Summary
מוצג כאן היא טכניקה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה confocal זמן לשגות הדמיה של פיתוח שורש היפוקוטיל עד 3 ימים באמצעות מטרות צמצם גבוהה מספריים ו perfluorodecalin כמו מדיום טבילה.
Abstract
כמה היבטים של פיתוח צמחים, כגון מורפוגנזה שורש לרוחב, להתרחש על פני זמן של כמה ימים. כדי לחקור את התהליכים הבסיסיים התאים הסלולר, זמן ברזולוציה גבוהה לשגות אסטרטגיות מיקרוסקופיה כי לשמר תנאים פיזיולוגיים נדרשים. רקמות הצמח חייב להיות מזין נאותה אספקת מים עם חילופי גזי מתמשכת אבל, כאשר שקוע משותק תחת coverslip, הם רגישים במיוחד anoxia. אסטרטגיה אחת אשר הועסק בהצלחה היא השימוש במערכת זלוף כדי לשמור על אספקה מתמדת של חמצן וחומרים מזינים. עם זאת, הסדרים כאלה יכול להיות מסובך, מסורבל, ודורשים ציוד מיוחד. מוצג כאן היא אסטרטגיה חלופית עבור מערכת הדמיה פשוטה באמצעות perfluorodecalin כמו מדיום טבילה. מערכת זו היא קלה להתקנה, דורש ציוד מינימלי, והוא רכוב בקלות על הבמה מיקרוסקופ, המאפשר מספר חדרי הדמיה להיות מוגדר הדמיה שווהאלל. במערכת זו, שיעורי הצמיחה שורש לרוחב הם נבדלים משיעורי צמיחה בתנאים סטנדרטיים על צלחות אגר במשך היומיים הראשונים, וצמיחה שורש לרוחב ממשיך בשיעורים מופחתים לפחות עוד יום. רקמות הצמח מסופקים עם חומרים מזינים דרך אגר לוח זה יכול לשמש גם כדי לנהל מגוון של תרכובות פרמקולוגיות. המערכת הוקמה כדי לפקח על התפתחות שורש לרוחב, אבל הוא להתאמה בקלות התמונה איברים צמח אחרים כגון hypocotyls השורשים העיקריים.
Introduction
כדי לחקור את התהליכים הסלולר והתת-קרקעיים המונחים ביסוד פיתוח הצומח, יש ביקוש גובר לפתרונות הדמיה לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה. האתגר העיקרי בניסויים הדמיה כזו היא שמירה על תנאים פיזיולוגיים כולל חילופי גזי מספיק בתוספת אספקת מים וחומרים מזינים 1 , 2 , 3 . כדי לנצל את היעדים עם פתחים מספריים גבוהים עבור רזולוציה אופטית אופטימלית, דגימות צריך להיות ממוקם בקירבה מקבילה בכיוון מקביל coverslip. התנועה x, y, ו- z כיוונים צריך אידיאלי להיות מינימלי במהלך הדמיה.
בעוד שתילים הם רכוב לעתים קרובות במים או תמיסה מימית עבור הדמיה לטווח קצר, מים יש קיבולת נמוכה עבור המסת CO2 ו O 2 (1.54 מ"ג / מ"ל ו 0.04 מ"ג / מ"ל, בהתאמה ב 20 ° C, 0.1 מגפ"ס) 4 , מה שהופךזה לא מתאים עבור זמן ארוך לשגות ניסויים. מערכות זלוף כי לשמור על רמות קבועות של חמצן וחומרים מזינים הם פתרון אחד לבעיה זו פותחו עבור מיקרוסקופיה לייזר סריקה confocal (CLSM) 1 , 2 , 3 ו מיקרוסקופ גיליון אור (LSM) 5 . מערכות כמו RootChip 2 ו RootArray 3 תוכננו במיוחד עבור זמן לשגות הדמיה של השורשים המתפתחים לערב נביטה זרעים במודל מותאם אישית לבנות רב הדגימה. סידורים אלה מבטיחים הפרעה מכנית מינימלית ומעוצבים לניתוח מקבילי של שתילים מרובים, אך אינם מותאמים להדמיה של מבנים תת-תאיים. קאלדר ועמיתיו עיצבו תא מורכבת יותר זלוף מבוסס הדמיה אופטימיזציה עבור הדמיה של מבנים subcellular שבו הדגימה מוחזקת בעמדה על ידי רשתכדי לאפשר את השימוש של עדשות טבילה הגדלה גבוהה 1 .
הציג כאן פתרון חלופי, פשוט לבעיה זו אשר אינו מבוסס על מערכות זלוף, אך מנצל perfluorodecalin (PFD), perfluorocarbon כי זכה לאחרונה הפופולריות כמדיום גובר עבור הדמיה ארבידופסיס 6 , 7 , 8 . ביישומים כאלה, קיבולת גבוהה של PFD עבור המסת CO 2 ו O 2 (1.9 גרם / מ"ל עבור O 2 ב PFD לעומת 0.04 מ"ג / מ"ל במים) 9 , מאפשר החלפת גזי ידי הרקמה שקוע. יתר על כן, PFD הוא לא פלואורסצנטי ומדד השבירה שלו (1.313) הוא דומה לזה של מים (1.333) והוא קרוב יותר לזה של cytosol (~ 1.4) מאשר אוויר (1.000) 6 . Fluluorocarbons דווחו יש השפעה מינימלית פיזיולוגית על מגוון רחב של צמחים צמח לאבעיות 6 , עם זרעי צנון נובטים בקלות כאשר שקוע PFD ומציג צמיחה נורמלית ופיתוח לפחות שני ימים מלאים, כאשר מסופק עם מים 10 . תצפיות דומות נעשו עבור נביטה של זרעי ארבידופסיס . בהתבסס על גירוי ראמאן פיזור ישיר לתמונה הפצה של PFD ב רקמות ארבידופסיס עלה לאחר חדירת, ליטג'ון ועמיתיו למסקנה כי PFD סביר להניח לא נלקח על ידי תאים חיים 8 . PFD בעבר שימש בעיקר כדי התמונה רקמות אוויר, שבו זה מגדיל באופן משמעותי את עומק הדמיה כפי שהוא בקלות חדירת מרחבי האוויר עקב מתח נמוך שלה משטח 6 . הנה, PFD הוא אימץ עבור הדמיה confocal לטווח ארוך של פיתוח שורשים לרוחב. בתצורה זו, שתילים אחד או יותר ממוקמות על לוח של בינונית צמיחה מוצק עם אגר ו שקוע PFD. PFD מאפשר gחילופי אדים בתא הדמיה, מניעת anoxia. PFD הוא נדיף מאוד ולכן הוא נשמר על ידי אטם של מסטיק פולי (dimethylsiloxane), כי יש גם חדירות גז גבוהה (1.5 x 10 -12 pmol מ -1 -1 s -1 אבא -1 עבור CO 2 ) 11 . חומרים מזינים ומים מסופקות על ידי לוח של solidified בינוני עם אגר. במקביל, זה לוח אגר בעדינות לוחץ את השורש נגד coverslip, ובכך לתקן את המיקום היחסי שלה בחדר הדמיה ומאפשר את השימוש ברזולוציה גבוהה עדשות טבילה במים. יתר על כן, לוח אגר ניתן להשתמש כדי לנהל מגוון של טיפולים תרופתי, כולל dexamethasone, oryzalin, ו isoxaben. תאי הדמיה ניתן להרכיב במספרים גדולים מן שקופיות מיקרוסקופ סטנדרטי באמצעות ציוד מינימלי. תאי ההדמיה פותחו ואופיינו ללימוד התפתחות שורש לרוחב, אך ניתנים להתאמה לדמיית איברים אחרים, כגון שורש ראשוני,היפוקוטילים.
Protocol
1. יצירת החדר
- באמצעות חותך זכוכית, לחתוך 3 מ"מ רצועות רחב מקצה שקופית מיקרוסקופ 1 מ"מ עבה. באמצעות דבק סופר cyanoacrylate או קלטת דו צדדית, דבק אלה רצועות זכוכית כ 45 מ"מ בנפרד על פני רוחב של שקופית מיקרוסקופ השני ( איור 1 א ). שקופית אחת לכל חדר נדרש, בתוספת שקופיות נוספות לשפוך לוחות אגר (שקופית אחת תניב 2-3 אגר לוחות). שקפים ניתן לעשות בה שימוש חוזר.
- בין רצועות הזכוכית, אופנה אטם של גובה זהה מתוך גומי חדיר פול (dimethylsiloxane) מסטיק. מניחים כדור של מסטיק פולי (dimethylsiloxane) על השקופית ( איור 1B ), רטוב שקופית השני עם כמות קטנה של אתנול מוחלט 100%, ולשטח את הכדור (dimethylsiloxane) מסטיק הכדור עם השקופית השנייה עד שהוא הגיע לגובה של רצועות זכוכית ( איור 1 ג ).
- אם יש צורך, לקצץ עודף פולי (שקלThylsiloxane) מסטיק עם להב סכין גילוח חוזר שטוח.
- בעזרת חותך מתאים או סכין גילוח הרטבו באתנול מוחלט, להסיר את החלק הפנימי של מסטיק פולי (dimethylsiloxane) כדי ליצור את חלל כי יהיה מאוחר יותר להחזיק את השתיל ואת לוח אגר ( איור 1D ).
- בזהירות לקצץ את הג 'ל עם להב גילוח ליצור אטם עם עובי דופן הסופי של כ 2 מ"מ ( איור 1E ). חדירות של גזים דרך מחסום פולי (dimethylsilaxane) הוא עצמאי של עובי מעל 50 מיקרומטר 11 .
2. יצירת אגר- solidified לוח של צמיחה בינונית
- על שקופית מיקרוסקופית עם שתי רצועות זכוכית, במקום coverslip (22 מ"מ x 50 מ"מ) כך שהוא נשען על שתי רצועות זכוכית.
- פיפטה נמס חצי כוח Murashige ו Skoog בינוני צמיחה המכיל 1% w / סוכרוז v ו 1.5% w / v אגר (½ MS) לתוך החלל וכתוצאה מכךמתחת coverslip עד האחרון הוא מלא לגמרי (כ 1 נפח נפח מלא) ולהשאיר עד אגר מוגדר (כ 5 דקות).
הערה: תרכובות פרמקולוגיות ניתן לנהל באמצעות לוח אגר על ידי הוספת ריכוזים מתאימים למדיום נוזלי לפני הלוח הוא שפך. זה נבדק בהצלחה עבור dexamethasone 12 , isoxaben, 2,6-dichlorobenzonitrile (DCB), אוריזלין, ו latrunculin B.
3 . מסיים את ההגדרה הקאמרית
- איזון האוויר PFD על ידי רעד נפח קטן של PFD בצינור 7 . הוסף כמות קטנה (כ 200 μL) של אוויר PFD equilibrated אל הבאר של אטם ג 'ל, אבל לא למלא את החדר לחלוטין. זה PFD יסייע למנוע את השמנה של בועות אוויר מתחת ללוח אגר כפי שהוא ממוקם לתוך החדר.
- הסר את coverslip מן לוח אגר (בשלב 2.2 לעיל) ולהשתמש סכין גילוח לחתוך חלק של דהגודל וצורה. ואז למקם אותו לתוך הבאר של אטם ג'ל ( איור 1F ). צריך להיות פער של 2-4 מ"מ על אטם מסביב.
- מלאו את החדר לחלוטין עם אוויר equilibrated PFD.
- מקום אחד או יותר שתלי thaliana A. (עד 3 שתילים עבור הדמיה מעל 2-3 ימים) על גבי לוח אגר עם cotyledons ו hypocotyl תלוי מעל הקצה, צף PFD ( איור 1G ).
- כדי להשיג שתילים, לעקר זרעים עם אתנול 70%, צמח על בינוני MS בינוני ½ בתוספת סוכרוז 1% ו אגר 0.8%, stratify עבור 2-4 ימים ב 4 ° C, ולגדול על לוחות בכיוון אנכי ב 22 ° C ב 16 שעה בהיר / 8 שעות משטר כהה. לקבלת הדמיה שורשים לרוחב, לגדל צמחים 7-10 ימים לפני העברת לתאי הדמיה.
- כדי לסגור את החדר, להחיל coverslip מתאימים את אופטיקה של המטרה, בעדינות לחיצה על זה עם קצה של שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עד coverslipנשענת על שתי רצועות זכוכית ( איור 1H ).
- לאבטח את coverslip עם רצועות של 1.25 ס"מ micropore רחב חיתוך סרט קלטת בחצי אורך חכם על כל קצה אם רוצים ( איור 1I ). אפשר הדגימה להסתפק כ 30 דקות לפני ההדמיה. זה ממזער את תנועת הדגימה במהלך ההדמיה.
- בצע הדמיה עם מיקרוסקופ זקוף כדי לשמור על מצע מבוקר לצמיחה. השתמש 20X / 0.7NA או 63X / 1.2NA מטרות CS2.
Representative Results
שורשים לרוחב לגדול בשיעורים פיזיולוגיים בתאי הדמיה.
אורך שורש הלוחות של תאים בתאי הדמיה נמדדו במרווחים לשעה ( איור 2 א , שמאל, סרט 1, n = 23) ושיעורי הצמיחה הושוו לאלה של שורשים לרוחב גדל על צלחות פטרי סטנדרטיים המכילים בינוני בינוני אגר זהה ( איור 2A , right, Movie 2, n = 23). שיעורי הצמיחה יכולים להשתנות במידה ניכרת בין שורשים לרוחב, עם אורך השורש להיות גורם אחד הקובע בשל אזורי יותר ויותר של צמיחה והתפשטות 13 . לכן, קבוצות של שורשים לרוחב נבחרו לייצג שורשים של אורכים הראשונית שונים (החל 50 מיקרומטר עד 1150 מיקרומטר) הן בחדר הדמיה צלחת אגר. אורך שורש ממוצע ממוצע בתחילת הניסויהיה דומה בכל סט (439 ו 442 מיקרומטר עבור תאי הדמיה וצלחות, בהתאמה). במרווח הזמן הניתוח של 27 שעות, גידול שורש לרוחב היה כמעט ליניארי הן בתאי הדמיה והן על לוחות, עם קצב צמיחה ממוצע של 52 מיקרומטר לשעה (R = 0.007) על צלחות ו- 51 מיקרומטר לשעה בתאי הדמיה ( R 2 = 0.993) ( איור 2 ב ). שיעורי הצמיחה של שורשים בודדים לרוחב שבו משתנה מאוד הן על צלחות בתאי הדמיה ( איור 2 ג ), הנעים בין 17 מיקרומטר / שעה עד 82 מיקרומטר / שעה בתאי הדמיה ו מ 13 מיקרומטר / שעה ל 87 מיקרומטר / שעות על צלחות. בעוד ששיעורי הצמיחה גדלו בדרך כלל עם אורך השורש, שיעורי הצמיחה עדיין השתנו במידה ניכרת בין שורשים באורך דומה, אך השונות הייתה דומה בתאי ההדמיה ובצלחות.
שורשים לרוחב להתרבות בתאי הדמיה והוא יכול להיות צילמו באמצעות היימטרות מספר הצמצם.
שורשים לרוחב שיתוף הבעת סמן קרום פלזמה NPSN12-YFP 14 ואת סמן microtubule UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15 היו צילמו CLSM 10 בשעה 1 מרווחי שעה לתעד התנהגות microtubule במהלך התפשטות תאים בתאי הדמיה ( איור 2 ד , סרט 3). בתאים אלה, שורשים לרוחב היו יציבים מאוד במצבם על x, y ו- z צירים, המאפשר רכישה של זמן מתמשך לשגות confocal ערמות על כמה שעות. תאים Meristematic ברציפות התפשטות, כפי שניתן לראות מהיווצרות של להקות preprophase ( איור 2 ד , חצים ירוקים), צירים מיטוטי ( איור 2 , חצים לבנים), ו phragmoplasts ( איור 2 , חיצים כחולים). כמו עם שתילים על צלחות פטרי,תאי שורש מוארכים במלואם בתאי הדמיה יזם שערות שורש ( איור 2 א , איור 2 ד , ראשי החצים), המציין עוד כי הפיתוח המשיך כצפוי בתאי הדמיה. כדי לספק שדה רחב של נוף, התמונות באיור 2D התקבלו עם מטרה 20x / 0.7 NA. כמו כן ניתן להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של שורשים לרוחב באמצעות צמצם מספרית גבוהה 63x / 1.2 NA טבילה במים המטרה ( איור 2E ).
שורש שורש הצמיחה מתמשכת בתאי הדמיה של עד שלושה ימים.
כדי לחקור כמה זמן דימות תאים יכול לתמוך בצמיחה שורש לרוחב בשיעורים פיזיולוגיים, אורך שורש לרוחב בתאי הדמיה (n = 27) ועל לוחות (n = 33) היה לכמת ב 0 שעות, 24 שעות, 48 שעות ו 72 שעות. השורשים צ'וסן היו קצרים מ 200 מיקרומטר ב 0 שעות, עם אורך שורש ממוצע לרוחב של 117 מיקרומטר בתאי הדמיה ו 121 מיקרומטר על צלחות. מאז שורשים קצרים לגדול לאט יותר בממוצע ( איור 2 ג ), הם גדלו על הקצה של לוח אגר בתדירות נמוכה יותר, היו קלים יותר לתמונה. הצמיחה הממוצעת של כל השורשים לרוחב לא היה שונה באופן משמעותי בתאי הדמיה לעומת צלחות פטרי הראשון 48 שעות ( איור 3 א ). עם זאת, הצמיחה הממוצעת הופחת באופן משמעותי בין 48 שעות ו 72 שעות ( איור 3 א ). בעוד ששיעורי הצמיחה נראים בדרך כלל מואטים בתאי הדמיה לאחר 48 שעות, שיעורי הצמיחה בין פרטים נשארים מאוד משתנים ( איור 3 ב , 3 ג ), כלומר, יש תת-קבוצה של שורשים לרוחב שגדלים בשיעורים דומים על לוחות ותאים על פני תקופת הצמיחה המלאה של 72 שעות. 23 מתוך 33 שורשים לרוחב גדלעל לוחות (69.7%) להגיע אורך בתוך סטיית תקן אחת של אורך ממוצע ב 72 שעות (בין 927 ו - 3,163 מיקרומטר, איור 3 ב , אדום). 10 מתוך 27 (37.0%) שורשים לרוחב בתאי הדמיה להגיע אורך בתוך מרווח זה ( איור 3 ב , אדום).
תאים הדמיה יכול בקלות להיות מותאם לשורשים לרוחב מבוגר, שורשים ראשוניים hypocotyls .
אחת המגבלות של העיצוב קאמרית הדמיה המקורי היה כי בעוד לוח אגר נוקשה בתנאי כמה התנגדות מכנית, שורשים גדל gravitropically בסופו של דבר חודר את לוח אגר, וכתוצאה מכך איבוד איכות התמונה ( איור 4 ב ) וצמיחה מעבר למרחק עבודה של NA גבוהה עדשות, אפילו את מרחק עבודה ארוך יחסית (0.3 מ"מ) 63X / 1.3 NA CS2 המטרה. שורשים צעירים לרוחב חסר stolith המכיליםתאים columella נדרש gravitropism 17 אז הם בתחילה גדל במקביל coverslip בתאי הדמיה ( איור 2E ). ככל שהם גדלים יותר columella ו statoliths טופס, שורשים לרוחב התערוכה gravitropism חיובית גוברת, בעוד השורשים העיקריים התערוכה תגובה gravitropic חזקה מן הנביטה ואילך. זה מגביל לכמה שעות את התקופה שבה השורשים העיקריים ניתן הדמיה וזה מגביל מאוד את אורך ההתחלה של שורשים לרוחב זה יכול להיות צילמו ברציפות במשך 48 שעות או יותר. כדי להתגבר על מגבלה זו, החדר היה שונה כך צמיחה מתוחזקת במקביל coverslip על ידי קרום צלופן תאית שפועל כמחסום חדירה על פני השטח של לוח אגר ( איור 4 א ). ניסיונות ראשוניים באמצעות לוח אגר 1.5% גרמו לצמיחה שורש מופחתת בתוך 24 שעות הראשון, בגלל אולי מתח מכני. ריכוזי אגר תחתון בלוח נבדקוד נמצא כי בתאי עם לוח המכיל אגר 0.8% ו תאית הסרט, שיעורי שורש צעירים לרוחב לא שונה באופן משמעותי משיעורי הצמיחה בתאי קונבנציונאלי הראשון 48 שעות. עבור 0-24 שעות, גידול שורש ממוצע בתאי תא ותאי קונבנציונאלי היה 242 מיקרומטר ו 262 מיקרומטר בהתאמה (p = 0.78 סטודנט של מבחן) ו עבור 24-48 שעות היה 330 מיקרומטר ו 355 מיקרומטר 1 בהתאמה (p = 0.67 סטודנט T-Test); N = 12 ו- n = 11, בהתאמה. הסדר זה מנע שורשים לרוחב מן הצומח מן coverslip, לתוך אגר, וגם מותר הדמיה של שורשים ראשוניים עד 48 שעות ( איור 4 ג ).
כדי לבדוק אם תאי הדמיה יכולים להיות מותאמים לאיברים שאינם שורשים, נבחרו היפוקוטילים של ארבידופסיס. Hypocotyls הם עבים באופן משמעותי מאשר שורשים כל כך בחדר הדמיה קונבנציונלית, c העליוןElls היו לחוצים נגד coverslip, המוביל דפורמציה. עיצוב חלופי פותח ולכן באמצעות שקופיות חלל המכילים דיכאון סגלגל במרכז שלהם ( איור 4D ). בתצורה זו, 1 מ"מ עובי לוח אגר (מוכן כמו 2.2 לעיל) היה ממוקם עם קצה אחד בולט על ידי כמה מ"מ לתוך חלל שקופית ( איור 4D ). Hypocotyls היו ממוקמים מעל חלל בשקופית בעוד השורש היה ממוקם מעל החלק האופקי. זה הבטיח כי שתיל נקבע בחלל על ידי השורש, אבל hypocotyl לא מעוך. בעוד שיעורי הצמיחה בתאי לעומת צלחות לא לכמת באופן שיטתי, hypocotyls בתאי הדמיה הציג את הגל המתואר היטב של צמיחה האורך נודדים את hypocotyl ( איור 4E , 4F ) 16 .
איור 1 : הרכבת תא הדמיה. כל הפרטים מתוארים בטקסט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 : שורשים לרוחב לגדול בתנאים פיזיולוגיים בתאי הדמיה. ( א ) ארבידופסיס פיתוח שורש לרוחב בחדר הדמיה (משמאל) ועל צלחת (מימין) מעל 25 שעות (הדגירה אור קבוע, אופקית, הדמיה בו זמנית). סולם ברים = 200 מיקרומטר. ( ב ) מגרש המציג אורכי שורש לרוחב מעל 27 שעות (נמדד במרווחים 1 שעות), של שורשים לרוחב כפי שמוצג ( א ). אינדיבידואליתשורשים Ual זממו באפור (n = 23 עבור צלחות ותאי הדמיה), אורך ממוצע כמו עיגולים אדומים. שורות שגיאה = 1 SD. הקו האדום הוא בכושר ליניארי דרך אורך ממוצע. ( ג ) מגרש המציג שיעור צמיחה ממוצע עבור כל השורשים לרוחב שמוצג ב () ביחס לאורך הראשוני שלהם. ( ד ) תחזיות בעוצמה מקסימלית של ערימות confocal 3D רכשה שורשים לרוחב להביע NPSN12-YFP ו- RFP-TUB6 בנקודות זמן רצופות. הבלעה: הגדלה של האזור המצורף. חיצים ירוקים: להקות מראש; חצים לבנים: צירים מיטיוטים; כחול החצים: phragmoplasts; ראשי חץ: שערות שורש. ( E ) תחזיות בעוצמה מקסימלית של תמונות ברזולוציה גבוהה רכשה שורש לרוחב צעיר של קו מהונדס שמוצג ב ( D ) באמצעות מטרה 63X / 1.2 NA ו Nyquist דגימה (פיקסלים ממדים 77 ננומטר x 77 ננומטר) ב 0 h ו 16 H כוכביות לאתר תאים זהים בכל נקודת זמן; חץ מציין התא המתחלק בין 0h ו 16 שעות.סולם ברים = 50 מיקרומטר (AC); 20 מיקרומטר (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 : פיתוח שורש ארוך הטווח לרוחב בתאי הדמיה. ( א ) מגרש המציג הממוצע שורש מוחלט צמיחה בשלושה רצופים 24 שעות רצופות בתאי הדמיה לעומת צלחות. Ns מציין p> 0.05; *** מציין p <0.001 (סטודנט t-test). N = 33 (צלחות) ו- n = 27 (תאי הדמיה). ( ב ) מגרש מראה אורכי שורש לרוחב בנקודות זמן רצופות על כל השורשים המשמשים (א). אדום: כל השורשים לרוחב עם אורך סופי בתוך 1 SD של הממוצע של כל השורשים לרוחב גדל על צלחות (בין 927 ו 3163 מיקרומטר). ( ג ) מקסימום בתחזיות צפיפות של נציג ערימות confocal 3D של סמן פלזמה קרום NPSN12-YFP בשורשים לרוחב, רכשה בנקודות זמן רצופות מעל 72 שעות. סולם ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 : תאי הדמיה יכולים להיות מותאמים לאיברי צמחים אחרים. ( A - C ) הדמיה תא קאמארי עבור שורשים ראשוניים. ( א ) סכמטי של עיצוב קאמרית הדמיה. זה זהה לעיצוב הסטנדרטי ( איור 1 ) מלבד שני שינויים: לוח בינוני MS מכיל אגר 0.8% במקום אגר 1.5%, סרט תאית (אדום) ממוקם בין אגר הצמח כדי למנוע צמיחהלתוך אגר. ( ב ) XY (העליון) ו XZ (התחתונה) תחזיות בעוצמה מקסימלית של נציג ערימות confocal 3D של סמן פלזמה קרום NPSN12-YFP בשורש העיקרי של שתיל בן 7 יום צילמו ב 0 שעות ו 48 שעות הדמיה קונבנציונאלי תָא. שים לב כי השורש גדל לתוך אגר בשל התגובה gravitropic שלה. ( ג ) XY (העליון) ו XZ (התחתונה) תחזיות בעוצמה מקסימלית של נציג ערימות confocal 3D של סמן פלזמה קרום NPSN12-YFP בשורש העיקרי של שתיל בן שבעה ימים צילמו ב 0 שעות ו 48 שעות ההדמיה תא עם סרט תאית. לפני היישום, הסרט תאית היה מעוקר באתנול 80% ו ספוג נוזלי ½ בינוני MS. שים לב צמיחה gravitropic של השורש לתוך האגר הוא מנע. ( D - F ) הדמיה התאמת קאמרית עבור hypocotyls. ( ד ) סכמטי מציג hypocotyl הדמיה עיצוב קאמרית. פולי (dimethylsiloxane) מסטיק אטם (אפור) הוא manufactuאדום על שקע חלל בין שני רצועות זכוכית (צהוב). לוח של אגר 1.5% של עובי אפילו (בז ') ממוקם על השקופית, חלקית להגיע לתוך חלל. החדר מלא PFD (כחול). שתילים ממוקמים על לוח אגר כך hypocotyl תופסת את האזור slopesing כלפי מטה של לוח אגר בחלל בעוד השורש ממוקם החלק האופקי של אגר. החדר סגור עם coverslip. ( E ) תחזיות בעוצמה מקסימלית של נציג ערימות confocal 3D של סמן קרום פלזמה NPSN12-YFP בהיפוקוטיל של שתיל בן יומיים, צילמו מעל 48 שעות בנקודות זמן רצופות. ( F ) הצמיחה האורךית בשני מרווחי זמן רצופים של תאים בודדים לאורך הציר הבסיסי לציר האפיטי (מיקומים יחסיים ב- 0 h לאורך הציר שמוצג ב- E) של ההיפוקוטיל שמוצג ב- ( E ). שים לב גל המתואר בעבר של צמיחה נודדים את hypocotyl 16 . סולם ברים = 100 μM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.
סרט 2: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.
סרט 3: בבקשה cללקק כאן כדי להוריד את הסרט הזה.
Discussion
השיטה המוצגת כאן היא אסטרטגיה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה הדמיה confocal של פיתוח שורשים לרוחב עבור שניים עד שלושה ימים. בתקופות של עד 48 שעות, לא נצפו תופעות לוואי של מערכת ההדמיה על התפתחות שורש לרוחב. לאחר 48 שעות, הצמיחה השורשית הממוצעת החלה להאט, אם כי תת-קבוצה משמעותית של השורשים (37%) המשיכה לצמוח בקצב דומה לצמיחת השורש הממוצעת בצלחות. לכן, באמצעות הדמיה מספר גדול מספיק של שורשים, שורשים אשר הצמיחה איטית לאחר 48 שעות ניתן להרחיק. בדיקות סיסטמטיות של תאי ההדמיה לא בוצעו לתקופות ארוכות יותר מ -72 שעות, אך מומלץ להשתמש באסטרטגיות חלופיות אם יש צורך בתקופות הדמיה מורחבות. תאי הדמיה עשויים להישאר על הבמה מיקרוסקופ ברציפות, אם בתנאי הסביבה מתאימים מסופקים, או מוסר למתקן הצמיחה ומדי פעם חזר למיקרוסקופ. זה מאפשר חדרים רבים להיות צילמו במקביל/ P>
אחד היתרונות של החדרים המתוארים כאן הוא כי שורשים לרוחב קבועים במצבם והוא יכול להיות צילמו באמצעות ברזולוציה גבוהה עדשות טבילה במים. יציבות מרחבית ביקורתית תלוי ריכוז אגר בשימוש לוח אגר תמיכה. בתחילה נבדקו ריכוזים שונים של אגר 0.8% ל אגר של 2%, ומצאו כי ריכוזים גבוהים בטווח זה קבועים בשורשים קבועים בחלל, אך שורש הצמיחה הואט מהר יותר וחלק מהשורשים הראו סימני לחץ מכני, כולל התארכות תא מופחתת. לעומת זאת, ריכוזי אגר נמוכים לא סיפקו את התמיכה והשורשים הנדרשים ב- x, y ו- z במהלך ההדמיה. אופטימלית 1.5% אגר לוח מתקן את המיקום של הדגימה ללא תופעות מכניות שליליות. בתנאים אלה, לאחר ההתיישבות ב 30 דקות הראשונות או כך, שורשים יציבים על פני שעות רבות, המאפשר רכישת נתונים לילה. במהלך רכישת נתוני 4D, טווחי ערימת z היו בדרך כלל במחוררים על ידי 5-10 מיקרומטר נוסף אבל זה היה בעיקר כדי להתאים לצמיחה מחוץ לגובה של שורשים לרוחב ולא z- להיסחף או לנענע. למרות ריכוז אגר סטנדרטי מספק התנגדות מסוימת נגד חדירה, שורשים gravitropically גדל בסופו של דבר לחדור את אגר. עם זאת, באמצעות שינוי קטין של החדר הדמיה, שורש הצמיחה יכולה להישמר מקביל coverslip, המאפשר שורשים לרוחב מבוגר השורשים העיקריים להיות צילמו. יתר על כן, חדר הדמיה בסיסי יכול בקלות להיות מותאם אישית עבור hypocotyls. Hypocotyls הם יותר חופשי צף במערכת זו כך Z- ציר סוגר לרכישת התמונה הוגדלה בדרך כלל על 20 מיקרומטר. במחקר זה, מיקרוסקופ זקוף שימש בכל רחבי, אשר אפשרה את מאפייני המצע להיות נשלט. תא הדמיה יכול להיות מותאם לתצורות מיקרוסקופ הפוכה אבל ההשפעה תלוי זמן של coverslip נוקשה על מיירט איברים יהיה צורך להעריך. Littlejohn ועמיתיו יש לציין כי PFD עצמו אינו בקלות להמיס מולקולות ביולוגיות, כלומר זה לא ניתן להשתמש עבור ישירות עבור משלוח של תרכובות פרמקולוגיות 7 . בעיה זו היה להתגבר על ידי אספקת תרכובות כאלה דרך לוח של המדידה הצמיחה מוצק שבו מוטלת אגר. בעוד מערכות זלוף יישארו השיטה של בחירה עבור לשטוף- out ניסויים, תא הדמיה שימש בהצלחה עבור ניהול של dexamethasone 12 ותרכובות אחרות. הערה אחת, בעוד מאמר זה היה בהכנה פון Wagenheim ועמיתיו 18 תיאר חדר הדמיה פיתוח שורש לרוחב באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לפרופ 'ג' פרי ווסטנייס, אוניברסיטת בריטיש קולומביה, על זרע להביע RFP-TUB6 ו סוקר אנונימי עבור תיקונים מועיל. אנו אסירי תודה לפרופ 'יו דיקינסון על כך שהזהיר אותנו להשתמש בסרט תאית כתמיכה מכנית ולג'ון בייקר לצילום. עבודה זו נתמכה על ידי מחקר BBSRC מעניק BB / G013993 / 1 ו- BB / D004055 / 1 ל- IM, וכן פרס BBSRC הדרכה דוקטורנט מלגות קלרנדון CK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
| Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
| Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
| Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80 mm disc |
References
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Meth. 11, 22 (2015).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression. Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).
- Baranenko, V., et al. Solubility of oxygen and carbon dioxide in water. Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. Plos One. 6, (2011).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).
- Littlejohn, G. R., Love, J. A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium. J Vis Exp. , (2012).
- Littlejohn, G. R., et al. An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology. Front Plant Sci. 5, 140 (2014).
- Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons. Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes. J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).
- Kirchhelle, C., et al. The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis. Dev Cell. 36, 386-400 (2016).
- Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
- Geldner, N., et al. Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set. Plant J. 59, 169-178 (2009).
- Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis. Nat Commun. 2, 430 (2011).
- Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).
- Gendreau, E., et al. Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).
- von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel. J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).
