Summary
Her beskriver vi en brukt kromatografiske analysen kombinert med ion mobilitet separasjon av peptid forløpere etterfulgt av høy oppløsning (~ 30.000) MS-påvisning av peptid fragmenter for kvantifisering av piggete peptid standarder i et monoklonalt antistoff Digest.
Abstract
Analyse av lavt nivå (1-100 ppm) protein urenheter (f.eks verten celle proteiner (HCPs)) i protein biotherapeutics er en utfordrende analysen som krever høy følsomhet og en bredt dynamisk område. Masse massespektrometri-baserte kvantifisering analyser for proteiner omfatter vanligvis protein fordøyelse etterfulgt av selektiv reaksjon overvåking/flere reaksjonen overvåking (SRM/MRM) kvantifisering av peptider bruker en lav oppløsning (Rs ~ 1000) tandem quadrupole masse spectrometer. En av begrensningene for denne tilnærmingen er forstyrrelser fenomenet observert når peptid rundt har "samme" forløper og fragment masse (i m/z-verdier) som andre co eluting peptider i prøven (i en 1-Da-vinduet). For å unngå dette fenomenet, vi foreslå en alternativ masse spectrometric tilnærming, en høy selektivitet (HS) MRM analysen som kombinerer ion mobilitet separasjon av peptid forløpere med høy oppløsning (Rs ~ 30.000) MS påvisning av peptid fragmenter. Vi utforsket mulighetene i denne tilnærmingen å kvantifisere lav-overflod peptid standarder piggete i et monoklonalt antistoff (mAb) Sammendrag og viste at det har følsomhet og dynamisk område (minst 3 størrelsesordener) vanligvis oppnådd i sh analyse. Alle seks peptid standarder ble oppdaget i konsentrasjoner så lavt som 0,1 nM (1 femtomole lastet på en brukt kromatografiske 2.1 mm ID-kolonnen) i nærvær av en høy-overflod peptid bakgrunn (2 µg av en mAb digest lastet på kolonner). Når du vurderer MW kanin phosphorylase (97.2 kDa), som de piggete peptidene var avledet, er LOQ av denne analysen lavere enn 50 ppm. Relativ standardavvik (RSD) topp områder (n = 4 gjentak) var mindre enn 15% over hele konsentrasjon range undersøkt (0,1-100 nM eller 1-1000 ppm) i denne studien.
Introduction
Kvantifisering av store biomolecules (proteiner) i bransjer er basert på immunanalyser (f.eks ELISAs), hovedsakelig på grunn av flere fordeler: følsomhet, høy gjennomstrømming, lette-av-bruk og lave kostnader per prøve. Når det gjaldt for å analysere lav-overflod protein urenheter (1-100 ppm verten celle proteiner (HCPs)) i protein therapeutics, gir disse biologiske metoder vanligvis den totale HCP konsentrasjonen (vanligvis uttrykt i ppm eller ng HCP/mg mAb), men de kan ikke identifisere og måle personlige HCP forurensninger. Flere baserte analyser har nylig utviklet å utfylle ELISAs eller å gi informasjon som ELISAs mislykkes i å gi1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. på grunn av prøven kompleksitet og kravet om å oppdage HCP peptider over et bredt dynamisk område i konsentrasjon (minst 3 størrelsesordener), flerdimensjonale brukt kromatografiske metoder anbud vid prøve fraksjoneres har tradisjonelt vært ansatt for å identifisere lav-overflod HCPs1,2,3,4,5,6,7.
En naturlig trinn etter HCP identifikasjon og godkjenningen er HCP sporing (monitoring) over flere grupper av biopharmaceuticals. I denne situasjonen foreslått én dimensjon LC/MS metoder å forbedre utvalg ytelse8,9. Men kan nøyaktigheten og dynamisk utvalg av sh mål bli påvirket i en 1D LC/MS analysen av overveldende tilstedeværelse av biofarmasøytisk peptider. Sammenlignet med en flerdimensjonal separasjon, potensialet for signal forstyrrelser19,20,21,22 er økt i et enkelt dimensjon brukt kromatografiske skille fordi sannsynligheten for flere peptid forløpere til være co eluting økes. Inkorporering av ortogonale betyr for å skille peptid forløpere uten utvide brukt kromatografiske separasjon tiden ville klart være en fordel. Reiser bølge ion mobilitet (TWIM)10 har evnen til å løse trafikk MS spectra i millisekunder. Rundt 500 mobilitet separasjoner kan utføres under tilsettes av et enkelt peptid, forutsatt en full brukt kromatografiske peak bredde 10 s og vurderer at kjøretidsdetaljene av en IM separasjon på ion mobilitet apparatet er 20 ms.
Masse spectrometric analyser for protein kvantifisering har vært utviklet over siste tiår med den godt akseptert valgt (flere) reaksjon overvåking tilnærming (SRM/MRM metode) implementert på tandem masse spektrometre11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,22,23. En av begrensningene i denne lav masse spectrometric analysen er den forstyrrelser fenomenet19,20,21,22 observert når peptid rundt har det "samme" forløperen og fragment presentere masse andre co eluting peptider i prøven (i en 1-Da-vinduet). Det er to måter å forbedre nøyaktigheten av metodene SRM/MRM: ett alternativ innebærer en ekstra separasjon trinn på forløper nivå fjerne forstyrrende forløper ioner, mens det andre alternativet er å øke MS oppløsningen av den forløper/fragment til unngå overlappende MS signaler. Høy-selektivitet (HS) MRM vinningen måte beskrevet her tar nytte av begge disse tilnærmingene av kopling ion mobilitet separasjon av peptid forløpere med høy oppløsning (retten ~ 30.000) MS påvisning av peptid fragmenter. Analysen beskrevet her dekker minst tre størrelsesordener som dynamikkområdet vanligvis observert i SRM/MRM Proteomikk eksperimenter17,18,24.
Nytten av HS-MRM analysen for HCP kvantifisering ble demonstrert av overvåking linearitet av signalet produsert av seks peptid standarder piggete i ulike konsentrasjoner (0,1 - til 100-nM område) i et monoklonalt antistoff Sammendrag.
Protocol
1. forberedelse av infliximab sammendraget (~ 24 h prosedyre)
- Forberede frisk løsninger av 50 mM ammonium bikarbonat, 1% anionic surfactant i 50 mM NH4HCO3500 mM dithiothreitol (DTT) i 50 mM NH4HCO3og 500 mM iodoacetamide (IAM) i 50 mM NH4HCO3.
- 750 µL av 50 mM NH4HCO3, legge til 200 µL av infliximab mAb (10 mg/mL) og 50 µL av 1% anionic surfactant løsning og denature proteinet i 15 min på 60 ° C i nærvær av 0,05% anionic surfactant.
- Legge til 40 µL av 500 mM DTT og redusere utvalget for 60 minutter til 60 ° C i nærvær av 20 mM DTT.
- Legg til 20 µL av 500 mM IAM og alkylate utvalget for 30 min ved romtemperatur i mørket i nærvær av ~ 10 mM IAM.
- Legge til innholdet av microcentrifuge rør i et hetteglass inneholder 20 µg av MS sekvensering-grade Lys C/trypsin og fordøye utvalget for 3t på 37 ° C.
- Legge til et annet enzym aliquot (20 µg) ved å overføre fordøyd prøven til en annen hetteglass inneholder 20 µg MS sekvensering-grade Lys C/Trypsin og fordøye prøven natten (12-15 h) på 37 ° C.
- Etter natten proteolyse, legge til 5 µL av 100% maursyre (FA) og ruge sammendraget i 30 min på 37 ° C oppløse den syre labil anionic surfactant.
- Nedspinning sammendraget i 15 min 4000 x g i en sentrifuge å utløse uløselig komponenten av det anionic surfactant.
- Gjenopprette ~ 1000 µL av infliximab sammendraget og plassere den i en LC auto-sampler hetteglass; digest konsentrasjonen bør være ~ 2 mg/mL. Lagre sammendraget i en fryser på 20 ° C til LC/MS systemet er klar for analyse.
2. skyter peptid standarder (~ 30 min)
- Tine infliximab sammendraget ved å plassere frosne prøven i hetteglass på en benk i romtemperatur.
- Legg 1 mL av 0,1% aktiva i H2O en kanin phosphorylase b (PHO) digest hetteglass for å forberede 1-µM lager løsninger for alle seks peptid standarder fra på PHO finnes i ampullen (ampullen inneholder 1 nmol av hver peptid).
- Forberede 4 x 1-mL fortynninger av PHO lager løsningen å skaffe løsninger som inneholder 0.1, 1, 10 og 100 nM peptider, med 0,1% FA som fortynning løsemiddelet. Forberede alle fortynninger i hetteglass (LC auto-sampler ampuller) og legger 100 µL av infliximab digest som bakgrunn matrix alle ampuller. Legg 2 µg digest bakgrunn på kolonnen med hver 10-µL injeksjon. Forberede et tomt utvalg som inneholder fortynnet infliximab sammendraget (den samme 1:10 fortynning), med ingen piggete peptider.
3. oppsett av anskaffelsesmetoden LC/HDMS E data
Merk: Arbeidsflyten oppsummerer trinn kreves for å sette opp en HS-MRM anskaffelse er avbildet i figur 1 og beskrevet i detalj i paragraf 3-6. Oppkjøpet av data-uavhengig HDMSE datasett er nødvendig å etablere oppbevaringsperioden for hver overvåkede peptid, overordnede m/z av rikeste peptid ion etter electrospray ionization, og tilhørende CCS (collisional cross inndelingen) avledet fra ion mobilitet separasjon. I tillegg gir data-uavhengig datasettet informasjon om m/z tre rikeste fragment ioner for hver peptid forløper. I det andre trinnet i arbeidsflyten (CE optimization) økes følsomheten til analysen med tuning kollisjon celle energi til å få den høyeste ion intensiteten for hver fragment ion. Til slutt, i det siste trinnet, alle parameterne som beskrives ovenfor er introdusert til redigeringsprogrammet HS-MRM metode for hver peptid overvåket.
- Utføre Langbane/MS eksperimenter på en quadrupole tid-av-fly (QTOF) masse spectrometer kombinert til et ultra ytelse flytende kromatografi system bruker en data-uavhengig anskaffelsesmetoden (HDMSE).
Merk: Flere detaljer om Instrumentkonfigurasjonen er inkludert i delen materiale. Dette bruker en omreisende ion mobilitet digitallydenhet for separasjon av peptid forløpere10. - Forberede to mobile faser med 0,1% FA i vann (løsemiddel A) og 0,1% FA i acetonitrile (løsemiddel B).
Merk: Bruk en ladet overflaten hybrid (CSH) C18 kolonne (2,1 x 150 mm, fullpakket med 1,7-µm partikler) for separasjon av piggete mAb format. - Klikk "Opprett/analyse metoden" i den oppkjøp programvaren, og velge "Generer en anskaffelse og behandling metode" Skriv inn metoden, bla til mappen metoden (katalog) og klikk "Neste".
- For "Analysetypen," Velg "peptid kart (IMS)", og i kategorien "Instrument System", velg "Kvartær løsemiddel Manager" instrumentet. Rediger gradering innstillingene oppnå peptid separasjon på en strømningshastighet på 200 µL/min. Bruk en gradient elueringsrør fra 1 til 40% løsemiddel B i 30min etterfulgt av en 2-min kolonnen vask og en 9-min balanse, med en total kjøretid på 50 min. introdusere disse eksperimentelle parametere i redigeringsprogrammet for LC-metoden.
- I kategorien "Instrument System", velg "Sample Manager" instrumentet. Sett eksempel temperaturen til 10 ° C, og kolonne temperaturen til 60 ° C.
- Operere QTOF masse spectrometer i positivt ion ESI følsomhet modus, med en typisk løse makt 30.000 FWHM.
Merk: LC/HDMSE er en data-uavhengig oppkjøp (DIA) modus som opererer ved raskt å samle skanning med vekslende kollisjon energier (i kollisjon cellen) mellom en lav energi (6 V for MS kanal 1 skanner) og en forhøyet energi (15 - til 40-V rampe til gi til fragmentering spectra uten forløper valget i MS kanal 2).- Angi standard kilde-relaterte MS parametere i den oppkjøp programvaren: fra "Min arbeid/Instrument System," Velg kategorien «Vion IMS Qtof» og angir parameterne i "Verktøy"-menyen: 3.0 kV kapillær spenning, 100 ° C Kilde temperatur, 100 V-kilde offset, kjegle 50 L/h gasstrømmen og 40 V kjegle spenning. Satt desolvation temperaturen til 250 ° C, desolvation gass infusjonshastigheten til 500 L/t, og referanse kapillær spenningen til 3.0 kV.
- Klikk "Opprett/analyse metoden" i den oppkjøp programvaren, og velge "Generer en anskaffelse og behandling metode" Skriv inn metoden og bla til metoden mappen (mappe) og deretter "Neste".
- For "Analysetypen," Velg "peptid kart (IMS)", og i kategorien "Instrument System", velg "Vion IMS QTof" instrumentet. Klikk "Finish."
Merk: Metoden for nyopprettede LC/HDMSE åpnes automatisk i skjermbildet "Instrument metoden Configuration". - Angi parameterne i "Innstillinger"-kategorien: 3.0 kV kapillær spenning, 100 ° C Kilde temperatur, 250 ° C desolvation temperatur, 50 L/h kjegle gasstrømmen og 500 L/h desolvation gasstrømmen.
- I "Eksperiment" kategorien Innstillinger, velg "High Definition MSE"og velg "Analyse metoden runtime." Angi parameterne i kategorien "Skanneinnstillinger": lav masse, 100; høy masse, 2000; og søketiden, 400 ms. i kategorien "CE-"6 V"for innstillingen lav-energi og velge en strømkrevende rampe fra 15 til 40 V. sikre har"Deaktiver data reduksjon"sjekket.
- Sette mot en løsning av 50 ng/mL leucine enkephalin (LE) i 50% acetonitrile med 0,1% FA på en flow rate på 10 µL/min for Lås-masse kalibrering under datainnsamling.
Merk: Lås-masse data opp hver 5 minutter ved hjelp av samme oppkjøpet hastighet over samme massen utvalg.
- Analysere 10-nM, PHO-piggete prøven ved hjelp av LC/HDMSE analysen beskrevet ovenfor av sprøytebruk 10 µL av prøven (mengden lastet på-kolonnen er 100 fmol for hver peptid standard).
4. oppsett av metoden Tof-MRM for kollisjon energi (CE) optimalisering
- Fra datasettet LC/HDMSE få oppbevaringsperioden, forløperen og fragment ion m/z for hver PHO peptid. Beholde m/z og anklagen tilstanden for den mest tallrike forløper ion og de tilsvarende tre rikeste fragmentere ioner.
Merk: Et eksempel på lav-energi og høy energi spectra vanligvis registrert av LC/HDMSE analysen vises i figur 2. - Bruke kollisjon energi (CE) optimalisering i en SRM/MRM eksperiment for å få beste signalet for hver peptid23.
- Klikk "Opprett/analyse metoden" i den oppkjøp programvaren, og velge "Generer en anskaffelse og behandling metode" Skriv inn metoden, bla til mappen metoden (katalog) og klikk "Neste".
- "Analysetypen," Velg "Kvantifisere." Velg "Kvantifisere analysen Tof 2D brukt kromatografiske" og klikk "Neste". I kategorien "Instrument System", velg "Vion IMS QTof" og klikk "Finish."
Merk: Metoden for nyopprettede Tof-MRM åpnes automatisk i skjermbildet "Instrument metoden Configuration". - Angi parameterne i "Innstillinger"-kategorien: 3.0 kV kapillær spenning, 100 ° C Kilde temperatur, 250 ° C desolvation temperatur, 50 L/h kjegle gasstrømmen og 500 L/h desolvation gasstrømmen.
- I "Eksperiment" kategorien Innstillinger, velg "Funksjonen Table" og velg "ett eller flere MS, MSMS eller MRM funksjoner." Bruke nedpilene, sette opp en "Tof-MRM" funksjon for hver peptid ved å angi tre "overganger" (kombinasjoner av rikeste forløperen og tre av de mest tallrike fragment ionene).
Merk: I Tof-MRM modus, høyest følsomheten oppnås med en planlagt MRM tilnærming. - I redigeringsprogrammet for "Tof-MRM"-funksjonen, velger du en oppbevaring tidsvindu for hver peptid (minst 1 min lang), ordnet etter peptid elueringsrør rekkefølgen. I redigeringsprogrammet for "Tof-MRM"-funksjon, setter du inn peptid forløper m/z og produkt m/z; Velg vinduet quad isolasjon som "Lav" (4-Da vindu) for peptid forløperen; Velg en fast søketiden på 100 ms; og velg tolv forskjellige kollisjon energiinnhold i størrelsesorden 14-36 V, som følger: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 og 36, som vist i eksemplet fra figur 3.
Merk: Med Tof-MRM metoden beskrevet ovenfor minst 10 datapunktene per brukt kromatografiske peak er samlet for hver overgang på hver CE angitt. For å redusere størrelsen på dataene, velger du alternativet "Wide" (6-Da vindu) for signalet av fragment ion. Eksempler på CE-optimalisert verdiene vises i tabell 2. - Analysere 10-nM, PHO-piggete prøven bruker Tof-MRM analysen beskrevet ovenfor av sprøytebruk 10 µL av prøven (mengden lastet på-kolonnen er 100 fmol for hver peptid standard).
5. oppsett av siste HS-MRM anskaffelsesmetoden for peptid kvantifisering med ion mobilitet separasjon av peptid forløpere
- Vis alle 11 brukt kromatografiske spor genereres for hver CE for hver peptid i "Undersøke"-menyen i den oppkjøp programvaren, og integrere toppene med "Integrere" knappen på verktøylinjen for "prosessering alternativer/operasjoner"; høyeste topp området angir best CE for hver overgang.
- Visuelt sammenligne de beste topp områdene for 3 fragmenter av hver peptid og beholder bare beste "overgang" (fragment ion som produserer det mest intense signalet); Tabell 2 viser best "overganger" fra fire PHO peptider.
- Oppsett en HS-MRM metode som inneholder bare én fragment ion per peptid. Bruk CCS verdiene for hver peptid forløper fra LC/HDMSE datasettet.
- Endre metoden Tof-MRM opprettet i den forrige delen (del 4) ved å velge funksjonen "HS-MRM" i stedet for funksjonen "Tof-MRM".
- I redigeringsprogrammet for "HS-MRM"-funksjonen, angir du følgende forløper-relaterte parametere: m/z, quadrupole oppløsning: lav (4 Da), lade stat, forløperen CCS verdi og forløper CCS oppløsning: lav. Produktet ion, angi sin m/z, optimal kollisjon energi, velge en skanning tid på 0,4 s og velg en "Wide" spektrum innstilling (6 Da) å inkludere alle sine isotoper. Et eksempel på siste HS-MRM anskaffelsesmetoden for alle fire peptider vises i figur 4.
- Analysere alle prøvene bruker HS-MRM metoden, starter med mAb sammendraget tom (ikke-piggete sampling), etterfulgt av 4 Repliker injeksjoner (10 µL hver) for de følgende: 0,1, 1, 10 og 100 nM PHO peptider.
6. opprettelsen av en behandlingsmetode for analyse av HS-MRM datasettet
- Opprette en behandlingsmetode for analyse av HS-MRM datasettet.
- Analysemetode opprettet for "HS-MRM" data anskaffelsesmetoden, klikk kategorien "Formål" og velg "Behandle komponenter."
- Fra rullegardinmenyen under "Eksperiment Type", Velg alternativet "HS MS-/ MS/HS-MRM".
- Klikk på "Opprett/New Entry" og presentere følgende parametere i behandling metoden editor: peptid tiden (RT), forløperen anklagen tilstanden, forløperen m/z og forløper drift tid (DT). Angi tilstanden m/z og lade fragment ion, og angi "XIC" spor som utvinning modus.
- I kategorien "Formål" samme "HS-MRM" anskaffelsesmetoden, klikk på "Standard mengder" og skriv inn følgende konsentrasjonen: 0,1, 1, 10 og 100 nM PHO peptider.
- Angi følgende parametere i "Prosessering/uttak innstillinger": standard masse toleranse, 10 ppm (for m/z alle fragment ioner) og standard drive tid, 5%. et eksempel på PHO peptid prosesseringsmetode er vist i figur 5.
- Hvilken kalibrering, Velg lineær kurve montering med 1 / X2 vekting.
- Behandle HS-MRM data å integrere alle chromatograms og konstruere kalibrering kurvene i hver PHO peptid.
Representative Results
Den personlige sekvenser av seks phosphorylase b peptid standarder i PHO peptid blandingen er vist i tabell 1, sammen med deres tid og rikeste forgjengere observert i HDMSE eksperimenter. Det første trinnet i utviklingen av en høy-selektivitet (HS) MRM analysen er oppkjøpet av et HDMSE datasett å etablere elueringsrør tider hver PHO peptid, sammen med sin tilsvarende mest rikelig forløperen og tre rikeste fragmenter. Figur 2 viser til HDMSE spectra kjøpt for en av PHO peptider (Pep 6) piggete i infliximab fordøye. Når du har opprettet de 3 beste "overganger" (kombinasjoner av forløperen og fragment massene) for hver peptid, utføres en Tof-MRM eksperiment for å finne optimal kollisjon energi å maksimere signalene genereres for hver peptid. Resultatene av CE optimeringseksperiment oppsummeres i tabell 2. Siste HS-MRM analysen (se figur 4) beholder bare beste "overgang" for hver peptid og brukes for å analysere alle piggete prøver. Eksempler på HS-MRM chromatograms genereres for 4 PHO peptider i alle konsentrasjoner undersøkt presenteres i figur 7. Fire kalibrering kurver fått for hver peptid følgende integrering av HS-MRM toppene i figur 7 vises i figur 8. I tillegg summeres peak området relative standardavviket, beregnet basert på 4 Repliker injeksjoner, i 4 tabellene som vises i tabell 3.
| Peptid | Peptid | Oppbevaring | Gratis stater | ||||
| ID | Sekvens | tid (min) | + 1 | + 2 | + 3 | + 4 | |
| PEP 1 | VLYPNDNFFEGK | 19.4 | 1442.6951 | 721.8512 | 481.5699 | 361.4292 | |
| PEP 2 | TCAYTNHTVLPEALER | 16.0 | 1874.9065 | 937.9569 | 625.6404 | 469.4821 | |
| PEP 3 | IGEEYISDLDQLRK | 18,9 | 1678.8646 | 839.9360 | 560.2931 | 420.4716 | |
| PEP 4 | LLSYVDDEAFIR | 21,1 | 1440.7369 | 720.8721 | 480.9172 | 360.9397 | |
| PEP 5 | LITAIGDVVNHDPVVGDR | 19.7 | 1890.0080 | 945.5076 | 630.6742 | 473.2574 | |
| PEP 6 | VFADYEEYVK | 17,7 | 1262.5939 | 631.8006 | 421.5362 | 316.4039 | |
Tabell 1. PHO peptid standarder i masse PREP mix piggete i infliximab fordøye. Peptid tid og rikeste forgjengere (uthevet med fet skrift) vises i tabellformat.
| Peptid | Peptid | Oppbevaring | Peptid forløper | Rikeste fragment ioner/lading | Optimal | ||||
| ID | Sekvens | tid (min) | m/z & kostnader | Drift tid (ms) | Jeg | II | III | CE (V) | |
| PEP 2 | TCAYTNHTVLPEALER | 16.0 | 625.6404 (3) | 6.2 | 714.3781 (1) | 807.4177 (2) | 827.4621 (1) | 24 | |
| PEP 4 | LLSYVDDEAFIR | 21,1 | 720.8721 (2) | 7.5 | 865.4050 (1) | 964.4734 (1) | 1214.5688 (1) | 22 | |
| PEP 5 | LITAIGDVVNHDPVVGDR | 19.7 | 630.6742 (3) | 6.3 | 642.3570 (1) | 689.8391 (2) | 832.4236 (2) | 20 | |
| PEP 6 | VFADYEEYVK | 17,7 | 631.8006 (2) | 7.0 | 830.3931 (1) | 945.4200 (2) | 1016.4571 (1) | 24 | |
Tabell 2. Resultatene av optimeringseksperiment Tof-MRM: tre rikeste fragmenter av hver PHO peptid kvantifisert i denne studien angis, sammen med tilsvarende optimalisert kollisjon energi.
| Kons | Beløp | PEP 2 topp områder (tabell 3A) | |||||
| (nM) | (fmoles) på kolonner | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | Mener | RSD (%) |
| 0,1 | 1 | 490 | 439 | 462 | 431 | 456 | 5.8 |
| 1 | 10 | 5121 | 4842 | 5198 | 4842 | 5001 | 3.7 |
| 10 | 100 | 63853 | 64279 | 66111 | 62509 | 64188 | 2.3 |
| 100 | 1000 | 612392 | 605553 | 613229 | 611004 | 610545 | 0,6 |
| Kons | Beløp | PEP 4 Peak områder (tabell 3B) | |||||
| (nM) | (fmoles) på kolonner | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | Mener | RSD (%) |
| 0,1 | 1 | 275 | 359 | 325 | 288 | 312 | 12.2 |
| 1 | 10 | 3559 | 3694 | 3287 | 3754 | 3574 | 5.8 |
| 10 | 100 | 45259 | 45775 | 42976 | 45548 | 44890 | 2.9 |
| 100 | 1000 | 459374 | 467927 | 436272 | 458994 | 455642 | 3.0 |
| Kons | Beløp | PEP 5 Peak områder (tabell 3 c) | |||||
| (nM) | (fmoles) på kolonner | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | Mener | RSD (%) |
| 0,1 | 1 | 3194 | 3243 | 3202 | 3257 | 3224 | 1.0 |
| 1 | 10 | 31464 | 31150 | 31464 | 31433 | 31378 | 0,5 |
| 10 | 100 | 313638 | 320712 | 311943 | 311943 | 314559 | 1.3 |
| 100 | 1000 | 2845736 | 2840031 | 2882006 | 2864052 | 2857956 | 0,7 |
| Kons | Beløp | PEP 6 Peak områder (tabell 3D) | |||||
| (nM) | (fmoles) på kolonner | Rep01 | Rep02 | Rep03 | Rep04 | Mener | RSD (%) |
| 0,1 | 1 | 490 | 583 | 440 | 440 | 488 | 13.8 |
| 1 | 10 | 6429 | 6429 | 6848 | 6623 | 6582 | 3.0 |
| 10 | 100 | 71295 | 70400 | 71563 | 70400 | 70915 | 0,9 |
| 100 | 1000 | 707640 | 707640 | 694461 | 729490 | 709808 | 2.0 |
Tabell 3. Tabellen som inneholder de høyeste områdene av HS-MRM chromatograms registrert for 4 PHO peptider (Pep 2, 4, 5 og 6) for hver LC/MS injeksjon (16 LC/MS går og 4 konsentrasjoner testet).
Relativ standardavviket var bedre enn 15% for alle peptider over hele konsentrasjon området undersøkt.
Figur 1. Arbeidsflytdiagram oppsummerer tre trinnene som kreves for å sette opp en HS-MRM anskaffelsesmetoden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Eksempel på HDMSE:
(A) lav-energi spectrum viser Pep 6 forløper ion. (B) strømkrevende fragmentering spekteret av den samme peptid, viser de 3 beste rikeste fragment ionene (innringet) valgt for Tof-MRM kollisjon energi optimalisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Parametere som brukes for å sette opp en Tof-MRM optimalisering eksperiment.
For hver overgang, ble elleve kollisjon energier (i størrelsesorden 16 36 V) testet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Eksempel på den endelige HS-MRM-metoden.
Flere parametere kreves for hver "overgang", inkludert peptid forløper m/z, tilstanden kostnad og ion mobilitet drift tid, m/z rikeste fragment ion, optimal kollisjon energi og MS anskaffet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Innstillinger som brukes av behandlingsmetode for å analysere HS-MRM datasettet.
Hver peptid overvåkes av én enkelt "overgang" beskrevet av peptid forløper m/z, lade tilstand og forventet oppbevaringsperioden, sammen med m/z rikeste fragmentet og tilstanden kostnad. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Diagram over ion mobilitet masse spectrometer.
I HS-MRM oppkjøpet modus, forløperne til peptid som er å være kvantifisert er atskilt fra andre co eluting (forstyrrende) peptid forløpere i ion mobilitet cellen, isolert av quadrupole og fragmentert med en fast kollisjon energi i den kollisjon celle. Signalet produsert av peptid fragment ioner er forbedret ved å justere frekvensen pusher, og peptid kvantifisering utføres ved hjelp av høy-MS-oppløsning (> 30 000) signaler produsert ved den mest intense fragment ion av hver peptid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. HS-MRM chromatograms registrert for 4 PHO peptider i 4 ulike konsentrasjoner som spenner over 3 størrelsesordener (0.1, 1, 10 og 100 nM).
(A) pep 2 chromatograms, (B) Pep 4 chromatograms, (C) Pep 5 chromatograms og (D) Pep 6 chromatograms. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Kalibrering kurver for 4 PHO peptider over 4 ulike konsentrasjoner (0.1, 1, 10 og 100 nM).
Tabellene under hver kurve viser personlige topp områdene (Y-verdier) registrert for hver injeksjon, mens den andre kolonnen fra hver tabell viser prosent avviket fra forventet lineær respons. (A) pep 2 kalibrering, (B) Pep 4 kalibrering, (C) Pep 5 kalibrering og (D) Pep 6 kalibrering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Høy oppløsning (Rs > 20.000) massespektrometri brukes rutinemessig for strukturelle karakterisering av terapeutiske proteiner på en rekke instrument plattformer. Derimot er baserte protein kvantifisering vanligvis utført av SRM/MRM på lav oppløsning (Rs ~ 1000) tandem quadrupole masse spektrometre bruker signatur peptider generert av enzymatisk spalting av proteiner11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. som én dimensjon brukt kromatografiske separasjoner ikke kan fullt ut løse komplekse peptid blandinger produsert av enzymatisk fordøyelsen, peptid co elueringsrør er en vanlig foreteelse, selv om det oppstår et enkelt-protein Sammendrag. For svært komplekse protein format (f.eks for kvantifisering av 1-100 ppms av HCPs i nærvær av peptid-rik bakgrunn produsert av terapeutiske protein), følsomhet, nøyaktighet eller linearitet av SRM/MRM kan analysen påvirkes av forstyrrelser.
SRM/MRM-analyser har endimensjonale selektivitet, stole på en "unik" kombinasjon av forløperen/fragment massene. Derfor disse analyser mislykkes i situasjoner når peptid bakgrunnen endres uventet (f.eks for biofarmasøytisk prøver innhentet fra ulike rensing prosedyrer). For å overvinne disse begrensningene, foreslår vi her en høy-selektivitet (HS) MRM analysen gjennomført på en ion mobilitet-aktiverte høy oppløsning quadrupole tid-av-fly (QTOF) hybrid masse spectrometer (på instrumentet diagrammet, se figur 6).
Instrumentet skiller forløperne til peptid rundt fra andre co eluting (forstyrrende) peptid forløpere i ion mobilitet cellen, isolerer full isotopanrikning konvolutten av forløperen i quadrupole og fragmenter det med en fast CE i den kollisjon celle. Signalet produsert av det rikeste peptid fragmentet forsterkes ytterligere ved å justere pusher frekvensen (målet Enhancement), som selektivt presser masse regioner av interesse i flight røret, snarere enn alle ioner, som med en fullstendig skanning. Peptid kvantifisering utføres med høy-MS-oppløsning (Rs ~ 30.000) signaler produsert av denne fragment ion. Sammenlignet med SRM/MRM-analyser, HS-MRM analysen tilbyr to ekstra selektivitet: en leveres av forløperen nivå ion mobilitet separasjon, mens andre er tilbudt av økt masse oppløsningen av TOF analysator. Resultatene brakt av forbedringene selektivitet vises i HS-MRM chromatograms vises i figur 7, som er fri for forstyrrelser over tre størrelsesordener.
I motsetning til SRM/MRM analyser, det er flere parametere som kan justeres for å optimalisere HS-MRM analyser: vinduet RT rundt peptid forløperen (settes på 0,2 min), quadrupole isolasjon vinduet (4 Da), drift-tidsvinduet rundt den forløperen (± FWHM av forløperen fjellet fra den tilsvarende ion mobilogram), og MS oppløsningen av fragment ion (20.000-40.000). HS-MRM analyser er svært følsomme: laveste oppdaget beløpet for hver PHO peptider er 1 femtomole på-kolonne (eller 0,1 nM i peptid konsentrasjon). Når de vurderer peptid MW (se tabell 1 for nøyaktig MWs), hvor oppdaget på kolonner er på 1-2 side, mens kolonnen er lastet med en betydelig høyere mengde (2 µg) bakgrunn peptider fra mAb sammendraget.
Ved å vurdere molekylvekt av full lengde PHO protein (97.2 kDa) som piggete peptidene var avledet, er analysen kjøpedyktig merker 50 ppm en protein urenhet i nærvær av høy-overflod bakgrunn ioner. Grense for påvisning (5-10 ppm) er oppnåelig for lavere molekylvekt HCPs (10-20 kDa). Analysen omfatter tre størrelsesordener (som vist i kalibrering kurvene figur 8), som betyr at det kan måle HCPs i området 1-1000 ppm. Også passer reproduserbarhet av HS-MRM analyser, illustrert i tabell 3, godt med reproduserbarhet av små-molekylet SRM/MRM analyser, med peak området RSDs bedre enn 15%.
Vi utforsket egenskapene til en roman analysen for kvantifisering av piggete peptid standarder i et monoklonalt antistoff (mAb) Sammendrag og demonstrerte sin følsomhet og nytte å dekke bredt dynamisk område (minst tre størrelsesordener) vanligvis støtte HCP analyse. Alle seks peptid standarder ble oppdaget i konsentrasjoner så lavt som 0,1 nM (1 femtomole lastet på en brukt kromatografiske 2.1 mm ID-kolonnen) i nærvær av en høy-overflod peptid bakgrunn (2 µg av en mAb digest lastet på kolonner). Ved å innlemme både målrettet HRMS og ion mobilitet forløper separasjon, har HS-MRM analysen stort potensial for å bli en rask, høy gjennomstrømming overvåking analysen for flere HCPs på tvers av flere grupper av biopharmaceuticals.
Disclosures
Alle forfattere er ansatte i vannet Corporation, som er produsent av flere reagenser og instrumenter brukes i denne artikkelen.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Lesley Malouin og Tony Catlin fra vannet Corporation for å forberede figur 6 av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vion IMS Qtof mass spectrometer | Waters | 186009214 | |
| Acquity H-Class Quaternary solvent manager (QSM) | Waters | 186015041 | |
| Acquity H-Class FTN Sample Manager (SM) | Waters | 186015040 | |
| Acquity H-Class Column Manager (CM) | Waters | 186015043 | |
| Acetonitrile (ACN) | Fisher Chemical | A996-4 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 40867-50G-F | |
| 2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC column, 1.8 µm particles | Waters | 186005298 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| Formic acid, eluent additive for LC/MS | Sigma Aldrich | 56302-10X1ML-F | |
| Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP standard | Waters | 186006011 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I-1149-5G | |
| LC vials (12x32 mm glass vials, screw neck) | Waters | 186000327c | |
| Leucine Enkephalin acetate salt hydrate | Sigma Aldrich | L9133-10MG | |
| Protein LoBind 2.0 mL tubes (2x50) | Eppendorf | 22431102 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Trypsin/Lys-C enzyme mix, mass spec grade (5 x 20 µg) | Promega | V5073 | |
| Water, LC/MS grade | Sigma Aldrich | 39253-1L-R |
References
- Doneanu, C. E., et al. Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry. MAbs. 4, 24-44 (2012).
- Schenauer, M. R., Flynn, G. C., Goetze, A. M. Identification of host-cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry. Anal Biochem. 428, 150-157 (2012).
- Zhang, Q., et al. Comprehensive tracking of host-cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6, 659-670 (2014).
- Farrell, A., et al. Quantitative host-cell protein analysis using two-dimensional data independent LC-MS(E). Anal Chem. 87, 9186-9193 (2015).
- Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Anal Chem. 87, 10283-10291 (2015).
- Doneanu, C. E., et al. Improved identification and quantification of host cell proteins (HCPs) in biotherapeutics using liquid chromatography mass spectrometry. Technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization, vol. 3: Defining the next generation of analytical and biophysical techniques. , Washington DC. ACS Symposium series 1202 357-393 (2015).
- Zhang, Q., et al. Characterization of the co-elution of host-cell proteins with monoclonal antibodies during protein A purification. Biotechnol Prog. 32, 708-717 (2016).
- Reisinger, V., Toll, H., Mayer, R. E., Visser, J., Wolschin, F. A mass spectrometry based approach to host cell protein identification and its application in a comparatibility exercise. Anal Biochem. , 1-6 (2014).
- Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host-cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC/MS/MS and multivariate analysis. MAbs. 7, 1128-1137 (2015).
- Giles, K., et al. Applications of a trevelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide. Rapid Commun Mass Spectrom. 18, 2401-2414 (2004).
- Anderson, V., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5, 573-588 (2006).
- Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Mol Syst Biol. 4, 1-14 (2008).
- Picotti, P., et al. High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes. Nat Methods. 7, 43-46 (2010).
- Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. (53), (2011).
- Liebler, D. C., Zimmerman, L. J. Targeted quantitation of proteins by mass spectrometry. Biochemistry. 52, 3797-3806 (2013).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected reaction monitoring mass spectrometry for absolute protein quantification. J Vis Exp. (102), (2015).
- Ebhardt, H. A., Sabido, E., Huttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. Range of protein detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry in an unfractioned human cell culture lysate. Proteomics. 12, 1185-1193 (2012).
- Picotti, P., Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Domon, B., Aebersold, R. Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targetted proteomics. Cell. 138, 795-806 (2009).
- Sherman, J., McKay, M. J., Ashman, K., Molloy, M. P. How specific is my SRM: the issue of precursor and product ion reductancy. Proteomics. 9, 1120-1123 (2009).
- Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of innacurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
- Rost, H., Malmstrom, L., Aebersold, R. A computational tool to detect and avoid redundancy in selected reaction monitoring. Mol Cell Proteomics. 11, 540-549 (2012).
- Bao, Y., et al. Detection and correction of interference in SRM analysis. Methods. 61, 299-303 (2013).
- Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
- Mbasu, R. J., et al. Advances in quadrupole and time-of-flight mass spectrometry for peptide MRM based translational reserch analysis. Proteomics. 16, 2206-2220 (2016).
