Summary
Præsenteret her er en simpel teknik til konfocal time-lapse billedbehandling af rot og hypokotyl i høj opløsning i op til 3 dage ved brug af høje numeriske blændemål og perfluorodecalin som et nedsænkningsmedium.
Abstract
Flere aspekter af planteudvikling, såsom lateral rotmorfogenese, forekommer på tidsintervaller på flere dage. For at undersøge underliggende cellulære og subcellulære processer kræves højopløsnings-tidsforskydningsmikroskopi strategier, der bevarer fysiologiske tilstande. Plantevæv skal have tilstrækkelig næringsstof og vandforsyning med vedvarende gasudveksling, men når de nedsænkes og immobiliseres under et dækslip, er de særligt modtagelige for anoxi. En strategi, der har været anvendt med succes, er brugen af et perfusionssystem for at opretholde en konstant tilførsel af ilt og næringsstoffer. Sådanne arrangementer kan imidlertid være komplicerede, besværlige og kræve specialudstyr. Præsenteret her er en alternativ strategi for et simpelt billeddannelsessystem ved anvendelse af perfluorodecalin som et nedsænkningsmedium. Dette system er let at installere, kræver minimal udstyr og er let monteret på et mikroskopstrin, hvilket gør det muligt at oprette og afbilde flere billedkamre i parallel. I dette system er laterale rotvæksthastigheder skelnes fra vækstrater under standardbetingelser på agarplader i de første to dage, og lateral rotvækst fortsætter med reducerede hastigheder i mindst en anden dag. Plantevæv leveres med næringsstoffer via en agarplade, som også kan anvendes til administration af en række farmakologiske forbindelser. Systemet blev oprettet for at overvåge lateral rodudvikling, men er let at tilpasse til andre planteorganer som f.eks. Hypokotyler og primære rødder.
Introduction
For at studere cellulære og subcellulære processer, der ligger til grund for planteudvikling, er der en stigende efterspørgsel efter langvarige time-lapse-billeddannelsesstrategier. En vigtig udfordring i sådanne billeddannelsesforsøg er vedligeholdelsen af fysiologiske forhold, herunder tilstrækkelig gasudveksling samt en forsyning af vand og næringsstoffer 1 , 2 , 3 . For at udnytte mål med høje numeriske åbninger for optimal optisk opløsning, skal prøver placeres i nærheden og orienteret parallelt med dækslet. Bevægelse i x, y og z retninger bør ideelt set være minimal under billeddannelsen.
Mens kimplanter ofte er monteret i vand eller vandig opløsning til kortvarig billeddannelse, har vand en lav kapacitet til opløsning af CO 2 og O 2 (1,54 mg / ml og 0,04 mg / ml henholdsvis ved 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , Hvilket gørDen er uegnet til forlængede tidsforskydningsforsøg. Perfusionssystemer, der opretholder konstante niveauer af ilt og næringsstoffer, er en løsning på dette problem og er blevet udviklet til både confocal laser scanning microscopy (CLSM) 1 , 2 , 3 og lysmikroskopi (LSM) 5 . Systemer som RootChip 2 og RootArray 3 er designet specielt til tidsforskydning af billeddannelse af udviklende rødder og involverer spiring af frø i en specialbygget flerprøveanordning. Disse arrangementer sikrer minimal mekanisk forstyrrelse og er designet til parallelanalyse af flere kimplanter, men er ikke optimeret til billeddannelse af subcellulære strukturer. Calder og kolleger har designet et mere kompliceret perfusionsbaseret billedkammer optimeret til billeddannelse af subcellulære strukturer, hvor prøven holdes i position ved hjælp af en maskeAt tillade brug af høj forstørrelsesdyser linser 1 .
Præsenteret her er en alternativ, enkel løsning på dette problem, som ikke er baseret på perfusionssystemer, men anvender perfluorodecalin (PFD), et perfluorcarbon, der for nylig er blevet populært som et monteringsmedium til arabidopsis-billeddannelse 6 , 7 , 8 . I sådanne applikationer tillader den høje kapacitet af PFD til opløsning af CO 2 og O 2 (1,9 g / ml for O 2 i PFD sammenlignet med 0,04 mg / ml i vand) 9 , gasudveksling ved det nedsænkede væv. Endvidere er PFD ikke-fluorescerende, og dets brydningsindeks (1.313) kan sammenlignes med vandet (1.333) og er tættere på cytosol (~ 1,4) end luft (1.000) 6 . Perfluorcarboner er blevet rapporteret at have minimal fysiologisk effekt på en række planter og planterProblemer 6 , med radisefrø, der let frigør, når de nedsænkes i PFD og udviser normal vækst og udvikling i mindst to fulde dage, når de leveres med vand 10 . Lignende observationer er blevet gjort for at spire arabidopsisfrø 6 . Baseret på stimuleret Raman-spredning for at direkte billedet distributionen af PFD i Arabidopsis bladvæv efter infiltration konkluderer Littlejohn og kolleger, at PFD sandsynligvis ikke optages af levende celler 8 . PFD er tidligere blevet anvendt overvejende til billedvæv, hvor det signifikant øger billeddybden, da det let infiltrerer luftrum på grund af dets lave overfladespænding 6 . Her vedtages PFD til langsigtet konfokal billeddannelse af udvikling af laterale rødder. I denne konfiguration anbringes en eller flere plantager på en plade af vækstmedium størknet med agar og nedsænket i PFD. PFD'en tillader gAseous udveksling i billedkammeret, forebyggelse af anoxi. PFD er meget flygtig, så det fastholdes af en pakning af poly (dimethylsiloxan) gummi, som også har høj gaspermeabilitet (1,5 x 10-12 pmol m -1 s -1 Pa -1 for CO 2 ) 11 . Næringsstoffer og vand leveres af pladen af medium størknet med agar. Samtidig trykker denne agarplade forsigtigt mod roten mod dækslet, og fastgør dermed sin relative position i billedkammeret og tillader brugen af vandopløsninger med høj opløsning. Agarpladen kan endvidere anvendes til at administrere en række farmakologiske behandlinger, herunder dexamethason, oryzalin og isoxaben. Billedkamrene kan monteres i stort antal fra standardmikroskopi dias ved hjælp af minimalt udstyr. Billedkamrene blev udviklet og karakteriseret til at studere lateral rodudvikling, men er tilpasselige til billeddannelse af andre kimplanter, såsom primære rodtip ogkimstænglerne.
Protocol
1. Oprettelse af afdelingen
- Brug en glasskærer til at skære 3 mm brede strimler fra enden af et 1 mm tykt mikroskopglas. Ved hjælp af et superfibre eller dobbeltsidet tape af cyanacrylat limes disse glasstrimler ca. 45 mm fra hinanden over bredden af et andet mikroskopglas ( Figur 1A ). Der kræves et dias pr. Kammer plus yderligere lysbilleder til hældning af agarplader (ét dias giver 2-3 agarplader). Slides kan genbruges.
- Mellem glasstrimlerne mødes en pakning af samme højde ud af gasgennemtrængende poly (dimethylsiloxan) gummi. Placer en kugle af poly (dimethylsiloxan) gummi på glideren ( figur 1B ), våd et andet glidemiddel med en lille mængde 100% absolut ethanol og flad poly (dimethylsiloxan) gummibollen med det andet glidemiddel, indtil det er nået Af glasstrimlerne ( figur 1C ).
- Om nødvendigt trimmer overskydende poly (dimeThylsiloxan) gummi med et knivblad og gentag fladning.
- Ved hjælp af et passende kniv eller knivblad vådt i absolut ethanol, fjern den indvendige del af poly (dimethylsiloxan) gummi til dannelse af hulrummet, der senere vil holde kimplanten og agarpladen ( figur 1D ).
- Tøm forsigtigt gelen med et knivblad til at skabe en pakning med en endelig vægtykkelse på ca. 2 mm ( figur 1E ). Gassens permeabilitet gennem en poly (dimethylsilaxan) barriere er uafhængig af tykkelser over 50 μm 11 .
2. Oprettelse af agar-størknet vækstplanteform
- På et mikroskopi dias med to glasstrimler anbringes en dæksel (22 mm x 50 mm), så den hviler på begge glasstrimler.
- Pipetsmeltet halvstyrke Murashige og Skoog vækstmedium indeholdende 1% vægt / vol saccharose og 1,5% vægt / volumen agar (½ MS) i det resulterende rumUnder dækslet, indtil sidstnævnte er fuldstændigt fyldt (ca. 1 ml totalt volumen) og lad det gå, indtil agar er indstillet (ca. 5 min).
Bemærk: Farmakologiske forbindelser kan administreres gennem agarpladen ved at tilsætte passende koncentrationer til væskemediet, før pladen hældes. Dette blev testet med succes for dexamethason 12 , isoxaben, 2,6-dichlorbenzonitril (DCB), oryzalin og latrunculin B.
3 . Afslutning af kammeropsætningen
- Luftekvilibrere PFD ved at ryste et lille volumen PFD i et rør 7 . Tilsæt en lille mængde (ca. 200 μL) luftækvilibreret PFD til gelens pakning, men lad ikke kammeret fylde helt. Denne PFD vil bidrage til at undgå fangst af luftbobler under agarpladen, da den placeres i kammeret.
- Fjern dækslet fra agarpladen (i trin 2.2 ovenfor) og brug et knivblad til at afskære en del af deForm og størrelse. Derefter placeres den i gelens pakning ( figur 1F ). Der skal være et hul på 2-4 mm til pakningen rundt omkring.
- Fyld kammeret fuldstændigt med luftækvilibreret PFD.
- Placer en eller flere A. thaliana kimplanter (op til 3 kimplanter til billeddannelse over 2-3 dage) på agarpladen med cotyledonerne og hypocotylen hængende over kanten, flydende i PFD ( Figur 1G ).
- For at opnå frøplanter steriliseres frø med 70% ethanol, plantes på ½ MS medium suppleret med 1% saccharose og 0,8% agar, stratificeres i 2-4 dage ved 4 ° C og vokser på vertikalt orienterede plader ved 22 ° C i en 16 H lys / 8 timer mørkt regime. Til billeddannelse laterale rødder vokse planter i 7-10 dage før overførsel til billedkammer.
- For at lukke kammeret skal der påføres et dæksel, der passer til objektets optik, forsigtigt presses det ned med kanten af et glasmikroskop dias, indtil dæksletHviler på begge glasstrimler ( figur 1H ).
- Fastgør dækslip med strimler med 1,25 cm bredt mikroporisk kirurgisk tape, der skæres i halv længdevis på hver ende, hvis det ønskes ( Figur 1I ). Lad prøven afregne i ca. 30 minutter før billeddannelse. Dette minimerer prøvebevægelsen under billeddannelsen.
- Udfør billeddannelse med et opretstående mikroskop for at opretholde et kontrolleret substrat til vækst. Brug 20X / 0.7NA eller 63X / 1.2NA CS2 mål.
Representative Results
Laterale rødder vokser ved fysiologiske satser i billedkamre.
Laterale rodlængder af planter i billedkamre blev målt med mellemrum hver time ( Figur 2A , venstre, film 1, n = 23) og vækstrater blev sammenlignet med de af laterale rødder dyrket på standard petriplader indeholdende det samme agar-størkne medium ( figur 2A , højre, film 2, n = 23). Væksthastighederne kan variere betydeligt mellem laterale rødder, hvor rodets længde er en afgørende faktor som følge af de stadig længere vækst- og proliferationsområder 13 . Derfor blev sæt af laterale rødder udvalgt til at repræsentere rødder med forskellige indledende længder (fra 50 μm til 1150 μm) i både billedkammeret og agarpladen. Gennemsnitlig lateral rodlængde ved forsøgets startVar ens i hvert sæt (henholdsvis 439 og 442 μm for billedkammer og -plader). I det analyserede tidsinterval på 27 timer var den laterale rodvækst omtrentlig lineær både i billedkammer og på plader med en gennemsnitlig vækstrate på 52 μm / h (R2 = 0,997) på plader og 51 μm / h i billedkamre ( R2 = 0,993) ( figur 2B ). Væksthastigheder for individuelle laterale rødder, hvor de er meget variable både på plader og i billedkamre ( figur 2C ), fra 17 μm / h til 82 μm / h i billedkamre og fra 13 μm / h til 87 μm / h på plader. Mens vækstraterne generelt stiger med længden af roden, varierede vækstraterne stadig betydeligt mellem rødder af tilsvarende længde, men variansen var ens i billedkamre og på plader.
Laterale rødder spredes i billedkamre og kan afbildes ved hjælp af hejGh numerisk-aperture mål.
Laterale rødder, der udtrykker plasmamembranmarkør NPSN12-YFP 14 og mikrotubulatormarkøren UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15 blev afbildet af CLSM 10 med intervaller på 1 time for at dokumentere mikrotubulær adfærd under celleproliferation i billedkamre ( Figur 2D , film 3). I disse kamre var laterale rødder yderst stabile i deres position på x-, y- og z-akserne, hvilket tillod opkøb af kontinuerte tidsforløbs-confokale stabler over flere timer. Meristematiske celler prolifereres kontinuerligt, hvilket fremgår af dannelsen af preprophase-bånd ( figur 2D , grønne pile), mitotiske spindler ( figur 2D , hvide pile) og phragmoplasts ( figur 2D , blåpile). Som med frøplanter på Petri plader,Fuldt aflange rodceller i billedkammer initierede rodhår ( figur 2A , figur 2D , pilhoveder), hvilket yderligere viser, at udviklingen foregik som forventet i billedkamrene. For at tilvejebringe et bredt synsfelt blev billederne i figur 2D opnået med et 20x / 0,7 NA mål. Det var også muligt at opnå billeder med høj opløsning af laterale rødder ved hjælp af et højt numerisk aperture 63x / 1,2 NA vanddypningsmål ( figur 2E ).
Lateralrotvækst opretholdes i billedkamre i op til tre dage.
For at undersøge, hvor lang tid billeddannelseskamre kunne understøtte lateral rotvækst ved fysiologiske satser, blev den laterale rodlængde i billedkamre (n = 27) og på plader (n = 33) kvantificeret ved 0 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer. Rødderne choSen var kortere end 200 μm ved 0 timer med en gennemsnitlig lateral rodlængde på 117 μm i billedkamre og 121 μm på plader. Da kortere rødder vokser langsommere i gennemsnit ( figur 2C ), voksede de over agarplankens kant oftere og var lettere at billede. Den gennemsnitlige vækst af alle laterale rødder var ikke signifikant forskellig i billedkamre sammenlignet med Petri-plader i de første 48 timer ( figur 3A ). Den gennemsnitlige vækst blev imidlertid signifikant reduceret mellem 48 timer og 72 timer ( figur 3A ). Selv om vækstraterne ser ud til at falde generelt i billedkammer efter 48 timer forbliver vækstraterne mellem individer meget variable ( figur 3B , 3C ), hvilket betyder, at der er en betydelig delmængde af laterale rødder, som vokser ved sammenlignelige hastigheder på plader og i kamre Over hele 72 h vækstperioden. 23 af de 33 laterale rødder dyrketPå plader (69,7%) når en længde inden for en standardafvigelse af middellængden ved 72 timer (mellem 927 og 3.163 μm, figur 3B , rød). 10 af 27 (37,0%) laterale rødder i billedkamre når en længde inden for dette interval ( figur 3B , rød).
Billedkamre kan let tilpasses til ældre laterale rødder, primære rødder og hypokotyler .
En af begrænsningerne ved det oprindelige billedkammerdesign var, at selvom den stive agarpladen gav en vis mekanisk modstand, trængte gravitropisk voksende rødder til sidst igennem agarpladen, hvilket resulterede i tab af billedkvalitet ( figur 4B ) og væksten ud over arbejdsafstanden af høj NA Linser, selv den relativt lange arbejdsafstand (0,3 mm) 63X / 1,3 NA CS2-mål. Unge laterale rødder mangler statolith-holdigeColumella celler krævet til gravitropism 17, så de oprindeligt voksede parallelt med dækslip i billedkamre ( figur 2E ). Da de vokser længere og columella og statolitter former, viser laterale rødder stigende positiv gravitropisme, mens primære rødder udviser et stærkt gravitropisk respons fra spiring fremad. Dette begrænser til et par timer den periode, over hvilken primære rødder kan afbildes, og det begrænser alvorligt startlængden af laterale rødder, der kan afbildes kontinuerligt i 48 timer eller mere. For at overvinde denne begrænsning blev kammeret modificeret således, at væksten blev holdt parallelt med dækslipningen af en cellulosecellofanmembran, der virker som en penetrationsbarriere på overfladen af agarpladen ( figur 4A ). Indledende forsøg med anvendelse af en 1,5% agarplade forårsagede reduceret rodvækst inden for de første 24 timer, måske på grund af mekanisk stress. Nedre agarkoncentrationer i pladen blev testet enD blev det konstateret, at i unge kamre med en plade indeholdende 0,8% agar og cellulosefilm, adskilte de unge sideløbsvækvækst ikke signifikant fra vækstraterne i konventionelle kamre i de første 48 timer. I 0-24 timer var den gennemsnitlige rodvækst i cellulosekamre og konventionelle kamre henholdsvis 242 μm og 262 μm (p = 0,78 Student's t-Test) og i 24-48 timer var henholdsvis 330 μm og 355 μm 1 (p = 0,67 Studentens t-Test); N = 12 og n = 11. Dette arrangement forhindrede effektivt, at laterale rødder voksede væk fra dækslet til agaret og tillod også billeddannelse af primære rødder i op til 48 timer ( figur 4C ).
For at teste om billedkammeret kunne tilpasses til andre organer end rødder, blev Arabidopsis hypokotyler valgt. Hypokotyler er væsentligt tykkere end rødder, således i det konventionelle billedkammer, den øverste cElls blev presset mod afdækningen, hvilket fører til deformation. Et alternativt design blev derfor udviklet ved hjælp af hulrumsskinner, der indeholder en oval depression i deres center ( figur 4D ). I denne konfiguration blev en 1 mm tykk agarplade (fremstillet som i 2.2 ovenfor) anbragt med den ene ende udragende med nogle få mm ind i hulrummet ( figur 4D ). Hypokotyler blev anbragt over hulrummet i diaset, mens roden blev anbragt over den vandrette del. Dette sikrede, at frøplanterne blev fastgjort i rummet ved roden, men hypokotylen blev ikke presset. Mens vækstrater i kamre sammenlignet med plader ikke blev systematisk kvantificeret, udviser hypokotyler i billedkamre den velbeskrevne bølge af langsgående vækst, der migrerer hypokotylen ( figur 4E , 4F ) 16 .
Figur 1 : Montering af et billedkammer. Alle detaljer er beskrevet i teksten. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Laterale rødder vokser under fysiologiske forhold i billedkammer. ( A ) Arabidopsis lateral rodudvikling i et billedkammer (til venstre) og på en plade (højre) i løbet af 25 h (konstant lys, horisontal inkubation, simultan billeddannelse). Skalestænger = 200 μm. ( B ) Plot, der viser laterale rodlængder over 27 timer (målt i intervaller på 1 time), med laterale rødder som vist i ( A ). IndividUal rødder tegnet i grå (n = 23 for plader og billedkammer), gennemsnitlig længde som røde cirkler. Fejlstænger = 1 SD. Den røde linje er lineær pasform gennem gennemsnitslængder. ( C ) Plot, der viser den gennemsnitlige vækstrate for alle laterale rødder vist i ( B ) i forhold til deres indledende længde. ( D ) Maksimale intensitetsfremskrivninger af 3D-konfokale stakke erhvervet fra laterale rødder, der udtrykker NPSN12-YFP og RFP-TUB6 på sammenhængende tidspunkter. Inset: Forstørrelse af boxed region. Grønne pile: preprophase bands; Hvide pile: mitotiske spindler; Blå pile: phragmoplasts; Arrowheads: rodhår. ( E ) Maksimalintensitetsfremskrivninger af billeder med høj opløsning erhvervet fra en ung lateral rod af den transgene linie vist i ( D ) ved anvendelse af et 63X / 1,2 NA-mål og Nyquist-prøveudtagning (pixeldimensioner 77 nm x 77 nm) ved 0 timer og 16 h; Asterisker lokaliserer identiske celler på hvert tidspunkt Pil indikerer en celle, der adskiller mellem 0 og 16 timer.Skalestænger = 50 μm (AC); 20 μm (E). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 : Langsigtet lateral rodudvikling i billedkamre. ( A ) Plot, der viser gennemsnitlig absolut rotvækst i tre på hinanden følgende 24 h intervaller i billedkamre sammenlignet med plader. Ns indikerer p> 0,05; *** angiver p <0,001 (student t-test). N = 33 (plader) og n = 27 (billedkammer). ( B ) Plot med laterale rodlængder i sammenhængende tidspunkter på alle rødder, der anvendes i (A). Rød: Alle laterale rødder med en endelig længde inden for 1 SD af middelværdien af alle laterale rødder dyrket på plader (mellem 927 og 3163 μm). ( C ) Maksimum iTærskelprojiceringer af repræsentative 3D-konfokale stabler af plasmamembranmarkør NPSN12-YFP i laterale rødder erhvervet på sammenhængende tidspunkter over 72 timer. Skalestænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : Imagingkamre kan tilpasses til andre planteorganer. ( A - C ) Billedkammertilpasning til primære rødder. ( A ) Skematisk af billedkammerdesign. Dette er identisk med standarddesignet ( Figur 1 ) bortset fra to modifikationer: MS-mediumpladen indeholder 0,8% agar i stedet for 1,5% agar, og en cellulosefilm (rød) placeres mellem agar og plante for at forhindre vækstInd i agar. ( B ) XY (øverste) og XZ (nederste) maksimale intensitetsfremskrivninger af repræsentative 3D-konfokale stabler af plasmamembranmarkør NPSN12-YFP i den primære rod af en 7 dages gammel frøplante afbildet på 0 timer og 48 timer i en konventionel billeddannelse kammer. Bemærk at roden vokser ind i agar på grund af dens gravitropiske respons. ( C ) XY (øverste) og XZ (nederste) maksimalintensitetsfremskrivninger af repræsentative 3D-konfokale stabler af plasmamembranmarkør NPSN12-YFP i den primære rod af en syv dage gammel frøplante afbildet på 0 timer og 48 timer i billeddannelsen Kammer med cellulosefilm. Før påføring blev cellulosefilmen steriliseret i 80% ethanol og gennemvædet i flydende ½ MS-medium. Bemærk at gravitropisk vækst af roden i agar er forhindret. ( D - F ) Billedkammertilpasning til hypokotyler. ( D ) Skematisk viser hypokotyl billedkammer design. En poly (dimethylsiloxan) gummipackning (grå) er fremstilletRødt på et hulrum mellem to glasstrimler (gul). En plade på 1,5% agar af jævn tykkelse (beige) anbringes på glideren, der delvis når ind i hulrummet. Kammeret er fyldt med PFD (blå). Frøplanter anbringes på agarpladen, således at hypokotylen indtager den nedadgående skråning af agarpladen i hulrummet, mens roden er anbragt den horisontale del af agaret. Kammeret er lukket med et dækslip. ( E ) Maksimalintensitetsfremskrivninger af repræsentative 3D-konfokale stabler af plasmamembranmarkør NPSN12-YFP i en hypokotyl af en to-dages gammel frøplante, der afbildes i løbet af 48 timer i sammenhængende tidspunkter. ( F ) Langtidsvækst i to på hinanden følgende tidsintervaller af individuelle celler langs den basale til apikale akse (relative positioner ved 0 h langs den akse vist i E) af hypokotylet vist i ( E ). Bemærk den tidligere beskrevne vækstvølge, der migrerer hypokotylen 16 . Skalestænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Film 1: Klik her for at downloade denne film.
Film 2: Klik her for at downloade denne film.
Film 3: Venligst cSlikklik for at downloade denne film.
Discussion
Metoden, der præsenteres her, er en simpel strategi for højopløselig konfokal billeddannelse af udvikling af laterale rødder i to og op til tre dage. I perioder på op til 48 timer blev der ikke observeret nogen negative virkninger af billeddannelsessystemet på lateral rodudvikling. Efter 48 timer begyndte den gennemsnitlige laterale rodvækst at bremse, selv om en betydelig delmængde af rødderne (37%) fortsatte med at vokse med satser, som kunne sammenlignes med den gennemsnitlige rotvækst på plader. Derfor kan der ved billeddannelse et tilstrækkeligt stort antal rødder udelukkes rødder, hvis vækst falder efter 48 timer. Systematiske afprøvninger af billedkamrene blev ikke udført i perioder længere end 72 timer, men alternative strategier anbefales, hvis udvidede billeddannelsesperioder ønskes. Imagingkamre kan efterlades kontinuerligt på mikroskopfasen, hvis passende miljømæssige forhold er tilvejebragt eller fjernet til en vækstfacilitet og periodisk returneret til mikroskopet. Dette gør det muligt for mange kamre at blive afbildet parallelt. </ P>
En fordel ved de her beskrevne kamre er, at laterale rødder er fikseret i deres position og kan afbildes ved brug af vandopløsninger med høj opløsning. Den rumlige stabilitet afhænger kritisk af den agarkoncentration, der anvendes i den bærende agarplade. I første omgang blev en række forskellige koncentrationer fra 0,8% agar til 2% agar testet, hvilket viste, at høje koncentrationer i dette område stabilt fikserede rødder i rummet, men rodvæksten blev hurtigere og nogle rødder udviste tegn på mekanisk stress, herunder nedsat celleforlængelse. I modsætning hertil tilvejebragte lave agarkoncentrationer ikke den nødvendige understøttelse, og rødderne drev i x, y og z under billeddannelsen. Den optimale 1,5% agarplade løser prøvenes position uden negative mekaniske virkninger. Under disse forhold er roderne stabile i løbet af mange timer efter afregning i løbet af de første 30 minutter, hvilket muliggør overtagelse af data natten over. Under erhvervelse af 4D-data var z-stack-rækker typisk bRacketed med en yderligere 5-10 μm, men dette var hovedsagelig at rumme ud-af-plan vækst af laterale rødder i stedet for z-drift eller wobble. Selvom standardagarkoncentrationen giver en vis modstand mod penetration, vil gravitropisk voksende rødder til sidst trænge igennem agaret. Men gennem en mindre ændring af billedkammeret kunne rodvækst opretholdes parallelt med dækslet, hvilket gør det muligt at billedere ældre laterale rødder og primære rødder. Endvidere kunne det grundlæggende billedkammer nemt tilpasses til hypokotyler. Hypokotyler er mere fritflydende i dette system, så z-aksenbeslaget til billedoptagelse blev normalt forøget til ca. 20 μm. I denne undersøgelse blev der anvendt et opretstående mikroskop i hele, hvilket tillod at substrategenskaberne blev styret. Billedkammeret kan være tilpasseligt til inverterede mikroskopkonfigurationer, men den tidsafhængige indflydelse af den stive dæklip på aflytningsorganer skal evalueres. Littlejohn og kolleger har påpeget, at PFD selv ikke let opløses biologiske molekyler, hvilket betyder, at det ikke kan anvendes direkte til levering af farmakologiske forbindelser 7 . Dette problem blev overvundet ved at forsyne sådanne forbindelser gennem pladen af størknet vækstmedium, hvorpå agarpladen hviler. Mens perfusionssystemer vil forblive den valgte metode til udvaskningsforsøg, er billedkammeret blevet anvendt med succes til administrationen af dexamethason 12 og andre forbindelser. En note, mens denne artikel var under forberedelse, beskrev Wagenheim og kolleger 18 et kammer til billeddannelse af lateral rodudvikling ved hjælp af lysarkmikroskopi.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Prof. Geoffrey Wasteneys, University of British Columbia, for frøudtryk RFP-TUB6 og en anonym anmelder for nyttige korrektioner. Vi er taknemmelige for Prof. Hugh Dickinson for at advare os om brugen af cellulosefilm som en mekanisk støtte og til John Baker til fotografering. Dette arbejde blev understøttet af BBSRC forskningsstipendier BB / G013993 / 1 og BB / D004055 / 1 til IM, og en BBSRC Doktorsuddannelse og Clarendon Scholarship til CK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
| Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
| Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
| Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80 mm disc |
References
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Meth. 11, 22 (2015).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression. Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).
- Baranenko, V., et al. Solubility of oxygen and carbon dioxide in water. Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. Plos One. 6, (2011).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).
- Littlejohn, G. R., Love, J. A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium. J Vis Exp. , (2012).
- Littlejohn, G. R., et al. An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology. Front Plant Sci. 5, 140 (2014).
- Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons. Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes. J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).
- Kirchhelle, C., et al. The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis. Dev Cell. 36, 386-400 (2016).
- Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
- Geldner, N., et al. Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set. Plant J. 59, 169-178 (2009).
- Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis. Nat Commun. 2, 430 (2011).
- Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).
- Gendreau, E., et al. Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).
- von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel. J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).
