experimentera. Det första steget i utvecklingen av en hög-selektivitet (HS) MRM analysen är förvärvet av en HDMSE datamängd att upprätta eluering tider av varje PHO peptid, tillsammans med dess motsvarande mest riklig föregångare och de tre vanligast förekommande fragment. Figur 2 visar HDMSE spektra förvärvades till en av de PHO peptiderna (Pep 6) spetsade i infliximab digest. Efter att de 3 bästa ”övergångar” (kombinationer av föregångare och fragment massorna) för varje peptid, utförs ett Tof-MRM experiment för att hitta den optimala kollision energin att maximera de signaler som genereras för varje peptid. Resultaten av CE optimering experimentet sammanfattas i tabell 2. Slutliga HS-MRM analysen (se figur 4) behåller bara bästa ”övergången” för varje peptid och används för att analysera alla spetsiga prover. Exempel på HS-MRM kromatogram genereras för 4 PHO peptider över alla de koncentrationer som undersökt presenteras i figur 7. Fyra kalibreringskurvor erhållna varje peptid efter integrationen av HS-MRM topparna lyfts fram i figur 7 visas i figur 8. Dessutom summeras peak området relativa standardavvikelsen beräknad utifrån 4 replikera injektioner, i 4 tabeller visas i tabell 3.
| Peptid | Peptid | Retention | Laddningstillstånd | ||||
| ID | Sekvens | tid (min) | + 1 | + 2 | + 3 | + 4 | |
| PEP 1 | VLYPNDNFFEGK | 19,4 | 1442.6951 | 721.8512 | 481.5699 | 361.4292 | |
| PEP 2 | TCAYTNHTVLPEALER | 16,0 | 1874.9065 | 937.9569 | 625.6404 | 469.4821 | |
| PEP 3 | IGEEYISDLDQLRK | 18,9 | 1678.8646 | 839.9360 | 560.2931 | 420.4716 | |
| PEP 4 | LLSYVDDEAFIR | 21,1 | 1440.7369 | 720.8721 | 480.9172 | 360.9397 | |
| PEP 5 | LITAIGDVVNHDPVVGDR | 19,7 | 1890.0080 | 945.5076 | 630.6742 | 473.2574 | |
| PEP 6 | VFADYEEYVK | 17,7 | 1262.5939 | 631.8006 | 421.5362 | 316.4039 | |
Tabell 1. PHO peptid normerna i massa PREP mix spetsade i infliximab digest. Peptid retentionstider och deras vanligast förekommande prekursorer (markerade med fetstil) visas i tabellformat.
| Peptid | Peptid | Retention | Peptid föregångare | Vanligast förekommande fragment joner/laddning | Optimal | ||||
| ID | Sekvens | tid (min) | m/z & kostnad | Drift tid (ms) | Jag | II | III | CE (V) | |
| PEP 2 | TCAYTNHTVLPEALER | 16,0 | 625.6404 (+ 3) | 6.2 | 714.3781 (+ 1) | 807.4177 (+ 2) | 827.4621 (+ 1) | 24 | |
| PEP 4 | LLSYVDDEAFIR | 21,1 | 720.8721 (+ 2) | 7.5 | 865.4050 (+ 1) | 964.4734 (+ 1) | 1214.5688 (+ 1) | 22 | |
| PEP 5 | LITAIGDVVNHDPVVGDR | 19,7 | 630.6742 (+ 3) | 6.3 | 642.3570 (+ 1) | 689.8391 (+ 2) | 832.4236 (+ 2) | 20 | |
| PEP 6 | VFADYEEYVK | 17,7 | 631.8006 (+ 2) | 7.0 | 830.3931 (+ 1) | 945.4200 (+ 2) | 1016.4571 (+ 1) | 24 | |
Tabell 2. Resultat av Tof-MRM optimering experimentet: de tre vanligast förekommande fragment av varje PHO peptid kvantifieras i denna studie anges, tillsammans med motsvarande optimerad kollision energi.
| Conc | Belopp | PEP 2 Peak områden (tabell 3A) | |||||
| (nM) | på-kolumn (fmoles) | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | Menar | RSD (%) |
| 0,1 | 1 | 490 | 439 | 462 | 431 | 456 | 5.8 |
| 1 | 10 | 5121 | 4842 | 5198 | 4842 | 5001 | 3.7 |
| 10 | 100 | 63853 | 64279 | 66111 | 62509 | 64188 | 2.3 |
| 100 | 1000 | 612392 | 605553 | 613229 | 611004 | 610545 | 0,6 |
| Conc | Belopp | PEP 4 Peak områden (tabell 3B) | |||||
| (nM) | på-kolumn (fmoles) | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | Menar | RSD (%) |
| 0,1 | 1 | 275 | 359 | 325 | 288 | 312 | 12.2 |
| 1 | 10 | 3559 | 3694 | 3287 | 3754 | 3574 | 5.8 |
| 10 | 100 | 45259 | 45775 | 42976 | 45548 | 44890 | 2,9 |
| 100 | 1000 | 459374 | 467927 | 436272 | 458994 | 455642 | 3.0 |
| Conc | Belopp | PEP 5 Peak områden (tabell 3 c) | |||||
| (nM) | på-kolumn (fmoles) | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | Menar | RSD (%) |
| 0,1 | 1 | 3194 | 3243 | 3202 | 3257 | 3224 | 1.0 |
| 1 | 10 | 31464 | 31150 | 31464 | 31433 | 31378 | 0,5 |
| 10 | 100 | 313638 | 320712 | 311943 | 311943 | 314559 | 1.3 |
| 100 | 1000 | 2845736 | 2840031 | 2882006 | 2864052 | 2857956 | 0,7 |
| Conc | Belopp | PEP 6 Peak områden (tabell 3D) | |||||
| (nM) | på-kolumn (fmoles) | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | Menar | RSD (%) |
| 0,1 | 1 | 490 | 583 | 440 | 440 | 488 | 13,8 |
| 1 | 10 | 6429 | 6429 | 6848 | 6623 | 6582 | 3.0 |
| 10 | 100 | 71295 | 70400 | 71563 | 70400 | 70915 | 0,9 |
| 100 | 1000 | 707640 | 707640 | 694461 | 729490 | 709808 | 2.0 |
Tabell 3. Tabell som innehåller HS-MRM kromatogram peak områdena registreras för 4 PHO peptider (Pep 2, 4, 5 och 6) injektionsvätska varje LC/MS (16 LC/MS körningar och 4 koncentrationer testats).
Den relativa standardavvikelsen var bättre än 15% för alla peptider över hela koncentrationsintervallet undersöktes.
Figur 1. Arbetsflödesdiagram sammanfattar de tre stegen som krävs för att starta en HS-MRM förvärvsmetoden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Exempel på HDMSE data:
(A) låg-energi spektrum visar Pep 6 föregångare jonen. (B) high-energy fragmentering spectrum av samma peptiden, visar topp 3 mest överflödande fragment jonerna (inringad) valts för Tof-MRM kollision energioptimering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Parametrar som används för att ställa in en Tof-MRM optimering experimentera.
För varje övergång testades elva kollision energier (i spänna av 16 till 36 V). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Exempel på den sista HS-MRM-metoden.
Flera parametrar krävs för varje ”transition”, inklusive peptid föregångare m/z, statens kostnad och ion rörlighet drift tid, m/z av de vanligast förekommande fragment ion, den optimala kollision energin och MS förvärv tiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Inställningarna som används av metoden för att analysera HS-MRM datamängden.
Varje peptid övervakas av en enda ”övergången” beskrivs av peptid föregångare m/z, debitera staten och förväntat retentionstid, tillsammans med m/z av det vanligast förekommande fragmentet och dess kostnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Diagram över den ion rörlighet masspektrometer.
I HS-MRM förvärv läge, prekursorer av peptiden som är att vara kvantifierad separeras från andra co eluerande (störande) peptid prekursorer i cellen ion-rörlighet, isolerat av quadrupole och fragmenterad med en fast kollision energi i den kollision-cellen. Den signal som produceras av peptid fragment jonerna förstärks genom att justera pusher frekvensen, och peptid kvantifiering utförs med hög-MS-upplösning (> 30.000) signaler som produceras av den mest intensiva fragment ion av varje peptid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. HS-MRM kromatogram registreras för 4 PHO peptider med 4 olika koncentrationer som spänner över 3 tiopotenser (0,1, 1, 10 och 100 nM).
(A) pep 2 kromatogram, (B) Pep 4 kromatogram, (C) Pep 5 kromatogram och (D) Pep 6 kromatogrammen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Kalibreringskurvorna för 4 PHO peptider över 4 olika koncentrationer (0,1, 1, 10 och 100 nM).
Tabellerna under varje kurva visar de enskilda peak områden (Y-värden) som registreras för varje injektion, medan den andra kolumnen från varje tabell visar Procentuell avvikelse från den förväntade linjär responsen. (A) pep 2 kalibrering, (B) Pep 4 kalibrering, (C) Pep 5 kalibrering och (D) Pep 6 kalibrering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Högupplöst (Rs > 20.000) masspektrometri används rutinmässigt för strukturella karakterisering av terapeutiska proteiner på en mängd olika instrument plattformar. MS-baserad protein kvantifiering utförs däremot vanligtvis av SRM/MRM på lågupplöst (~ 1000 Rs) tandem quadrupole masspektrometrar med signatur peptider genereras av enzymatisk klyvning av proteiner11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. som enda dimension kromatografiska separationer inte kan helt lösa komplexa peptid blandningar produceras av enzymatisk nedbrytning, peptid samtidig eluering är en vanlig företeelse, även när det gäller en singel-protein digest. För mycket komplexa protein smälter (t.ex. för kvantifiering av 1-100 ppm av hälso-och sjukvårdspersonal i närvaro av en peptid-rik bakgrund produceras av terapeutiska proteinet), känslighet, noggrannhet eller linjäritet i SRM/MRM kan assay påverkas av störningar.
SRM/MRM analyserna har endimensionell selektivitet, förlitar sig endast på en ”unik” kombination av föregångare/fragment massorna. Därför misslyckas dessa analyser i situationer när peptid bakgrunden ändras oväntat (t.ex. för biofarmaceutiska prover erhålls från olika rening förfaranden). För att övervinna dessa begränsningar, vi föreslår här en hög-selektivitet (HS) MRM analysen genomförs på en ion rörlighet-aktiverat högupplösta quadrupole time-of-flight (QTOF) hybrid masspektrometer (för instrumentet diagrammet, se figur 6).
Instrumentet separerar prekursorer av peptiden av intresse från andra co eluerande (störande) peptid prekursorer i cellen ion rörlighet, isolerar full isotopiska kuvertet av föregångare i quadrupole och fragment det med en fast CE i den kollision-cellen. Den signal som produceras av dess mest förekommande peptid fragment förstärks ytterligare genom att justera frekvensen skjutbogserare (Target Enhancement), som selektivt skjuter massa regioner av intresse i flyg röret, i stället för alla joner, som med en fullständig genomsökning. Peptid kvantifiering utförs med hjälp av hög-MS-upplösning (Rs ~ 30,000) produceras av detta fragment ion. HS-MRM analysen jämfört med SRM/MRM analyserna, och erbjuder två ytterligare nivåer av selektivitet: en tillhandahålls av föregångare-nivå ion rörlighet avskiljandet, medan andra erbjuds ökad massa resolution av TOF analysatorn. Resultaten av dessa selektivitet förbättringar är synliga i de HS-MRM kromatogram som visas i figur 7, som är fria från störningar över tre tiopotenser.
Till skillnad från SRM/MRM analyserna, det finns flera parametrar som kan justeras för att optimera de HS-MRM analyserna: fönstret RT runt peptid föregångaren (anges normalt vid 0.2 min), fönstret quadrupole isolering (4 Da), fönstret drift-tid kring den föregångare (± FWHM av föregångare toppen från den motsvarande ion-mobilogram), och MS resolution av fragmentet jonen (20 000-40 000). HS-MRM analyserna är mycket känsliga: lägst upptäckta beloppet för varje PHO peptider är 1 femtomole på-kolumn (eller 0,1 nM i form av peptid koncentration). Vid bedömningen av peptid MW (se tabell 1 för korrekt MWs), beloppen som upptäckts på kolumner är storleksordningen 1-2 pg, medan kolumnen är laddad med en betydligt högre mängd (2 µg) bakgrund peptider från mAb digest.
Genom att betrakta den molekylära vikten av fullängds PHO protein (97,2 kDa) från vilken de spetsade peptiderna har framställts, är analysen köpa duktig upptäcka 50 ppm av ett protein orenhet i närvaro av hög-överflöd bakgrund joner. Nedre gränsen för upptäckt (5-10 ppm) kan uppnås för lägre molekylvikt sjukvårdspersonal (10-20 kDa). Analysen omfattar tre tiopotenser (som visas i kalibreringskurvorna från figur 8), vilket innebär att den kan mäta hälso-och sjukvårdspersonal i intervallet 1-1000 ppm. Dessutom matchar reproducerbarheten för HS-MRM analyserna, illustreras i tabell 3, mycket väl med reproducerbarhet småmolekylär SRM/MRM analyser, med topparea RSDs bättre än 15%.
Vi utforskade funktionerna i en roman analys för kvantifiering av spetsiga peptid standarder i en monoklonal antikropp (mAb) digest och visat dess känslighet och verktyg för att täcka breda dynamiska räckvidd (minst tre tiopotenser) vanligtvis stött i HCP analys. Alla sex peptid standarder upptäcktes vid koncentrationer så låg som 0,1 nM (1 femtomole lastas på en 2,1-mm ID HPLC-kolonn) i närvaro av en hög-överflöd peptid bakgrund (2 µg av en mAb digest lastas på-kolumn). Genom att införliva både riktade HRMS och ion rörlighet föregångare separation, har HS-MRM analysen stor potential för att bli en snabb, hög genomströmning övervakning test för flera hälso-och sjukvårdspersonal i flera partier av biologiska läkemedel.
Disclosures
Samtliga författare är anställda av vatten Corporation, som är tillverkare av flera reagens och instrument som används i denna artikel.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Lesley Malouin och Tony Catlin från vatten Corporation för att förbereda figur 6 i manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vion IMS Qtof mass spectrometer | Waters | 186009214 | |
| Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM) | Waters | 186015041 | |
| Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM) | Waters | 186015040 | |
| Acquity H-Class Column Manager (CM) | Waters | 186015043 | |
| Acetonitrile (ACN) | Fisher Chemical | A996-4 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 40867-50G-F | |
| 2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 µm particles | Waters | 186005298 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| Formic acid, eluent additive for LC/MS | Sigma Aldrich | 56302-10X1ML-F | |
| Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard | Waters | 186006011 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I-1149-5G | |
| LC vials (12x32 mm glass vials, screw neck) | Waters | 186000327c | |
| Leucine Enkephalin acetate salt hydrate | Sigma Aldrich | L9133-10MG | |
| Protein LoBind 2.0 mL tubes (2x50) | Eppendorf | 22431102 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 µg) | Promega | V5073 | |
| Water, LC/MS grade | Sigma Aldrich | 39253-1L-R |
References
- Doneanu, C. E., et al. Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry. MAbs. 4, 24-44 (2012).
- Schenauer, M. R., Flynn, G. C., Goetze, A. M. Identification of host-cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry. Anal Biochem. 428, 150-157 (2012).
- Zhang, Q., et al. Comprehensive tracking of host-cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6, 659-670 (2014).
- Farrell, A., et al. Quantitative host-cell protein analysis using two-dimensional data independent LC-MS(E). Anal Chem. 87, 9186-9193 (2015).
- Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Anal Chem. 87, 10283-10291 (2015).
- Doneanu, C. E., et al. Improved identification and quantification of host cell proteins (HCPs) in biotherapeutics using liquid chromatography mass spectrometry. Technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization, vol. 3: Defining the next generation of analytical and biophysical techniques. , Washington DC. ACS Symposium series 1202 357-393 (2015).
- Zhang, Q., et al. Characterization of the co-elution of host-cell proteins with monoclonal antibodies during protein A purification. Biotechnol Prog. 32, 708-717 (2016).
- Reisinger, V., Toll, H., Mayer, R. E., Visser, J., Wolschin, F. A mass spectrometry based approach to host cell protein identification and its application in a comparatibility exercise. Anal Biochem. , 1-6 (2014).
- Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host-cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC/MS/MS and multivariate analysis. MAbs. 7, 1128-1137 (2015).
- Giles, K., et al. Applications of a trevelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide. Rapid Commun Mass Spectrom. 18, 2401-2414 (2004).
- Anderson, V., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5, 573-588 (2006).
- Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Mol Syst Biol. 4, 1-14 (2008).
- Picotti, P., et al. High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes. Nat Methods. 7, 43-46 (2010).
- Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. (53), (2011).
- Liebler, D. C., Zimmerman, L. J. Targeted quantitation of proteins by mass spectrometry. Biochemistry. 52, 3797-3806 (2013).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification. J Vis Exp. (102), (2015).
- Ebhardt, H. A., Sabido, E., Huttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. Range of protein detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry in an unfractioned human cell culture lysate. Proteomics. 12, 1185-1193 (2012).
- Picotti, P., Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Domon, B., Aebersold, R. Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targetted proteomics. Cell. 138, 795-806 (2009).
- Sherman, J., McKay, M. J., Ashman, K., Molloy, M. P. How specific is my SRM: the issue of precursor and product ion reductancy. Proteomics. 9, 1120-1123 (2009).
- Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of innacurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
- Rost, H., Malmstrom, L., Aebersold, R. A computational tool to detect and avoid redundancy in selected reaction monitoring. Mol Cell Proteomics. 11, 540-549 (2012).
- Bao, Y., et al. Detection and correction of interference in SRM analysis. Methods. 61, 299-303 (2013).
- Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
- Mbasu, R. J., et al. Advances in quadrupole and time-of-flight mass spectrometry for peptide MRM based translational reserch analysis. Proteomics. 16, 2206-2220 (2016).
