Summary
المقدمة هنا هو تقنية بسيطة عالية الدقة متحد البؤر الفاصل الزمني التصوير من الجذر وتطوير هيبوكوتيل لمدة تصل إلى 3 أيام باستخدام عالية الأهداف العددي الفتحة و بيرفلوروديكالين كوسيلة الغمر.
Abstract
العديد من جوانب التنمية النباتية، مثل التشكل الجانبي الجذر، تحدث على فترات زمنية من عدة أيام. لدراسة العمليات الخلوية والخلايا الكامنة وراءها، مطلوب استراتيجيات عالية الدقة الفاصل الزمني الفاصل الزمني التي تحافظ على الظروف الفسيولوجية. يجب أن يكون للأنسجة النباتية ما يكفي من المغذيات وإمدادات المياه مع تبادل الغاز المستمر، ولكن عندما غمرت وتجمد تحت ساترة، فهي عرضة بشكل خاص لنقص الأكسجين. إحدى الاستراتيجيات التي تم توظيفها بنجاح هي استخدام نظام نضح للحفاظ على إمدادات ثابتة من الأوكسجين والمواد المغذية. غير أن هذه الترتيبات يمكن أن تكون معقدة ومرهقة وتتطلب معدات متخصصة. يعرض هنا هو استراتيجية بديلة لنظام التصوير بسيط باستخدام بيرفلوروديكالين كوسيلة الغمر. هذا النظام من السهل اقامة، يتطلب الحد الأدنى من المعدات، ويتم تركيبها بسهولة على مرحلة المجهر، والسماح لعدة غرف التصوير ليتم إعدادها وتصويرها في قدم المساواةعلال. في هذا النظام، لا يمكن تمييز معدلات نمو الجذر الجانبي عن معدلات النمو في ظل الظروف القياسية على لوحات أجار لليومين الأولين، ويستمر نمو الجذر الجانبي بمعدلات منخفضة ليوم آخر على الأقل. يتم توفير الأنسجة النباتية مع المواد الغذائية عن طريق لوح أجار التي يمكن استخدامها أيضا لإدارة مجموعة من المركبات الدوائية. تم إنشاء نظام لرصد التنمية الجذر الجانبي ولكن قابل للتكيف بسهولة إلى صورة الأعضاء النباتية الأخرى مثل هيبوكوتيلز والجذور الأولية.
Introduction
لدراسة العمليات الخلوية والخلايا التي تكمن وراء تطوير النباتات، وهناك طلب متزايد على استراتيجيات التصوير عالية الدقة على المدى الطويل عالية الدقة. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية في تجارب التصوير هذه في الحفاظ على الظروف الفسيولوجية بما في ذلك التبادل الغازي الكافي بالإضافة إلى إمدادات المياه والمغذيات 1 و 2 و 3 . لاستخدام الأهداف مع فتحات العددية العالية للقرار البصري الأمثل، وينبغي وضع العينات في مكان قريب وموجهة بالتوازي مع ساترة. الحركة في x، y، و z الاتجاهات يجب أن يكون الحد الأدنى خلال التصوير.
في حين أن الشتلات غالبا ما يتم تركيبها في الماء أو محلول مائي للتصوير على المدى القصير، والماء لديه قدرة منخفضة لإذابة كو 2 و O 2 (1.54 ملغ / مل و 0.04 ملغ / مل، على التوالي عند 20 درجة مئوية، 0.1 ميجا باسكال) 4 ، مما يجعلفإنه غير مناسب لتجارب تمديد الوقت الفاصل. نظم الإرواء التي تحافظ على مستويات ثابتة من الأوكسجين والمواد المغذية هي حل واحد لهذه المشكلة، وقد وضعت لكلا متحد البؤر المسح الضوئي بالليزر المجهري (كلسم) 1 ، 2 ، 3 والضوء ورقة المجهري (لسم) 5 . وقد صممت نظم مثل روتشيب 2 و روتاراي 3 خصيصا للتصوير الفاصل الزمني من الجذور النامية وتنطوي على بذور الإنبات في جهاز متعدد العينات بناء مخصص. هذه الترتيبات ضمان الحد الأدنى من الاضطرابات الميكانيكية ومصممة لتحليل مواز للشتلات متعددة، ولكن ليست الأمثل لتصوير الهياكل تحت الخلوية. وقد صممت كالدر وزملاؤه غرفة التصوير على أساس نضح أكثر تعقيدا الأمثل لتصوير الهياكل تحت الخلوية التي يقام العينة في موقف من قبل شبكةللسماح باستخدام العدسات التكبير الغمر عالية 1 .
عرض هنا هو بديل، حل بسيط لهذه المشكلة التي لا تقوم على نظم نضح، ولكن يستخدم بيرفلوروديكالين (بد)، وهو بيرفلوروكربون التي اكتسبت شعبية مؤخرا كوسيلة متزايدة ل أرابيدوبسيس التصوير 6 ، 7 ، 8 . في هذه التطبيقات، والقدرة العالية لل بد لذوبان كو 2 و O 2 (1.9 غ / مل ل O 2 في بد مقارنة 0.04 ملغ / مل في الماء) 9 ، ويسمح التبادل الغازي من قبل الأنسجة مغمورة. وعلاوة على ذلك، بد هو غير الفلورسنت ومؤشر الانكسار (1.313) هو مقارنة مع الماء (1.333) وأقرب إلى أن من السيتوسول (~ 1.4) من الهواء (1.000) 6 . وقد تم الإبلاغ عن المركبات البيرفلوروكربونية لديها الحد الأدنى من التأثير الفسيولوجي على مجموعة متنوعة من النباتات والنباتات رالقضايا 6 ، مع بذور الفجل تنبت بسهولة عندما تغمر في بد ويظهر النمو الطبيعي والتنمية لمدة يومين على الأقل كامل أيام عند تزويده بالماء 10 . وقد أجريت ملاحظات مماثلة لإنبات بذور الأرابيدوبسيس 6 . استنادا إلى تحفيز رامان نثر مباشرة صورة توزيع بد في الأنسجة ورقة أرابيدوبسيس بعد تسلل، ويخلص ليتلجون وزملاؤه أن بد من المرجح لا تؤخذ من قبل الخلايا الحية 8 . وقد استخدم بد في الغالب إلى الأنسجة الجوية صورة، حيث أنه يزيد بشكل كبير عمق التصوير لأنها تتسرب بسهولة الفضاء الجوي بسبب التوتر السطحي المنخفض 6 . هنا، يتم اعتماد بد للتصوير مبائر على المدى الطويل من تطوير الجذور الجانبية. في هذا التكوين، يتم وضع شتلة واحدة أو أكثر على لوح من وسط النمو تتعزز مع أجار ومغمورة في بد. و بد يسمح gتبادل عاصي في غرفة التصوير، ومنع نقص الأكسجين. بد هو متقلب للغاية لذلك يتم الاحتفاظ بها من قبل طوقا من الصمغ بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) التي لديها أيضا عالية نفاذية الغاز (1.5 × 10 -12 بمول م -1 ق -1 با -1 ل كو 2 ) 11 . المغذيات والمياه يتم توفيرها من قبل بلاطة متوسطة صلابة مع أجار. في نفس الوقت، هذا أجار بلاطة يضغط بلطف الجذر ضد ساترة، وبالتالي تحديد موقفها النسبي في غرفة التصوير والسماح باستخدام عالية الدقة العدسات الغمر المياه. وعلاوة على ذلك، لوح أجار يمكن استخدامها لإدارة مجموعة من العلاجات الدوائية، بما في ذلك ديكساميثازون، أوريزالين، وإيزوكسابين. يمكن تجميع غرف التصوير بأعداد كبيرة من الشرائح المجهرية القياسية باستخدام الحد الأدنى من المعدات. وقد وضعت غرف التصوير واتسمت لدراسة التنمية الجذر الجانبي ولكن قابلة للتكيف لتصوير أجهزة الشتلات الأخرى مثل نصائح الجذر الأولية وhypocotyls.
Protocol
1 - إنشاء الغرفة
- باستخدام قطع الزجاج، وقطع 3 مم شرائح واسعة من نهاية شريحة المجهر 1 ملم. باستخدام سيانوكريلات فائقة الغراء أو الشريط على الوجهين، والغراء هذه الشرائط الزجاج ما يقرب من 45 ملم وبصرف النظر عبر عرض شريحة المجهر الثاني ( الشكل 1A ). مطلوب شريحة واحدة في الغرفة، بالإضافة إلى الشرائح الإضافية لصب ألواح أجار (شريحة واحدة سوف تسفر 2-3 ألواح أجار). يمكن إعادة استخدام الشرائح.
- بين شرائط الزجاج، والأزياء طوقا من ارتفاع متطابقة من بولي إيثيلزيلوكسان بولي (غاما). وضع الكرة من بولي (ديميثيلزيلوكسان) الصمغ على الشريحة ( الشكل 1B )، الرطب شريحة ثانية مع كمية صغيرة من 100٪ من الايثانول المطلق، وتسطيح بولي (ديميثيلزيلوكسان) الكرة اللثة مع الشريحة الثانية حتى وصلت إلى الارتفاع من شرائط الزجاج ( الشكل 1C ).
- إذا لزم الأمر، وتقليم الزائدة بولي (الدايمثيلزيلوكسان) الصمغ مع شفرة حلاقة وتكرار تسطيح.
- باستخدام القاطع مناسبة أو شفرة حلاقة المبللة في الايثانول المطلق، وإزالة الجزء الداخلي من الصمغ بولي (ديميثيلزيلوكسان) لخلق تجويف التي سوف تعقد في وقت لاحق الشتلات وبلاطة أجار ( الشكل 1D ).
- تقليم بعناية هلام مع شفرة حلاقة لخلق طوقا مع سمك الجدار النهائي ما يقرب من 2 مم ( الشكل 1E ). نفاذية الغازات من خلال حاجز بولي (ديميثيلزيلاكسان) مستقلة عن سمك فوق 50 ميكرون 11 .
2. إنشاء أجار-- صلابة بلاطة النمو المتوسطة
- على شريحة المجهر مع اثنين من شرائط الزجاج، ووضع ساترة (22 مم × 50 مم) بحيث تقع على كل من شرائط الزجاج.
- ماصة ذابت نصف القوة موراشيج وسكوغ متوسطة النمو تحتوي على 1٪ ث / س السكروز و 1.5٪ ث / الخامس أغار (½ مس) في الفضاء الناتجتحت ساترة حتى يتم شغل هذا الأخير تماما (حوالي 1 مل الحجم الكلي) وترك حتى يتم تعيين أجار (حوالي 5 دقائق).
ملاحظة: المركبات الدوائية يمكن أن تدار من خلال لوح أجار بإضافة تركيزات مناسبة إلى وسط السائل قبل سكب بلاطة. وقد تم اختبار هذا بنجاح ل ديكساميثازون 12 ، إيزوكسابين، 2،6-ديكلوروبنزونيتريل (دسب)، أوريزالين، و لاترونكولين B.
3 - الانتهاء من إعداد غرفة
- الهواء بتوازن بد عن طريق هز حجم صغير من بد في أنبوب 7 . إضافة كمية صغيرة (حوالي 200 ميكرولتر) من الهواء معاير بد إلى البئر من طوقا هلام، ولكن لا ملء الغرفة تماما. وهذا بد يساعد على تجنب محاصرة فقاعات الهواء تحت لوح أجار كما يتم وضعها في الغرفة.
- إزالة ساترة من لوح أجار (في الخطوة 2.2 أعلاه) واستخدام شفرة حلاقة لقطع جزء من ديسيريد الحجم والشكل. ثم ضعه في بئر من طوقا هلام ( الشكل 1F ). يجب أن يكون هناك فجوة من 2-4 ملم إلى طوقا في جميع أنحاء.
- ملء الغرفة تماما مع الهواء معاير بد.
- وضع واحد أو أكثر من الشتلات A. ثاليانا (ما يصل إلى 3 شتلات للتصوير أكثر من 2-3 أيام) على لوح أجار مع كوتيليدونس وهيبوكوتيل معلقة على الحافة، وتطفو في بد ( الشكل 1G ).
- للحصول على الشتلات، تعقيم البذور مع 70٪ من الإيثانول، النبات على ½ مس المتوسطة تستكمل مع 1٪ السكروز و 0.8٪ أجار، ستراتيفي لمدة 2-4 أيام في 4 درجات مئوية، وتنمو على لوحات موجهة عموديا عند 22 درجة مئوية في 16 ساعة ضوء / 8 ساعة نظام الظلام. للجذور الجانبية التصوير، وتنمو النباتات لمدة 7-10 أيام قبل نقلها إلى غرف التصوير.
- لإغلاق الغرفة، وتطبيق ساترة مطابقة لبصريات الهدف، والضغط عليه بلطف أسفل حافة شريحة المجهر الزجاجي حتى ساترةويستند على كل من شرائط الزجاج ( الشكل 1H ).
- تأمين ساترة مع شرائط من 1.25 سم واسعة ميكروبور الشريط الجراحية قطع في نصف طول الحكمة على كل نهاية إذا رغبت في ذلك ( الشكل 1I ). السماح للعينة لتسوية لمدة 30 دقيقة تقريبا قبل التصوير. هذا يقلل من حركة العينة أثناء التصوير.
- إجراء التصوير مع المجهر تستقيم للحفاظ على الركيزة تسيطر على النمو. استخدام أهداف 20X / 0.7NA أو 63X / 1.2NA CS2.
Representative Results
الجذور الجانبية تنمو في معدلات الفسيولوجية في غرف التصوير.
تم قياس أطوال الجذور الجانبية للنباتات في غرف التصوير على فترات كل ساعة ( الشكل 2A ، يسار، الفيلم 1، ن = 23) وتمت مقارنة معدلات النمو لتلك الجذور الجانبية التي تزرع على لوحات بتري القياسية التي تحتوي على نفس المتوسطة أجار ترسيخ ( الشكل 2A ، يمين، فيلم 2، ن = 23). ويمكن أن تتفاوت معدلات النمو اختلافا كبيرا بين الجذور الجانبية، مع كون طول الجذر عاملا حاسما بسبب تزايد مناطق النمو والانتشار 13 . لذلك، تم اختيار مجموعات من الجذور الجانبية لتمثيل جذور أطوال أولية مختلفة (تتراوح بين 50 ميكرون إلى 1150 ميكرون) في كل من غرفة التصوير وصفيحة أجار. متوسط طول الجذر الجانبي في بداية التجربةكانت مماثلة في كل مجموعة (439 و 442 ميكرون لغرف التصوير والألواح، على التوالي). في الفترة الزمنية التي تم تحليلها من 27 ساعة، كان نمو الجذر الجانبي خطي تقريبا في كل من غرف التصوير وعلى لوحات، بمعدل نمو متوسط قدره 52 ميكرون / ساعة (R 2 = 0.997) على لوحات و 51 ميكرون / ساعة في غرف التصوير ( R 2 = 0.993) ( الشكل 2B ). معدلات نمو الجذور الجانبية الفردية حيث متغير للغاية على حد سواء على لوحات وغرف التصوير ( الشكل 2C )، تتراوح من 17 ميكرون / ساعة إلى 82 ميكرون / ساعة في غرف التصوير ومن 13 ميكرون / ساعة إلى 87 ميكرون / ساعة على لوحات. في حين أن معدلات النمو عموما مع زيادة طول الجذر، ومعدلات النمو لا تزال تختلف اختلافا كبيرا بين جذور طول مماثل ولكن التباين كان مماثلا في غرف التصوير وعلى لوحات.
الجذور الجانبية تتكاثر في غرف التصوير ويمكن تصويرها باستخدام مرحباغ أهداف العددية الفتحة.
الجذور الجانبية المشارك في التعبير عن علامة غشاء البلازما NPSN12-يف 14 وعلامة أنيبيب UBQ1 :: تم تصويرها رفب-توبولين BETA6 (رفب-TUB6) 15 من قبل كلسم 10 على فترات 1 ساعة لتوثيق السلوك ميكروتوبول خلال تكاثر الخلايا في غرف التصوير ( الشكل 2D ، فيلم 3). في هذه الغرف، كانت الجذور الجانبية مستقرة للغاية في موقفها على محاور x، ص و z، مما يسمح للاكتساب المستمر مداخن متقطعة البؤر الوقت على مدى عدة ساعات. تكاثرت الخلايا ميريستيماتيك باستمرار، كما هو واضح من تشكيل العصابات بريبروفاس ( الشكل 2D ، الأسهم الخضراء)، المغزل الانقسامية ( الشكل 2D ، الأسهم البيضاء)، و فراغموبلاستس ( الشكل 2D ، الأسهم الزرقاء). كما هو الحال مع الشتلات على لوحات بتري،بدأت الخلايا الجذرية ممدود تماما في غرف التصوير بدأت الشعر الجذرية ( الشكل 2A ، الشكل 2D ، رؤوس الأسهم)، مشيرا إلى أن مواصلة التنمية كما هو متوقع في غرف التصوير. لتوفير مجال واسع من الرأي، تم الحصول على الصور في الشكل 2D مع الهدف 20X / 0.7 نا. وكان من الممكن أيضا للحصول على صور عالية الدقة من الجذور الجانبية باستخدام عالية العددية الفتحة 63x / 1.2 نا غمر المياه الهدف ( الشكل 2E ).
يستمر نمو الجذر الجانبي في غرف التصوير لمدة تصل إلى ثلاثة أيام.
لاستكشاف طول فترة التصوير يمكن أن تدعم نمو الجذر الجانبي في معدلات الفسيولوجية، تم تحديد طول الجذر الجانبي في غرف التصوير (ن = 27) وعلى لوحات (ن = 33) كميا في 0 ساعة و 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة. جذور تشوسين أقصر من 200 ميكرون في 0 ساعة، مع متوسط طول الجذر الجانبي من 117 ميكرون في غرف التصوير و 121 ميكرون على لوحات. منذ جذور أقصر تنمو ببطء أكثر في المتوسط ( الشكل 2C )، فإنها نمت على حافة بلاطة أجار أقل في كثير من الأحيان، وكانت أسهل للصورة. لم يكن متوسط نمو جميع الجذور الجانبية مختلفا بشكل كبير في غرف التصوير مقارنة مع لوحات بيتري في أول 48 ساعة ( الشكل 3A ). ومع ذلك، انخفض متوسط النمو بشكل ملحوظ بين 48 ساعة و 72 ساعة ( الشكل 3A ). في حين أن معدلات النمو يبدو أن تباطؤ عموما في غرف التصوير بعد 48 ساعة، ومعدلات النمو بين الأفراد لا تزال متغيرة للغاية ( الشكل 3B ، 3C )، وهو ما يعني أن هناك مجموعة كبيرة من الجذور الجانبية التي تنمو بأسعار مماثلة على لوحات وغرف على مدى 72 ساعة كاملة فترة النمو. 23 من الجذور الجانبية 33 نمتعلى لوحات (69.7٪) تصل إلى طول في غضون انحراف معياري واحد من متوسط طول في 72 ساعة (بين 927 و 3،163 ميكرون، الشكل 3B ، الأحمر). 10 من 27 (37.0٪) الجذور الجانبية في غرف التصوير تصل إلى طول ضمن هذا الفاصل الزمني ( الشكل 3B والأحمر).
ويمكن بسهولة تكييف غرف التصوير للجذور الجانبية القديمة، والجذور الأولية والهيبوكوتيل .
وكان واحدا من القيود المفروضة على تصميم غرفة التصوير الأصلي أنه في حين قدم بلاطة أجار قاسية بعض المقاومة الميكانيكية، جذور تنمو غرافيتروبيكالي اخترقت في نهاية المطاف بلاطة أجار، مما أدى إلى فقدان جودة الصورة ( الشكل 4B ) والنمو بعد مسافة العمل عالية نا العدسات، حتى طويلة نسبيا العمل عن بعد (0.3 ملم) 63X / 1.3 نا CS2 الهدف. جذور جانبية الشباب تفتقر إلى التي تحتوي على التماثيلخلايا كولوموميلا المطلوبة ل غرافيتروبيسم 17 حتى أنها نمت في البداية موازية ساترة في غرف التصوير ( الشكل 2E ). كما أنها تنمو أطول و كولوميلا و ستاتوليثس الشكل، الجذور الجانبية تظهر زيادة الجاذبية الإيجابية، في حين جذور الأولية تظهر استجابة غرافيتروبيك قوية من الإنبات فصاعدا. وهذا يقيد لبضع ساعات في الفترة التي يمكن تصوير الجذور الأولية ويحد بشدة من طول البدء للجذور الجانبية التي يمكن تصويرها بشكل مستمر لمدة 48 ساعة أو أكثر. للتغلب على هذا القيد، تم تعديل الغرفة بحيث يتم الحفاظ على النمو موازية ساترة من قبل غشاء السيلوفان السليلوفاني الذي يعمل كحاجز اختراق على سطح بلاطة أجار ( الشكل 4A ). تسببت المحاولات الأولية باستخدام لوح أجار 1.5٪ في انخفاض نمو الجذور خلال أول 24 ساعة، ويرجع ذلك إلى الإجهاد الميكانيكي. تم اختبار تركيزات أجار أقل في لوح أد وجد أنه في الغرف ذات البلاطة التي تحتوي على أجار 0.8٪ والأغشية السليلوز، ومعدلات نمو الجذر الجانبي الشباب لا تختلف اختلافا كبيرا عن معدلات النمو في الغرف التقليدية لأول 48 ساعة. كان متوسط نمو الجذور في غرف السليلوز والحجرات التقليدية 242 ميكرون و 262 ميكرومتر على التوالي (p = 0.78 طالب t-تيست) و 2448 ساعة كان 330 ميكرون و 355 ميكرومتر 1 على التوالي (p = 0.67 ستودنت's اختبار t)؛ ن = 12 و ن = 11، على التوالي. هذا الترتيب تمنع بشكل فعال الجذور الجانبية من النمو بعيدا عن ساترة، في أجار، وأيضا يسمح التصوير من الجذور الأولية لمدة تصل إلى 48 ساعة ( الشكل 4C ).
لاختبار ما إذا كان يمكن تكييف غرف التصوير لأعضاء أخرى من الجذور، تم اختيار هيدروكوتيل أرابيدوبسيس. هيبوكوتيلز هي أكثر سمكا بكثير من الجذور حتى في غرفة التصوير التقليدية، و ج العلويتم تقلص اللف ضد ساترة، مما يؤدي إلى تشوه. ولذلك تم تطوير تصميم بديل باستخدام الشرائح تجويف التي تحتوي على الاكتئاب البيضاوي في مركزهم ( الشكل 4D ). في هذا التكوين، تم وضع بلاطة سميكة 1 ملم من أجار (أعدت كما في 2.2 أعلاه) مع نهاية واحدة جاحظ من قبل بضعة ملم في تجويف الشريحة ( الشكل 4D ). تم وضع هيموكوتيلز فوق التجويف في الشريحة بينما تم وضع الجذر فوق الجزء الأفقي. وهذا يضمن أن الشتلات تم إصلاحها في الفضاء من قبل الجذر، ولكن لم يتم سحق الهيبوكوتيل. في حين لم تكن معدلات النمو في الغرف مقارنة مع لوحات كميا بشكل منهجي، أظهرت الهيموكوتيل في غرف التصوير الموجه جيدا من النمو الطولي تهاجر حتى هيبوكوتيل ( الشكل 4E ، 4F ) 16 .
الشكل 1 : تجميع غرفة التصوير. كل التفاصيل موضحة في النص. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : الجذور الجانبية تنمو في ظل الظروف الفسيولوجية في غرف التصوير. ( أ ) أرابيدوبسيس تطوير الجذر الجانبي في غرفة التصوير (يسار) وعلى لوحة (يمين) أكثر من 25 ساعة (الضوء المستمر، حضانة أفقية، والتصوير في وقت واحد). مقياس الحانات = 200 ميكرون. ( ب ) مؤامرة تظهر أطوال الجذر الجانبي أكثر من 27 ساعة (تقاس في فترات 1 ساعة)، من الجذور الجانبية كما هو مبين في ( A ). Individ(ن = 23 للألواح وغرف التصوير)، متوسط طول الدوائر الحمراء. أشرطة الخطأ = 1 سد. الخط الأحمر هو خطية تناسب من خلال متوسط أطوال. ( ج ) مؤامرة تبين متوسط معدل النمو لجميع الجذور الجانبية المبينة في ( ب ) بالنسبة لطولها الأولي. ( D ) أقصى كثافة إسقاطات من مداخن مبائر 3D المكتسبة من جذور جانبية معربا عن NPSN12-يف و رفب-TUB6 في نقاط زمنية متتالية. أقحم: تكبير المنطقة محاصر. السهام الخضراء: نطاقات بريبروفاس؛ السهام البيضاء: المغزل الانقسامية. السهام الزرقاء: فراغموبلاستس. أروهيادس: الشعر الجذر. ( E ) إسقاطات أقصى كثافة للصور عالية الاستبانة المكتسبة من جذر جانبي شاب للخط المعدل وراثيا المبين في ( D ) باستخدام هدف 63X / 1.2 نا و أخذ العينات نيكويست (أبعاد البكسل 77 نانومتر × 77 نانومتر) عند 0 h و 16 ح. النجمة تحديد خلايا متطابقة في كل نقطة زمنية. السهم يشير إلى خلية تقسم بين 0h و 16 h.الحانات مقياس = 50 ميكرون (أس)؛ 20 ميكرون (E). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : التنمية الجذر الجانبي على المدى الطويل في غرف التصوير. ( A ) مؤامرة تبين متوسط نمو الجذر المطلق في ثلاث فترات متتالية 24 ساعة في غرف التصوير مقارنة مع لوحات. نس يشير إلى p> 0.05؛ *** يشير إلى p <0.001 (t-تيست). n = 33 (لوحات) و n = 27 (غرف التصوير). ( ب ) مؤامرة تظهر أطوال الجذر الجانبي في نقاط زمنية متتالية على جميع الجذور المستخدمة في (A). الأحمر: جميع الجذور الجانبية بطول نهائي ضمن 1 سد من متوسط جميع الجذور الجانبية التي تزرع على لوحات (بين 927 و 3163 ميكرون). ( C ) الحد الأقصى فيتوقعات كثافة من ممثل مداخن مبائر 3D من علامة البلازما غشاء NPSN12-يف في الجذور الجانبية، المكتسبة في نقاط زمنية متتالية أكثر من 72 ساعة. مقياس الحانات = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : غرف تكييف يمكن تكييفها لأعضاء النبات الأخرى. ( A - C ) التصوير غرفة التكيف للجذور الأولية. ( A ) تخطيطي من تصميم غرفة التصوير. هذا هو مماثل لتصميم القياسية ( الشكل 1 ) وبصرف النظر عن اثنين من التعديلات: لوح متوسط مس يحتوي على 0.8٪ أجار بدلا من 1.5٪ أجار، ويتم وضع فيلم السليلوز (الأحمر) بين أجار والنبات لمنع النموفي أجار. ( B ) زي (أعلى) و شز (أسفل) إسقاطات أقصى شدة من مداخن متحد البؤر 3D من علامة NPSN12-يف الغشاء البلازما في الجذر الأساسي من الشتلات القديمة 7 يوم تصويرها في 0 ساعة و 48 ساعة في التصوير التقليدي غرفة. لاحظ أن الجذر ينمو في أجار بسبب استجابة غرافيتروبيك لها. ( C ) زي (أعلى) و شز (أسفل) إسقاطات أقصى شدة من مداخن مبائر 3D تمثيلية من علامة غشاء البلازما NPSN12-يف في الجذر الأساسي من الشتلات القديمة لمدة سبعة أيام تصويرها في 0 ساعة و 48 ساعة في التصوير غرفة مع فيلم السليلوز. قبل التطبيق، تم تعقيم الفيلم السليلوز في الايثانول 80٪ وغارقة في السائل ½ مس المتوسطة. لاحظ أن نمو غرافيتروبيك من الجذر في أجار هو منع. ( D - F ) التصوير غرفة التكيف ل هيبوكوتيلز. ( D ) التخطيطي تظهر تصميم غرفة التصوير الهيبوكوتيل. A بولي (ديميثيلزيلوكسان) طوقا العلكة (الرمادي) هو مانوفاكتوالأحمر، عن، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، تجويف، إنتظم في طبقة، في فترات متباعدة، الثاني في مجموعة، شرائط الزجاج، (يلو). يتم وضع لوح من 1.5٪ أجار من سمك حتى (البيج) على الشريحة، تصل جزئيا إلى تجويف. يتم تعبئة الغرفة مع بد (الأزرق). يتم وضع الشتلات على لوح أجار بحيث تحتل الهيبوكوتيل المنطقة المنحدرة لأسفل من لوح أجار في تجويف بينما يتم وضع الجذر الجزء الأفقي من أجار. يتم إغلاق الغرفة مع ساترة. ( E ) إسقاطات أقصى كثافة من مداخن مبائر 3D ممثل من البلازما غشاء علامة NPSN12-يف في هيبوكوتيل من الشتلات القديمة لمدة يومين تصوير أكثر من 48 ساعة في نقاط زمنية متتالية. ( F ) النمو الطولي في فترتين زمنيتين متتاليتين من الخلايا الفردية على طول القاعدية إلى المحور القمي (المواقف النسبية عند 0 ساعة على طول المحور الموضح في E) من الهيبوكوتيل المبين في ( E ). لاحظ موجة وصفها سابقا من النمو يهاجرون حتى الهيبوكوتيل 16 . الحانات مقياس = 100 μم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1: الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الفيلم.
فيلم 2: الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيلم.
فيلم 3: يرجى cلعق هنا لتحميل هذا الفيلم.
Discussion
الطريقة المعروضة هنا هي استراتيجية بسيطة للتصوير مبائر عالية الدقة لتطوير الجذور الجانبية لمدة سنتين وتصل إلى ثلاثة أيام. لفترات تصل إلى 48 ساعة، لم يلاحظ أي آثار ضارة لنظام التصوير على تطوير الجذر الجانبي. بعد 48 ساعة، بدأ متوسط نمو الجذر الجانبي في التباطؤ، على الرغم من أن مجموعة فرعية كبيرة من الجذور (37٪) استمرت في النمو بمعدلات مماثلة لمتوسط نمو الجذور على الصفائح. لذلك، من خلال تصوير عدد كبير بما فيه الكفاية من الجذور، الجذور التي تباطأ النمو بعد 48 ساعة يمكن استبعادها. لم يتم إجراء اختبارات منتظمة لغرف التصوير لفترات أطول من 72 ساعة، ولكن ينصح باستراتيجيات بديلة إذا كانت فترات التصوير الموسعة مطلوبة. يمكن ترك غرف التصوير على المسرح المجهر بشكل مستمر، إذا تم توفير الظروف البيئية المناسبة، أو إزالتها إلى منشأة النمو وعاد بشكل دوري إلى المجهر. هذا يسمح العديد من غرف ليتم تصويرها في موازاة. </ P>
ميزة واحدة من غرف وصفها هنا هو أن الجذور الجانبية ثابتة في موقفها ويمكن تصويرها باستخدام عالية الدقة العدسات الغمر المياه. الاستقرار المكاني يعتمد بشكل حاسم على تركيز أجار المستخدمة في بلاطة أجار دعم. في البداية تم اختبار مجموعة من تركيزات مختلفة من أجار 0.8٪ إلى 2٪ آجار، وكشف عن أن تركيزات عالية في هذا النطاق جذور ثابتة ثابتة في الفضاء، ولكن تباطؤ نمو الجذر بشكل أسرع وبعض الجذور عرضت علامات الإجهاد الميكانيكي، بما في ذلك انخفاض استطالة الخلية. وعلى النقيض من ذلك، فإن تركيزات أجار منخفضة لم توفر الدعم المطلوب وجذور انجرفت في x، y، z خلال التصوير. المثلى 1.5٪ أجار بلاطة يثبت موقف العينة دون آثار ميكانيكية ضارة. في ظل هذه الظروف، بعد تسوية في أول 30 دقيقة أو نحو ذلك، جذور مستقرة على مدى ساعات عديدة، مما يسمح الحصول على البيانات بين عشية وضحاها. أثناء الحصول على البيانات 4D، كانت نطاقات z- كومة عادة بمضرب من 5-10 ميكرون إضافية ولكن هذا كان أساسا لاستيعاب النمو خارج الطائرة من الجذور الجانبية بدلا من z-- الانجراف أو تمايل. على الرغم من أن تركيز أجار القياسية يوفر بعض المقاومة ضد الاختراق، والجذور المتنامية غرافيتروبيكالي في نهاية المطاف تخترق أجار. ومع ذلك، من خلال تعديل طفيف من غرفة التصوير، ويمكن الحفاظ على نمو الجذر موازية ساترة، مما يسمح للجذور الجانبية القديمة والجذور الأولية لتكون تصوير. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة أن تكون مخصصة غرفة التصوير الأساسية ل هيبوكوتيلز. هيبوكوتيلز هي أكثر بحرية العائمة في هذا النظام بحيث تم زيادة قوس Z- محور للحصول على صورة عادة إلى حوالي 20 ميكرون. في هذه الدراسة، تم استخدام المجهر تستقيم في جميع أنحاء، مما يسمح للخصائص الركيزة ليتم السيطرة عليها. غرفة التصوير قد تكون قابلة للتكيف مع تكوينات المجهر مقلوب ولكن التأثير على الوقت من ساترة جامدة على اعتراض الأجهزة تحتاج إلى تقييم. وقد أشار ليتلجوهن وزملاؤه إلى أن بد نفسها لا تذوب بسهولة الجزيئات البيولوجية، مما يعني أنه لا يمكن استخدامها مباشرة لتسليم المركبات الدوائية 7 . تم التغلب على هذه المشكلة عن طريق توريد مثل هذه المركبات من خلال بلاطة من وسط النمو المعزز الذي يقع على لوح أجار. في حين أن نظم نضح ستبقى الطريقة المفضلة للتجارب غسل التدريجي، وقد استخدمت غرفة التصوير بنجاح لإدارة ديكساميثازون 12 والمركبات الأخرى. ملاحظة واحدة، في حين أن هذه المادة في التحضير فون واجنهيم وزملاؤه 18 وصفت غرفة للتصوير تطوير الجذر الجانبي باستخدام ورقة الضوء المجهري.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر البروفيسور جيفري واستينيس، جامعة كولومبيا البريطانية، للتعبير عن البذور رفب-TUB6 ومراجع مجهول للحصول على تصحيحات مفيدة. ونحن ممتنون للبروفيسور هيو ديكنسون لتنبيهنا إلى استخدام فيلم السليلوز كدعم ميكانيكي وجون بيكر للتصوير الفوتوغرافي. وقد دعم هذا العمل بمنح البحوث ببسك / بب / G013993 / 1 و بب / D004055 / 1 إلى إم، وجائزة تدريب الدكتوراه ببسرك ومنحة كلارندون إلى سك
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
| Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
| Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
| Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80 mm disc |
References
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Meth. 11, 22 (2015).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression. Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).
- Baranenko, V., et al. Solubility of oxygen and carbon dioxide in water. Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. Plos One. 6, (2011).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).
- Littlejohn, G. R., Love, J. A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium. J Vis Exp. , (2012).
- Littlejohn, G. R., et al. An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology. Front Plant Sci. 5, 140 (2014).
- Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons. Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes. J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).
- Kirchhelle, C., et al. The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis. Dev Cell. 36, 386-400 (2016).
- Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
- Geldner, N., et al. Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set. Plant J. 59, 169-178 (2009).
- Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis. Nat Commun. 2, 430 (2011).
- Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).
- Gendreau, E., et al. Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).
- von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel. J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).
