Summary
Presentert her er en enkel teknikk for høyoppløselig konfokal time-lapse avbildning av rot- og hypokotylutvikling i opptil 3 dager ved bruk av høye numeriske blendermål og perfluorodekalin som et nedsenkingsmedium.
Abstract
Flere aspekter av planteutvikling, som lateral rotmorfogenese, forekommer på tidsrom på flere dager. For å undersøke underliggende cellulære og subcellulære prosesser, kreves mikrologistrategier for høy oppløsning med tidsbesparelse som opprettholder fysiologiske forhold. Plantevev må ha tilstrekkelig nærings- og vannforsyning med vedvarende gassutveksling, men når de er nedsenket og immobilisert under et deksel, er de spesielt utsatt for anoksi. En strategi som har vært vellykket ansatt er bruk av et perfusjonssystem for å opprettholde en konstant tilførsel av oksygen og næringsstoffer. Imidlertid kan slike arrangementer være kompliserte, besværlige og kreve spesialisert utstyr. Presentert her er en alternativ strategi for et enkelt bildebehandling system som bruker perfluorodecalin som et nedsenkingsmedium. Dette systemet er enkelt å sette opp, krever minimalt utstyr, og er enkelt montert på et mikroskop-trinn, slik at flere bildekamre kan settes opp og avbildes i parallel. I dette systemet er laterale rotveksttyper skiller seg ut fra vekstratene under standardbetingelser på agarplater de første to dagene, og lateral rotvekst fortsetter med reduserte hastigheter i minst en annen dag. Plantevev leveres med næringsstoffer via en agarplate som også kan brukes til å administrere en rekke farmakologiske forbindelser. Systemet ble etablert for å overvåke lateral rotutvikling, men er lett å tilpasse seg til andre planteorganer som hypokotyler og primære røtter.
Introduction
For å studere cellulære og subcellulære prosesser som ligger til grund for planteutviklingen, er det en økende etterspørsel etter langvarige tidsbegrensede bildestrategier. En sentral utfordring i slike bildeeksempler er vedlikehold av fysiologiske forhold, inkludert tilstrekkelig gassutveksling pluss tilførsel av vann og næringsstoffer 1 , 2 , 3 . For å utnytte mål med høye numeriske åpninger for optimal optisk oppløsning, bør prøvene plasseres i umiddelbar nærhet og orientert parallelt med dekselet. Bevegelse i x, y og z retninger bør ideelt sett være minimal under bildebehandling.
Mens kimplanter ofte er montert i vann eller vandig løsning for kortsiktig bildebehandling, har vann en lav kapasitet for oppløsning av CO 2 og O 2 (1,54 mg / ml og 0,04 mg / ml henholdsvis ved 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , som gjørDet er uegnet for utvidede tidsforsinkelsesforsøk. Perfusjonssystemer som opprettholder konstante nivåer av oksygen og næringsstoffer er en løsning på dette problemet og har blitt utviklet for både konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) 1 , 2 , 3 og lysmikroskopi (LSM) 5 . Systemer som RootChip 2 og RootArray 3 er designet spesielt for tidsavbrudd av bilding av utviklende røtter og involverer spiring av frø i en skreddersydd flerprøve enhet. Disse ordningene sikrer minimal mekanisk forstyrrelse og er konstruert for parallell analyse av flere plantinger, men er ikke optimalisert for avbildning av subcellulære strukturer. Calder og kolleger har designet et mer komplisert perfusjonsbasert bildekammer optimalisert for avbildning av subcellulære strukturer der prøven holdes på plass med et nettFor å tillate bruk av høy forstørrelsesdyse linser 1 .
Presentert her er en alternativ, enkel løsning på dette problemet, som ikke er basert på perfusjonssystemer, men benytter perfluorodekalin (PFD), en perfluorkarbon som nylig har blitt populær som et monteringsmedium for arabidopsis-bildebehandling 6 , 7 , 8 . I slike applikasjoner tillater den høye kapasitet av PFD for oppløsning av CO 2 og O 2 (1,9 g / ml for O 2 i PFD sammenlignet med 0,04 mg / ml i vann) 9 , gassutveksling ved det nedsenkede vev. Videre er PFD ikke-fluorescerende, og dens brytningsindeks (1.313) er sammenlignbar med den for vann (1,333) og er nærmere den for cytosol (~ 1,4) enn luft (1,000) 6 . Perfluorokarboner har blitt rapportert å ha minimal fysiologisk effekt på en rekke planter og planterProblem 6 , med røkelsesfrø som sprer seg lett når nedsenket i PFD og utviser normal vekst og utvikling i minst to fulle dager når den leveres med vann 10 . Lignende observasjoner har blitt gjort for germinating Arabidopsis frø 6 . Basert på stimulert Raman-spredning for å direkte bilde fordelingen av PFD i Arabidopsis bladvev etter infiltrering, konkluderer Littlejohn og kolleger at PFD sannsynligvis ikke er tatt opp av levende celler 8 . PFD har tidligere blitt brukt hovedsakelig til luftvev i bildene, hvor det øker bildedybden betydelig, da den lett infiltrerer luftrom på grunn av dens lave overflatespenning 6 . Her er PFD vedtatt for langsiktig konfokal avbildning av utvikling av laterale røtter. I denne konfigurasjonen plasseres en eller flere frøplanter på en plate av vekstmedium størknet med agar og nedsenket i PFD. PFD tillater gAseous utveksling i bildekammeret, forebyggende anoxi. PFD er svært flyktig, slik at den holdes av en pakning av poly (dimetylsiloksan) tannkjøtt som også har høy gasspermeabilitet (1,5 x 10-12 pmol m -1 s -1 Pa -1 for CO 2 ) 11 . Næringsstoffer og vann leveres av mediumplaten størknet med agar. Samtidig presser denne agarplaten forsiktig mot roten mot dekselglasset, og dermed fester den relative posisjonen i bildekammeret og tillater bruk av vannoppløsningslinser med høy oppløsning. Videre kan agarplaten brukes til å administrere en rekke farmakologiske behandlinger, inkludert dexametason, oryzalin og isoksaben. Bildekamrene kan monteres i store mengder fra standardmikroskopisk lysbilder ved hjelp av minimalt utstyr. Bildekamrene ble utviklet og karakterisert for å studere lateral rotutvikling, men er tilpassbare til å avdekke andre plantelegemer, som primære rottepenner oghypocotyls.
Protocol
1. Opprette kammeret
- Ved hjelp av en glass cutter, kutt 3 mm brede striper fra enden av en 1 mm tykk mikroskop glide. Lim en glassstrimmel ca. 45 mm fra hverandre over bredden av et andre mikroskopdia ( Figur 1A ) ved hjelp av et super-lim eller dobbeltsidig tapet av cyanoakrylat. Det kreves ett lysbilde pr. Kammer, pluss ytterligere lysbilder for å helle agarplater (ett lysbilde vil gi 2-3 agarplater). Lysbilder kan gjenbrukes.
- Mellom glassstrimlene mote en pakning med identisk høyde ut av gassgennemtrængende poly (dimetylsiloksan) tannkjøtt. Legg en ball med poly (dimetylsiloksan) tyggegummi på lysbildet ( figur 1B ), våt en andre lysbilde med en liten mengde 100% absolutt etanol, og flatt poly (dimethylsiloxan) gummibollen med det andre lysbildet til den har nådd høyden Av glassstrimlene ( figur 1C ).
- Om nødvendig, trim overflødig poly (dimeTylsiloksan) tannkjøtt med et knivblad og repeterende flattening.
- Ved å bruke et egnet kutter- eller knivblad fuktet i absolutt etanol, fjerner du den indre delen av poly (dimethylsiloxan) tannkjøttet for å lage hulrommet som senere vil holde kimplanten og agarplaten ( Figur 1D ).
- Tørk forsiktig gelen med et knivblad for å lage en pakning med en endelig veggtykkelse på ca. 2 mm ( figur 1E ). Gasspermeabiliteten gjennom en poly (dimetylsilaxan) barriere er uavhengig av tykkelser over 50 um 11 .
2. Opprette den agar-størkne slab av vekstmedium
- På et mikroskopisk lysbilde med to glassstrimler legger du en deksel (22 mm x 50 mm) slik at den hviler på begge glassstrimlene.
- Pipettsmeltet halvstyrke Murashige og Skoog vekstmedium inneholdende 1% vekt / volum sukrose og 1,5% vekt / volum agar (½ MS) i den resulterende plassUnder dekslet til den sistnevnte er fullstendig fylt (ca. 1 ml totalt volum) og la til agar er satt (ca. 5 min).
Merk: Farmakologiske forbindelser kan administreres gjennom agarplaten ved å tilsette passende konsentrasjoner til væskemediet før platen helles. Dette ble vellykket testet for dexametason 12 , isoksaben, 2,6-diklorbenzonitril (DCB), oryzalin og latrunculin B.
3 . Avslutning av oppsettet for kammeret
- Luftekvilibrere PFD ved å riste et lite volum PFD i et rør 7 . Tilsett en liten mengde (ca. 200 μL) luftekvivalert PFD til brønnen på gelpakningen, men fyll ikke kammeret helt. Denne PFD vil bidra til å unngå fangst av luftbobler under agarplaten når den plasseres i kammeret.
- Fjern dekselet fra agarplaten (i trinn 2.2 ovenfor) og bruk et knivblad for å kutte av en del av deStørrelse og form. Legg deretter det i brønnen på gelpakningen ( Figur 1F ). Det bør være et gap på 2-4 mm til pakningen rundt.
- Fyll kammeret helt med luftekvivalent PFD.
- Plasser en eller flere A. thaliana frøplanter (opptil 3 frøplanter for avbildning over 2-3 dager) på agarplaten med cotyledonene og hypokotylen som henger over kanten, flyter i PFD ( Figur 1G ).
- For å få frøplanter, steriliser frø med 70% etanol, plant på ½ MS medium tilsatt 1% sukrose og 0,8% agar, stratifiser i 2-4 dager ved 4 ° C og vokse på vertikalt orienterte plater ved 22 ° C i en 16 H lys / 8 timer mørkt regime. For avbildning av laterale røtter, dyrk planter i 7-10 dager før overføring til bildekamre.
- For å lukke kammeret må du bruke en deksel som passer til objektets optikk, forsiktig presse den ned med kanten av et glassmikroskopi til dekseletHviler på begge glassstrimler ( figur 1H ).
- Sikre dekselet med striper med 1,25 cm bredt mikroporisk kirurgisk tape kuttet halvveisvis på hver ende hvis ønskelig ( figur 1I ). La prøven avgjøre i ca. 30 minutter før bildet avbildes. Dette minimerer prøvebevegelsen under avbildning.
- Utfør avbildning med et oppreist mikroskop for å opprettholde et kontrollert substrat for vekst. Bruk 20X / 0.7NA eller 63X / 1.2NA CS2 mål.
Representative Results
Laterale røtter vokser ved fysiologiske forhold i bildekamre.
Laterale rotlengder av planter i bildekamre ble målt med timeplasser ( figur 2A , venstre, film 1, n = 23) og veksthastigheter ble sammenlignet med de av laterale røtter dyrket på standard petriplater inneholdende det samme agar-størkne medium ( figur 2A , høyre, film 2, n = 23). Vækstraten kan variere betydelig mellom laterale røtter, med rottens lengde som en avgjørende faktor på grunn av stadig flere soner av vekst og spredning 13 . Derfor ble sett av laterale røtter valgt for å representere røtter med forskjellige innledende lengder (fra 50 til 1150 um) i både avbildningskammeret og agarplaten. Gjennomsnittlig lateral rot lengde i begynnelsen av eksperimentetVar lik i hvert sett (439 og 442 um for imagingkamre og plater, henholdsvis). I det analyserte tidsintervallet på 27 timer var sidelengsveksten omtrentlig lineær både i bildekamre og på plater, med en gjennomsnittlig vekstrate på 52 μm / t (R2 = 0,997) på plater og 51 μm / t i bildekamre ( R2 = 0,993) ( Figur 2B ). Vekstfrekvenser for individuelle laterale røtter hvor det er svært variabel både på plater og i bildekamre ( figur 2C ), fra 17 μm / t til 82 μm / t i bildekammer og fra 13 μm / t til 87 μm / t på plater. Selv om vekstraten generelt økte med rotens lengde, varierte vekstratene vesentlig mellom røtter av tilsvarende lengde, men variansen var lik i bildekamre og på plater.
Laterale røtter sprer seg i bildekamre og kan avbildes ved hjelp av heiGh numerisk-aperture mål.
Laterale røtter som uttrykker plasmamembranmarkøren NPSN12-YFP 14 og mikrotubulatormarkøren UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15 ble avbildet av CLSM 10 med intervaller på 1 time for å dokumentere mikrotubulær oppførsel under celleproliferasjon i bildekamre ( Figur 2D , film 3). I disse kamrene var laterale røtter svært stabile i sin posisjon på x-, y- og z-aksene, noe som tillot oppkjøpet av kontinuerlige tidsforskjellige konfokale stabler over flere timer. Meristematiske celler prolifereres kontinuerlig, slik det fremgår av dannelsen av preprophase-bånd ( Figur 2D , grønne piler), mitotiske spindler ( Figur 2D , hvite piler) og phragmoplaster ( Figur 2D , blåpiler). Som med frøplanter på petriplater,Helt langstrakte rotceller i bildekamrene initierte rothår ( figur 2A , figur 2D , pilhoder), noe som indikerer videre at utviklingen fortsatte som forventet i bildekamrene. For å gi et bredt synsfelt ble bildene i figur 2D oppnådd med et 20x / 0,7 NA-objektiv. Det var også mulig å oppnå høyoppløselige bilder av laterale røtter ved hjelp av et høyt numerisk apertur 63x / 1,2 NA vanndypingsmål ( figur 2E ).
Lateral rotvekst er opprettholdt i bildekamre i opptil tre dager.
For å undersøke hvor lenge imagingkamre kunne støtte sidelengs vekst ved fysiologiske satser, ble sidelengs lengde i bildekamre (n = 27) og på plater (n = 33) kvantifisert på 0 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer. Røttene choSen var kortere enn 200 μm ved 0 timer, med en gjennomsnittlig lateral rot lengde på 117 μm i bildekammer og 121 μm på plater. Siden kortere røtter vokser langsommere i gjennomsnitt ( Figur 2C ), vokste de over kanten av agarplaten sjeldnere, og var lettere å bilde. Den gjennomsnittlige veksten av alle laterale røtter var ikke signifikant forskjellig i bildekamre sammenlignet med Petri-platene i de første 48 timene ( figur 3A ). Den gjennomsnittlige veksten ble imidlertid betydelig redusert mellom 48 timer og 72 timer ( figur 3A ). Selv om vekstratene ser ut til å senke generelt i bildekamre etter 48 timer, forblir vekstratene mellom individer svært variabel ( figur 3B , 3C ), noe som betyr at det er en betydelig delmengde av laterale røtter som vokser til sammenlignbare priser på plater og i kamre Over hele 72 h vekstperioden. 23 av de 33 sidevortene vokstPå platene (69,7%) når en lengde innen en standardavvik av gjennomsnittlig lengde på 72 timer (mellom 927 og 3 163 μm, figur 3B , rød). 10 av 27 (37,0%) laterale røtter i bildekamre når en lengde innenfor dette intervallet ( Figur 3B , rød).
Imagingkamre kan enkelt tilpasses for eldre laterale røtter, primære røtter og hypokotyler .
En av begrensningene i det opprinnelige billedkammerdesign var at mens den stive agarplaten ga noe mekanisk motstand, trengte gravitropisk voksende røtter til slutt agarplaten, noe som resulterte i tap av bildekvalitet ( figur 4B ) og vekst utover arbeidsavstanden til høy NA Linser, til og med den relativt lange arbeidsavstanden (0,3 mm) 63X / 1,3 NA CS2-objektiv. Unge laterale røtter mangler statolittholdigeKolumellaceller som kreves for gravitropisme 17, slik at de i utgangspunktet vokste parallelt med dekselglasset i bildekamre ( figur 2E ). Etter hvert som de vokser lengre og columella og statolitter former, viser laterale røtter økende positiv gravitropisme, mens primære røtter utviser en sterk gravitropisk respons fra spiring og utover. Dette begrenser i noen timer perioden over hvilke primære røtter kan avbildes og det begrenser alvorlig startlengden til laterale røtter som kan avbildes kontinuerlig i 48 timer eller mer. For å overvinne denne begrensningen ble kammeret modifisert slik at veksten opprettholdes parallelt med dekselglasset av en cellulosecellofanmembran som virker som en penetreringsbarriere på overflaten av agarplaten ( figur 4A ). Første forsøk på å bruke en 1,5% agarplate forårsaket redusert rotvekst i løpet av de første 24 t, på grunn av kanskje mekanisk stress. Lavere agar konsentrasjoner i platen ble testet enD Det ble funnet at i kamre med en plate som inneholdt 0,8% agar og cellulosefilm, var det ikke signifikant forskjeller mellom unge sidestøttevaksjoner fra vekstratene i konvensjonelle kamre i de første 48 timene. I 0-24 timer var gjennomsnittlig rotvekst i cellulosekamre og konvensjonelle kamre 242 μm og 262 μm (p = 0,78 Studentens t-Test) og i 24-48 timer var henholdsvis 330 μm og 355 μm 1 (p = 0,67 Studentens t-Test); N = 12 og n = 11. Dette arrangementet forhindret effektivt at laterale røtter vokste bort fra dekslet, inn i agaret, og tillot også avbildning av primærrøttene i opptil 48 timer ( figur 4C ).
For å teste om bildekamrene kunne tilpasses for andre organer enn røtter, ble arabidopsis hypokotyler valgt. Hypokotyler er vesentlig tykkere enn røtter så i det konvensjonelle bildekammeret, den øverste cElls ble presset mot dekselet, noe som førte til deformasjon. En alternativ design ble derfor utviklet ved hjelp av hulrør som inneholder en oval depresjon i senteret ( Figur 4D ). I denne konfigurasjonen ble en 1 mm tykk plater av agar (fremstilt som i 2.2 ovenfor) plassert med en ende som rakte ut med noen få mm inn i glideskålen ( figur 4D ). Hypokotyler ble plassert over hulrommet i lysbildet mens roten ble plassert over den horisontale delen. Dette sørget for at frøplanten ble festet i rommet ved roten, men hypokotylen ble ikke squashed. Mens vekstraten i kamre sammenlignet med plater ikke ble systematisk kvantifisert, viste hypokotyler i bildekamre den velbeskrevne bølgen av langsgående vekst som migrerte opp hypokotylen ( Figur 4E , 4F ) 16 .
Figur 1 : Montering av et bildekammer. Alle detaljer er beskrevet i teksten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Laterale røtter vokser under fysiologiske forhold i bildekamre. ( A ) Arabidopsis lateral rotutvikling i et bildekammer (til venstre) og på en plate (høyre) over 25 timer (konstant lys, horisontal inkubasjon, samtidig bildebehandling). Skalestenger = 200 μm. ( B ) Plot som viser laterale rotlengder over 27 timer (målt i intervaller på 1 time), med røde sider som vist i ( A ). individUalrødder tegnet i grått (n = 23 for plater og bildekamre), gjennomsnittlig lengde som røde sirkler. Feilstenger = 1 SD. Rød linje er lineær passform gjennom gjennomsnittslengder. ( C ) Plot som viser gjennomsnittlig vekstrate for alle laterale røtter vist i ( B ) i forhold til deres innledende lengde. ( D ) Maksimal intensitetsprojeksjoner av 3D-konfokale stabler oppnådd fra laterale røtter som uttrykker NPSN12-YFP og RFP-TUB6 på påfølgende tidspunkter. Inset: Forstørrelse av boksregion. Grønne piler: preprophase band; Hvite piler: mitotiske spindler; Blå piler: phragmoplasts; Arrowheads: rot hår. ( E ) Maksimalintensitetsprojeksjoner av høyoppløselige bilder oppnådd fra en ung lateralrot av den transgene linjen vist i ( D ) ved hjelp av et 63X / 1,2 NA-mål og Nyquist-sampling (pikselmål 77 nm x 77 nm) ved 0 timer og 16 h; Stjerner finner identiske celler ved hvert tidspunkt; Pil indikerer en celle som deler mellom 0 og 16 timer.Skalestenger = 50 μm (AC); 20 μm (E). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 : Langsiktig lateral rotutvikling i bildekamre. ( A ) Plot som viser gjennomsnittlig absolutt rotvekst i tre påfølgende 24 timers intervaller i bildekamre sammenlignet med plater. Ns indikerer p> 0,05; *** indikerer p <0,001 (student t-test). N = 33 (plater) og n = 27 (bildekamre). ( B ) Plot som viser laterale rotlengder på påfølgende tidspunkter på alle røttene som brukes i (A). Rød: Alle laterale røtter med en endelig lengde innen 1 SD av gjennomsnittet av alle laterale røtter dyrket på plater (mellom 927 og 3163 μm). ( C ) Maksimum iTynnprojeksjoner av representative 3D-konfokale stabler av plasmamembranmarkøren NPSN12-YFP i laterale røtter, oppnådd på påfølgende tidspunkter over 72 timer. Skalestenger = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 : Imagingkamre kan tilpasses for andre planteorganer. ( A - C ) Imaging kammer tilpasning for primære røtter. ( A ) Skjematisk av bildekammerdesign. Dette er identisk med standarddesignet ( Figur 1 ) bortsett fra to modifikasjoner: MS-mediumplaten inneholder 0,8% agar i stedet for 1,5% agar, og en cellulosefilm (rød) plasseres mellom agar og plante for å hindre vekstInn i agaret. ( B ) XY (topp) og XZ (bunn) maksimalintensitetsprojeksjoner av representative 3D-konfokale stabler av plasmamembranmarkøren NPSN12-YFP i den primære roten til en 7-dagers frøplante avbildet på 0 timer og 48 timer i en konvensjonell bildebehandling kammer. Legg merke til at roten vokser inn i agar på grunn av sin gravitrope respons. ( C ) XY (topp) og XZ (bunn) maksimalintensitetsprojeksjoner av representative 3D-konfokale stabler av plasmamembranenes markør NPSN12-YFP i den primære roten av en sju dager gammel planteliv avbildet på 0 timer og 48 timer i avbildningen Kammer med cellulosefilm. Før applikasjonen ble cellulosefilmen sterilisert i 80% etanol og gjennomvåt i flytende ½ MS medium. Legg merke til at gravitrop vekst av roten i agar er forhindret. ( D - F ) Imaging kammer tilpasning for hypokotyler. ( D ) Skjematisk viser hypokotyl bildekammer design. En poly (dimetylsiloksan) gummitetning (grå) er produsertRød på et hulrom mellom to glassstrimler (gul). En plat på 1,5% agar med jevn tykkelse (beige) er plassert på glidebanen, som delvis kommer inn i hulrommet. Kammeret er fylt med PFD (blå). Frøplanter legges på agarplaten slik at hypokotylen opptar det nedoverliggende skråområdet av agarplaten i hulrommet mens roten er plassert den horisontale delen av agar. Kammeret er lukket med et deksel. ( E ) Maksimalintensitetsprojeksjoner av representative 3D-konfokale stabler av plasmamembranmarkøren NPSN12-YFP i en hypokotyl av en to-dagers gammel frøplante avbildet over 48 timer ved sammenhengende tidspunkter. ( F ) Lengdevekst i to sammenhengende tidsintervaller av individuelle celler langs den basale til apikale akse (relative posisjoner ved 0 h langs aksen vist i E) av hypokotylen vist i ( E ). Legg merke til den tidligere beskrevne bølgen av vekst som migrerer opp hypokotylen 16 . Skalestenger = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Film 1: Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 2: Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.
Film 3: Vennligst cSlikk å laste ned denne filmen.
Discussion
Metoden som presenteres her er en enkel strategi for høyoppløselig konfokal avbildning av utvikling av laterale røtter i to og opptil tre dager. I perioder på opptil 48 timer ble det ikke observert noen bivirkninger av bildesystemet på sideveisutvikling. Etter 48 timer begynte den gjennomsnittlige laterale rotveksten å sakte, selv om en betydelig delmengde av røttene (37%) fortsatte å vokse med priser som var sammenlignbare med gjennomsnittlig rotvekst på platene. Derfor, gjennom bildebehandling et tilstrekkelig stort antall røtter, kan røtter hvis vekst bremser etter 48 timer, utelukkes. Systematiske tester av bildekamrene ble ikke utført i perioder som var lengre enn 72 timer, men alternative strategier anbefales hvis utvidede avbildningsperioder er ønsket. Imagingkamre kan være igjen på mikroskopetrinnet kontinuerlig, dersom egnede miljøforhold blir tilveiebrakt, eller fjernet til et vekstanlegg og periodisk returnert til mikroskopet. Dette gjør at mange kamre kan avbildes parallelt. </ P>
En fordel med kamrene som beskrives her er at laterale røtter er festet i deres posisjon og kan avbildes ved bruk av vannoppløsningslinser med høy oppløsning. Den romlige stabiliteten avhenger kritisk av agarkonsentrasjonen som anvendes i den støttende agarplaten. I utgangspunktet ble en rekke forskjellige konsentrasjoner fra 0,8% agar til 2% agar testet, noe som viste at høye konsentrasjoner i dette området stabilt fikserte røtter i rommet, men rotveksten senket raskere og noen røtter viste tegn på mekanisk stress, inkludert redusert celleforlenging. I motsetning til dette ga lave agarkonsentrasjoner ikke den nødvendige støtten og røttene drev i x, y og z under bildene. Den optimale 1,5% agarplaten retter posisjonen til prøven uten negative mekaniske effekter. Under disse forholdene, etter oppgjør i de første 30 minuttene, er røttene stabile over mange timer, noe som tillater dataoppkjøp over natten. Under oppkjøpet av 4D-data var z-stakkord vanligvis bRacketed med ytterligere 5-10 μm, men dette var hovedsakelig å imøtekomme ut-av-plan vekst av laterale røtter i stedet for z-drift eller wobble. Selv om standard agar-konsentrasjonen gir noe motstand mot penetrasjon, vil gravitropisk voksende røtter etter hvert trenge inn i agaret. Imidlertid, gjennom en mindre modifikasjon av bildekammeret, kunne rotveksten opprettholdes parallelt med dekselglasset, slik at eldre laterale røtter og primære røtter blir avbildet. Videre kan det grunnleggende bildekammeret lett tilpasses for hypokotyler. Hypokotyler er mer fritt flytende i dette systemet, slik at z-aksen braketten for bildeoppkjøp ble økt vanligvis til ca 20 μm. I denne studien ble et opprettholdt mikroskop brukt over hele, noe som tillot substrategenskapene å bli kontrollert. Imagingkammeret kan være tilpassbart til inverterte mikroskopkonfigurasjoner, men den tidsavhengige innflytelsen av den stive deksel på oppfangingsorganer må vurderes. Littlejohn og kolleger har påpekt at PFD selv ikke lett oppløser biologiske molekyler, noe som betyr at den ikke kan brukes direkte til levering av farmakologiske forbindelser 7 . Dette problemet ble overvunnet ved å tilveiebringe slike forbindelser gjennom platen av størknet vekstmedium som agarplaten hviler på. Mens perfusjonssystemer vil forbli den valgte metode for utvaskingsforsøk, har imagingkammeret blitt anvendt med suksess for administrering av dexametason 12 og andre forbindelser. Ett notat, mens denne artikkelen var under forberedelse, beskriver Wagenheim og kollegaer 18 et kammer for avbildning av lateral rotutvikling ved bruk av lysmikroskopi.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Prof. Geoffrey Wasteneys, University of British Columbia, for frø-uttrykker RFP-TUB6 og en anonym anmelder for nyttige korreksjoner. Vi er takknemlige for Prof. Hugh Dickinson for å varsle oss om bruken av cellulosefilm som en mekanisk støtte og til John Baker for fotografering. Dette arbeidet ble støttet av BBSRC forskningsstipendier BB / G013993 / 1 og BB / D004055 / 1 til IM, og en BBSRC doktorgradspris og Clarendon Scholarship til CK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
| Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
| Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
| Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80 mm disc |
References
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Meth. 11, 22 (2015).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression. Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).
- Baranenko, V., et al. Solubility of oxygen and carbon dioxide in water. Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. Plos One. 6, (2011).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).
- Littlejohn, G. R., Love, J. A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium. J Vis Exp. , (2012).
- Littlejohn, G. R., et al. An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology. Front Plant Sci. 5, 140 (2014).
- Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons. Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes. J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).
- Kirchhelle, C., et al. The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis. Dev Cell. 36, 386-400 (2016).
- Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
- Geldner, N., et al. Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set. Plant J. 59, 169-178 (2009).
- Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis. Nat Commun. 2, 430 (2011).
- Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).
- Gendreau, E., et al. Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).
- von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel. J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).
