Summary
Presenterad här är en enkel teknik för högupplösning av konfokal tidsfördröjning av rot och hypokotylutveckling i upp till 3 dagar med höga numeriska bländningsmål och perfluorodekalin som ett nedsänkningsmedium.
Abstract
Flera aspekter av växtutveckling, såsom lateral rotmorfogenes, uppträder på tidsintervaller av flera dagar. För att studera underliggande cellulära och subcellulära processer krävs högupplösningstid-lapse-mikroskopi strategier som bevarar fysiologiska tillstånd. Växtvävnader måste ha tillräckligt med näringsämnen och vattenförsörjning med långvarig gasutbyte, men när de nedsänks och immobiliseras under en täckglas är de särskilt mottagliga för anoxi. En strategi som framgångsrikt har använts är användningen av ett perfusionssystem för att upprätthålla en konstant tillförsel av syre och näringsämnen. Sådana arrangemang kan emellertid vara komplicerade, besvärliga och kräva specialiserad utrustning. Presenteras här är en alternativ strategi för ett enkelt bildsystem med användning av perfluorodekalin som ett nedsänkningsmedium. Systemet är enkelt att installera, kräver minimal utrustning och kan enkelt monteras på ett mikroskopsteg, vilket gör att flera bildkammare kan ställas in och avbildas i parallel. I detta system är laterala rottillväxthastigheter oskiljbara från tillväxten under standardbetingelser på agarplattor under de första två dagarna, och lateral rottillväxt fortsätter vid reducerade hastigheter under åtminstone en annan dag. Växtvävnader levereras med näringsämnen via en agarplatta som också kan användas för att administrera en rad farmakologiska föreningar. Systemet upprättades för att övervaka lateral rotutveckling men kan lätt anpassas till bild andra växtorgan som hypokotyler och primära rötter.
Introduction
För att studera cellulära och subcellulära processer som ligger till grund för växtutveckling, finns det en ökande efterfrågan på långsiktiga time-lapse imaging strategier. En viktig utmaning vid sådana avbildningsförsök är att upprätthålla fysiologiska förhållanden, inklusive tillräcklig gasutbyte samt en tillförsel av vatten och näringsämnen 1 , 2 , 3 . För att utnyttja mål med höga numeriska öppningar för optimal optisk upplösning bör prover placeras i närheten och orienterade parallellt med täckglaset. Rörelse i x, y och z riktningar borde helst vara minimal under bildbehandling.
Medan plantor ofta monteras i vatten eller vattenhaltig lösning för korttidsbildning, har vatten en låg kapacitet för upplösning av CO 2 och O 2 (1,54 mg / ml respektive 0,04 mg / ml respektive 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , vilket görDet är olämpligt för förlängda tidsförloppsexperiment. Perfusionssystem som upprätthåller konstanta nivåer av syre och näringsämnen är en lösning på detta problem och har utvecklats för både mikroskopi (CLSM) 1 , 2 , 3 och ljusmikroskopi (LSM) 5 för konfokal laserskanning. System som RootChip 2 och RootArray 3 har utformats speciellt för tidsförskjutning av bildande av utvecklingsrötter och involverar groddfrön i en skräddarsydd flerprovsenhet. Dessa arrangemang säkerställer minimal mekanisk störning och är konstruerade för parallellanalys av flera plantor, men är inte optimerade för avbildning av subcellulära strukturer. Calder och kollegor har utformat en mer komplicerad perfusionsbaserad bildkammare optimerad för avbildning av subcellulära strukturer, där provet hålls i position med ett nätFör att tillåta användning av högförstoringsdämpande linser 1 .
Presenteras här är en alternativ, enkel lösning på detta problem som inte är baserat på perfusionssystem men använder perfluorodekalin (PFD), ett perfluorokarbonat som nyligen har blivit populärt som monteringsmedium för Arabidopsis-bildbehandling 6 , 7 , 8 . I sådana tillämpningar möjliggör den höga kapaciteten hos PFD för upplösning av CO 2 och O 2 (1,9 g / ml för O 2 i PFD jämfört med 0,04 mg / ml i vatten) 9 , gasutbyte genom nedsänkt vävnad. Vidare är PFD icke-fluorescerande och dess brytningsindex (1.313) är jämförbart med det för vatten (1,333) och är närmare det för cytosol (~ 1,4) än luft (1,000) 6 . Perfluorokarboner har rapporterats ha minimal fysiologisk effekt på en mängd växter och växter tUtfärdar 6 , med rädisfrön som lätt spricker när nedsänkt i PFD och uppvisar normal tillväxt och utveckling under minst två fulla dagar när den levereras med vatten 10 . Liknande observationer har gjorts för fröer av arabidopsis 6 . Baserat på stimulerad Raman-spridning för att direkt avbilda fördelningen av PFD i Arabidopsis bladvävnader efter infiltration, konstaterar Littlejohn och kollegor att PFD sannolikt inte tas upp av levande celler 8 . PFD har tidigare använts huvudsakligen för flygfotovävnader, där det väsentligt ökar bilddjupet eftersom det lätt infiltrerar luftutrymmen på grund av sin låga ytspänning 6 . Här antas PFD för långvarig konfokal avbildning av utvecklande laterala rötter. I denna konfiguration placeras en eller flera plantor på en platta av tillväxtmedium solidifierad med agar och nedsänkt i PFD. PFD tillåter gAseous utbyte i bildkammaren, förhindrande av anoxi. PFD är mycket flyktig så att den bibehålls av en packning av poly (dimetylsiloxan) gummi som också har hög gaspermeabilitet (1,5 x 10-12 pmol m -1 s -1 Pa -1 för CO2) 11 . Näringsämnen och vatten tillföres av plattan av medium solidifierat med agar. Samtidigt trycker denna agarplatta försiktigt mot roten mot täckglaset och fixerar därigenom sin relativa position i bildkammaren och tillåter användningen av högupplösta vattenlinser. Vidare kan agarplattan användas för att administrera ett antal farmakologiska behandlingar, inklusive dexametason, oryzalin och isoxaben. Bildkamrarna kan monteras i stort antal från standardmikroskopi diabilder med minimal utrustning. Bildkammare utvecklades och karaktäriserades för att studera rotationsutveckling i sidled, men kan anpassas till bildning av andra plantor, såsom primära rottips ochhypokotyler.
Protocol
1. Skapa kammaren
- Använd en glasskärare, skär 3 mm breda band från slutet av en 1 mm tjock mikroskopglas. Limma dessa glasband ca 45 mm från varandra över bredden på en andra mikroskopglas ( Figur 1A ) med ett superlim eller dubbelsidigt tejpband av cyanoakrylat. En glid per kammare krävs, plus ytterligare glidbanor för att hälla agarplattor (en glid kommer att ge 2-3 agarplattor). Slides kan återanvändas.
- Mellan glasremsorna sättes en packning av samma höjd ut ur gasgenomsläppligt poly (dimetylsiloxan) gummi. Placera en boll av poly (dimetylsiloxan) gummi på glidbanan ( figur 1B ), blöt en andra glid med en liten mängd 100% absolut etanol och platta poly (dimetylsiloxan) gummiboll med den andra gliden tills den har nått höjden Av glasremsor ( Figur 1C ).
- Om nödvändigt, trimma överskott poly (dimeTylsiloxan) gummi med ett rakblad och repetera flattbildning.
- Ta bort den inre delen av poly (dimetylsiloxan) gummit genom att använda ett lämpligt skär- eller rakblad som är fuktat i absolut etanol för att skapa kaviteten som senare kommer att hålla plantans och agarplattan ( Figur 1D ).
- Torka försiktigt gelen med ett rakblad för att skapa en packning med en slutlig väggtjocklek på cirka 2 mm ( Figur 1E ). Gaserens permeabilitet genom en poly (dimetylsilaxan) barriär är oberoende av tjocklekar över 50 μm 11 .
2. Skapa den agar-stelnade plattan av tillväxtmedium
- Placera en täckglas (22 mm x 50 mm) på en glasskiva med två glasremsor så att den vilar på båda glasremsor.
- Pipettsmält halvhärdig Murashige och Skoog tillväxtmedium innehållande 1% vikt / volym sackaros och 1,5% vikt / volym agar (½ MS) i det resulterande utrymmetUnder täckglaset tills den sistnämnda fylls fullständigt (ca 1 ml total volym) och lämnar tills agar är inställd (ca 5 min).
Anmärkning: Farmakologiska föreningar kan administreras genom agarplattan genom att tillsätta lämpliga koncentrationer till det flytande mediet innan hällen hälls. Detta testades med framgång för dexametason 12 , isoxaben, 2,6-diklorbensonitril (DCB), oryzalin och latrunculin B.
3 . Avsluta kammarinstallationen
- Luftekvilibrerar PFD genom att skaka en liten volym PFD i ett rör 7 . Tillsätt en liten mängd (cirka 200 μl) luftekvivalent PFD till gelens packning, men fyll inte kammaren fullständigt. Denna PFD hjälper till att undvika fångst av luftbubblor under agarplattan när den placeras i kammaren.
- Ta bort täckglaset från agarplattan (i steg 2.2 ovan) och använd ett rakblad för att skära av en del av deFördröjd storlek och form. Placera det sedan i gaskärlens brunn ( Figur 1F ). Det borde finnas ett mellanrum på 2-4 mm till packningen runt.
- Fyll kammaren fullständigt med luft-jämviktad PFD.
- Placera en eller flera A. thaliana plantor (upp till 3 plantor för avbildning över 2-3 dagar) på agarplattan med cotyledonerna och hypokotylen hängande över kanten, flytande i PFD ( Figur 1G ).
- För att få fröplantor, sterilisera frön med 70% etanol, stallera i ½ MS-medium kompletterat med 1% sackaros och 0,8% agar, stratifiera i 2-4 dagar vid 4 ° C och odla på vertikalt orienterade plattor vid 22 ° C i en 16 H ljus / 8 h mörk regim. För bildbehandling av laterala rötter växer växter i 7-10 dagar före överföring till bildkammare.
- För att stänga kammaren, applicera en täckglas som passar till objektets optik, tryck försiktigt ner den med kanten av en glasmikroskopskiva tills täckglasetVilar på båda glasremsor ( Figur IH ).
- Skydda täckglaset med remsor med 1,25 cm brett mikropor kirurgiskt band som skärs i halv längdvis vid varje ände om så önskas ( Figur 1I ). Låt provet sedimentera i ca 30 min före bildbehandling. Detta minimerar provrörelsen under bildbehandling.
- Utför bildbehandling med ett upprätt mikroskop för att upprätthålla ett kontrollerat substrat för tillväxt. Använd 20X / 0.7NA eller 63X / 1.2NA CS2 mål.
Representative Results
Lateralrötter växer vid fysiologiska satser i bildkammare.
Lateralrotslängder av växter i bildkammare mättes med timmeintervaller ( Figur 2A , vänster, Film 1, n = 23) och tillväxthastigheter jämfördes med de av laterala rötter odlade på vanliga Petri-plattor innehållande samma agarförstärkta medium ( Figur 2A , höger, film 2, n = 23). Tillväxthastigheten kan variera avsevärt mellan laterala rötter, med rotans längd som en avgörande faktor på grund av de allt längre zonerna av tillväxt och proliferation 13 . Därför valdes uppsättningar av laterala rötter för att representera rötter med olika initiala längder (sträcker sig från 50 μm till 1150 μm) i både bildkammaren och agarplattan. Genomsnittlig lateral rotlängd vid experimentets börjanVar lika i varje uppsättning (439 och 442 μm för bildkammare respektive plattor). Under det analyserade tidsintervallet på 27 timmar var sidoväxtillväxten approximativt linjär både i bildkammare och på plattor, med en genomsnittlig tillväxttakt på 52 | im / h (R2 = 0,997) på plattor och 51 | im / h i bildkammare ( R2 = 0,993) ( Figur 2B ). Tillväxthastigheter för individuella laterala rötter var mycket varierbara både på plattor och i bildkammare ( Figur 2C ), från 17 μm / h till 82 μm / h i bildkammare och från 13 μm / h till 87 μm / h på plattor. Medan tillväxten i allmänhet ökade med rotans längd varierade tillväxten fortfarande väsentligt mellan rötter av liknande längd men variationen var liknande i bildkammare och på plattor.
Laterala rötter proliferera i bildkammare och kan avbildas med hjälp av hejGh numerisk bländare mål.
De laterala rötterna som uttryckte plasmamembranmarkören NPSN12-YFP 14 och mikrotubulärmarkören UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15 avbildades genom CLSM 10 vid 1 h intervaller för att dokumentera mikrotubulärt beteende under cellproliferation i bildkammare ( Figur 2D , Film 3). I dessa kamrar var sidotrötterna mycket stabila i sin position på x-, y- och z-axlarna, vilket möjliggjorde förvärv av kontinuerliga tidsförlust-konfokala staplar över flera timmar. Meristematiska celler prolifereras kontinuerligt, vilket framgår av bildandet av preprofasband ( Figur 2D , gröna pilar), mitotiska spindlar ( Figur 2D , vita pilar) och fragmoplaster ( Figur 2D , blå pilar). Som med plantor på Petri plattor,Helt långsträckta rotceller i bildkammare initierade rothår ( Figur 2A , Figur 2D , pilhuvuden), vilket indikerar vidare att utvecklingen fortsatte som förväntat i bildkammarna. För att ge ett brett synfält, erhölls bilderna i Figur 2D med ett 20x / 0,7 NA-mål. Det var också möjligt att erhålla högupplösta bilder av laterala rötter med hjälp av ett högt numeriskt apertur 63x / 1,2 NA vattenintegreringsmål ( Figur 2E ).
Lateral rottillväxt upprätthålls i bildkammare i upp till tre dagar.
För att undersöka hur länge bildkammare skulle kunna stödja lateral rottillväxt vid fysiologiska satser kvantifierades lateral rotlängd i bildkammare (n = 27) och på plattor (n = 33) vid 0 h, 24 h, 48 h och 72 h. Rötterna choSen var kortare än 200 μm vid 0 h, med en genomsnittlig lateral rotlängd av 117 | im i bildkammare och 121 | im på plattor. Eftersom kortare rötter växer långsammare i genomsnitt ( Figur 2C ) växte de över agarplattans kant mindre ofta och var lättare att bilda. Den genomsnittliga tillväxten av alla laterala rötter var inte signifikant olika i bildkammare jämfört med Petri-plattor under de första 48 timmarna ( Figur 3A ). Den genomsnittliga tillväxten minskade emellertid signifikant mellan 48 timmar och 72 timmar ( Figur 3A ). Även om tillväxthastigheten verkar generellt sakta ner i bildkammare efter 48 timmar, fortsätter tillväxten mellan individerna mycket varierande ( Figur 3B , 3C ), vilket innebär att det finns en väsentlig delmängd av laterala rötter som växer vid jämförbara hastigheter på plattor och i kamrar Under hela 72 h tillväxtperioden. 23 av de 33 laterala rötterna odlasPå plattor (69,7%) når en längd inom en standardavvikelse av medellängden vid 72 h (mellan 927 och 3 163 μm, Figur 3B , röd). 10 av 27 (37,0%) laterala rötter i bildkammare når en längd inom detta intervall ( Figur 3B , röd).
Imagingkammare kan enkelt anpassas för äldre laterala rötter, primära rötter och hypokotyler .
En av begränsningarna i den ursprungliga bildkammarutformningen var att medan den styva agarplattan gav något mekaniskt motstånd, trängde gravitropiskt växande rötter så småningom in i agarplattan, vilket resulterade i förlust av bildkvalitet ( Figur 4B ) och tillväxt utöver arbetsavståndet för hög NA Linser, även det relativt långa arbetsavståndet (0,3 mm) 63X / 1,3 NA CS2-målet. Unga laterala rötter saknar statolith-innehållandeKolumellaceller som erfordras för gravitropism 17 så att de initialt växte parallellt med täckglaset i bildkammare ( figur 2E ). När de växer längre och columella och statoliter bildar laterala rötter en ökad positiv gravitropism, medan primära rötter uppvisar ett starkt gravitropiskt svar från spiring och framåt. Detta begränsar till några timmar den period över vilken primära rötter kan avbildas och det begränsar allvarligt startlängden av laterala rötter som kan avbildas kontinuerligt i 48 timmar eller mer. För att övervinna denna begränsning modifierades kammaren så att tillväxten bibehölls parallellt med täckglaset av ett cellulosacellofanmembran som verkar som en penetrationsbarriär på ytan av agarplattan ( Figur 4A ). Initiala försök med en 1,5% agarplatta orsakade minskad rottillväxt inom de första 24 timmarna, beroende på kanske mekanisk stress. Lägre agarkoncentrationer i plattan testades enD fann man att i kamrar med en platta innehållande 0,8% agar- och cellulosafilm, skiljde unga sidodelstillväxten inte signifikant från tillväxten i konventionella kamrar under de första 48 timmarna. För 0-24 h var den genomsnittliga rottillväxten i cellulosakamrar och konventionella kamrar 242 μm respektive 262 μm (p = 0,78 Studentens t-test) och i 24-48 h var 330 μm respektive 355 μm 1 (p = 0,67 Studentens t-test); N = 12 respektive n = 11. Detta arrangemang förhindrade effektivt att laterala rötter växte bort från täckglaset till agar och möjliggjorde också bildning av primära rötter i upp till 48 timmar ( figur 4C ).
För att testa om bildkammare skulle kunna anpassas för andra organ än rötter, valdes Arabidopsis hypokotyler. Hypokotyler är väsentligen tjockare än rötter så i den konventionella bildkammaren, den översta cElls pressades mot täckglaset, vilket ledde till deformation. En alternativ design utvecklades därför med hjälp av hålrumsskivor som innehåller en oval depression i deras centrum ( Figur 4D ). I denna konfiguration placerades en 1 mm tjock agarplatta (framställd som i 2.2 ovan) med ena änden utskjutande med några mm i glidhålan ( Figur 4D ). Hypokotyler placerades ovanför kaviteten i glidskenan medan roten placerades ovanför den horisontella delen. Detta säkerställde att plantan var fixerad i rymden av roten, men hypokotylen var inte krossad. Medan tillväxthastigheter i kamrar jämfört med plattor inte kvantifierades systematiskt, uppvisade hypokotyler i bildkammare den väl beskrivna vågen av longitudinell tillväxt som migrerade upp hypokotylen ( Figur 4E , 4F ) 16 .
Figur 1 : Montering av en bildkammare. Alla detaljer beskrivs i texten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Lateralrötter växer under fysiologiska förhållanden i bildkammare. ( A ) Arabidopsis lateral rotutveckling i en bildkammare (vänster) och på en platta (höger) över 25 h (konstant ljus, horisontell inkubation, samtidig bildbehandling). Skalstänger = 200 μm. ( B ) Plot som visar laterala rotlängder över 27 h (mätt i 1 h intervaller), med sidotrötter som visas i ( A ). individOvala rötter plottade i grått (n = 23 för plattor och bildkammare), medellängd som röda cirklar. Felstänger = 1 SD. Röd linje är linjär passform genom genomsnittslängder. ( C ) Plot som visar genomsnittlig tillväxt för alla laterala rötter visade i ( B ) i förhållande till deras ursprungliga längd. ( D ) Maximalintensitetsprojektioner av 3D-konfokala staplar som erhållits från laterala rötter som uttrycker NPSN12-YFP och RFP-TUB6 vid på varandra följande tidpunkter. Inset: Förstoring av boxad region. Gröna pilar: preprophase band; Vita pilar: mitotiska spindlar; Blå pilar: phragmoplasts; Arrowheads: root hairs. ( E ) Maximalintensitetsprognoser av högupplösta bilder som erhållits från en ung lateral rot av den transgena linjen som visas i ( D ) med användning av ett 63X / 1,2 NA-objekt och Nyquist-sampling (pixeldimensioner 77 nm x 77 nm) vid 0 h och 16 h; Asterisker lokalisera identiska celler vid varje tidpunkt Pilen indikerar en cell som skiljer sig mellan 0h och 16h.Skalstänger = 50 μm (AC); 20 jim (E). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 : Långsidig lateral rotutveckling i bildkammare. ( A ) Plot som visar genomsnittlig absolut rottillväxt i tre på varandra följande 24 h intervaller i bildkammare jämfört med plattor. Ns indikerar p> 0,05; *** indikerar p <0,001 (student t-test). N = 33 (plattor) och n = 27 (bildkammare). ( B ) Plot som visar laterala rotlängder på varandra följande tidspunkter på alla rötter som används i (A). Röd: Alla laterala rötter med en slutlig längd inom 1 SD av medelvärdet av alla laterala rötter odlade på plattor (mellan 927 och 3163 μm). ( C ) Maximal inTäthetsprojektioner av representativa 3D-konfokala staplar av plasmamembranmarkören NPSN12-YFP i laterala rötter, förvärvade vid varandra följande tidspunkter över 72 timmar. Skalstänger = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : Imagingkammare kan anpassas för andra växtorgan. ( A - C ) Bildkammaranpassning för primära rötter. ( A ) Schematisk av bildkammardesign. Detta är identiskt med standarddesignen ( Figur 1 ) förutom två modifieringar: MS-mediumplattan innehåller 0,8% agar istället för 1,5% agar och en cellulosafilm (röd) placeras mellan agar och växt för att förhindra tillväxtIn i agar. ( B ) XY (topp) och XZ (botten) maximala intensitetsprojektioner av representativa 3D-konfokala staplar av plasmamembranmarkören NPSN12-YFP i den primära roten av ett 7 dag gammalt plantor avbildat vid 0 h och 48 h i en konventionell bildbehandling kammare. Observera att roten växer in i agar på grund av sitt gravitropa svar. ( C ) XY (topp) och XZ (botten) maximala intensitetsprojektioner av representativa 3D-konfokala staplar av plasmamembranmarkören NPSN12-YFP i den primära roten av ett sju dagar gammalt plantor avbildat vid 0 h och 48 h i avbildningen Kammare med cellulosafilm. Före appliceringen steriliserades cellulosafilmen i 80% etanol och blöts i flytande ½ MS-medium. Observera att gravitropisk tillväxt av roten i agar förhindras. ( D - F ) Bildkammaranpassning för hypokotyler. ( D ) Schematisk visar hypokotyl bildkammar design. En poly (dimetylsiloxan) gummitätning (grå) är tillverkadRött på en hålighet mellan två glasremsor (gul). En platta på 1,5% agar med jämn tjocklek (beige) placeras på glidbanan, som delvis når in i håligheten. Kammaren är fylld med PFD (blå). Fröplantor placeras på agarplattan så att hypokotyl upptar den nedåtgående sluttningen av agarplattan i kaviteten medan rotan är placerad den horisontella delen av agar. Kammaren är stängd med täckglas. ( E ) Maximalintensitetsprognoser av representativa 3D-konfokala staplar av plasmamembranmarkören NPSN12-YFP i en hypokotyl av ett två dagar gammalt plantor som avbildades över 48 timmar vid varandra följande tidpunkter. ( F ) longitudinell tillväxt i två på varandra följande tidsintervaller av enskilda celler längs den basala till apikala axeln (relativa positioner vid 0 h längs axeln visad i E) hos hypokotylen som visas i ( E ). Notera den tidigare beskrivna våg av tillväxt som migrerar upp hypokotylen 16 . Skalstänger = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Film 1: Vänligen klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 2: Vänligen klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 3: Vänligen cSlick här för att ladda ner den här filmen.
Discussion
Metoden som presenteras här är en enkel strategi för högupplösande konfokalavbildning av utvecklande laterala rötter i två och upp till tre dagar. Under perioder upp till 48 timmar observerades inga negativa effekter av bildsystemet på sidodelutveckling. Efter 48 timmar började den genomsnittliga laterala rottillväxten sakta ner, även om en väsentlig delmängd av rötterna (37%) fortsatte att växa till priser som var jämförbara med genomsnittlig rottillväxt på plattor. Därför, genom bildbehandling ett tillräckligt stort antal rötter, kan rötter vars tillväxt sjunker efter 48 timmar uteslutas. Systematiska tester av bildkammare utfördes inte under perioder längre än 72 timmar, men alternativa strategier rekommenderas om förlängda avbildningsperioder önskas. Imagingkammare kan vara kvar på mikroskopsteget kontinuerligt, om lämpliga miljöförhållanden tillhandahålls eller avlägsnas till en tillväxtanläggning och periodiskt återföres till mikroskopet. Detta gör att många kamrar kan avbildas parallellt. </ P>
En fördel med kamrarna som beskrivs här är att laterala rötter är fixerade i sin position och kan avbildas med användning av högupplösta vattendämpande linser. Den rumsliga stabiliteten beror kritiskt på agarkoncentrationen som används i den bärande agarplattan. Inledningsvis testades en rad olika koncentrationer från 0,8% agar till 2% agar, vilket visade att höga koncentrationer i detta område stabilt fixerade rötter i rymden, men rotväxten avtog snabbare och vissa rötter uppvisade tecken på mekanisk stress, inklusive minskad cellförlängning. Däremot gav låga agarkoncentrationer inte det nödvändiga stödet och rötterna drev i x, y och z under avbildningen. Den optimala 1,5% agarplattan fixar provets position utan negativa mekaniska effekter. Under dessa förhållanden, efter avveckling under de första 30 minuterna, är rötterna stabila under många timmar, vilket möjliggör överföring av data över natten. Under förvärv av 4D-data var z-stackintervall typiskt bRacketed med ytterligare 5-10 μm men detta var huvudsakligen för att rymma out-of-plane tillväxt av laterala rötter snarare än z-drift eller wobble. Även om standard agarkoncentrationen ger viss resistans mot penetration, kommer gravitropiskt växande rötter så småningom att tränga in i agar. Genom en mindre modifiering av bildkammaren kunde dock rotväxten hållas parallellt med täckglaset, vilket möjliggör avbildning av äldre laterala rötter och primära rötter. Vidare kan den grundläggande bildkammaren lätt anpassas för hypokotyler. Hypokotyler är mer fritt flytande i detta system så att z-axelhållaren för bildupptagning ökades vanligtvis till ca 20 μm. I denna studie användes ett upprätt mikroskop överallt vilket medgav att substrategenskaperna kunde kontrolleras. Bildkammaren kan vara anpassningsbar till inverterade mikroskopkonfigurationer men det tidsberoende inflytandet av den styva täckglaset på avlyssningsorganen måste utvärderas. Littlejohn och kollegor har påpekat att PFD själv inte lätt löser upp biologiska molekyler, vilket innebär att den inte kan användas direkt för leverans av farmakologiska föreningar 7 . Detta problem övervinndes genom att tillhandahålla sådana föreningar genom plattan av stelnat tillväxtmedium på vilket agarplattan vilar. Medan perfusionssystemen kommer att förbli det val som föredras för uttömningsförsök har bildkammaren använts framgångsrikt för administrering av dexametason 12 och andra föreningar. En anteckning, medan denna artikel var under utarbetande, beskriver Wagenheim och kollegor 18 en kammare för bildbehandling av lateral rotutveckling med hjälp av ljusmikroskopi.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Prof. Geoffrey Wasteneys, University of British Columbia, för fröuttryck RFP-TUB6 och en anonym granskare för användbara korrigeringar. Vi är tacksamma för professor Hugh Dickinson för att varna oss för användningen av cellulosafilm som ett mekaniskt stöd och till John Baker för fotografering. Detta arbete stöddes av BBSRC forskningsbidrag BB / G013993 / 1 och BB / D004055 / 1 till IM, och en BBSRC doktorandutbildning och Clarendon Scholarship till CK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK | FLUTEC PP6 | |
| Poly(dimethylsiloxane) gum | Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA | Item # 132700 | Carolina Observation Gel |
| Cavity Microscope Slides | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 10118-600 | Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 604753 | Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice |
| Cellulosic cellophane membrane | AA Packaging Limited, Preston, UK | 325P cellulose film; 80 mm disc |
References
- Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods. Plant Meth. 11, 22 (2015).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression. Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).
- Baranenko, V., et al. Solubility of oxygen and carbon dioxide in water. Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).
- Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy. Plos One. 6, (2011).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).
- Littlejohn, G. R., Love, J. A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium. J Vis Exp. , (2012).
- Littlejohn, G. R., et al. An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology. Front Plant Sci. 5, 140 (2014).
- Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons. Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).
- Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues. Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).
- Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes. J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).
- Kirchhelle, C., et al. The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis. Dev Cell. 36, 386-400 (2016).
- Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).
- Geldner, N., et al. Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set. Plant J. 59, 169-178 (2009).
- Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis. Nat Commun. 2, 430 (2011).
- Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).
- Gendreau, E., et al. Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).
- von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel. J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).
