Summary
שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת.
Abstract
ישנן שיטות רבות מפותחות לטיהור ולומד חלבונים ופפטידים יחידים. עם זאת, רוב הפונקציות הסלולר מבוצעות על ידי רשתות של קומפלקסי חלבוני אינטראקציה, אשר לעתים קשה לחקור, כי הכבילה אינה ניתן קוולנטיים ומודאג בקלות על ידי טכניקות טיהור. עבודה זו מתארת שיטה של ייצוב ומפריד קומפלקסים חלבונים ילידי מרקמות ללא שינוי באמצעות ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו מימדי. lysate רקמות נטען על ג'ל polyacrylamide כחול שאינם ילידי-denaturing, אז זרם חשמלי מוחל עד חלבון נודד מרחק קצר לתוך הג'ל. רצועת ג'ל המכיל חלבון שמועבר הוא נכרת אז וטופחו עם אמין-reactive-הצלב המקשר dithiobis ריאגנט (propionate succinimidyl), אשר קוולנטית מייצב קומפלקסים חלבונים. רצועת ג'ל המכיל מתחמי צולבים אז הוא יצוק לתוך ג'ל polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן, ו tהוא מורכב הם מופרדים לחלוטין. השיטה נשענת על טכניקות וחומרים המוכרים לרוב הביולוגים המולקולריים, כלומר היא זולה וקלה ללמוד. אמנם היא מוגבלת ביכולת שלה להפריד בין מכלולים גדולים מאוד, ולא הצליחה באופן אוניברסלי, אבל השיטה היתה מסוגלת ללכוד מגוון רחב של קומפלקסים שנלמדו היטב, וישימה ככל הנראה למערכות רבות של עניין.
Introduction
פונקציה סלולרית רגילה תלויה אינטראקציות חלבון-חלבון 1, 2. כתוצאה מכך, מחל אנושיות מסומנות לעתים קרובות על ידי הפרעות באסיפה וההתנהגות של קומפלקסי חלבונים שונים 3. היכולת לאפיין אינטראקציות כזה ולכן הוא קריטי. נוכחי אמצעי לגילוי אינטראקציות אלה דורשים טיהור של חלבונים היעד, לעתים קרובות ואחריו הנפתח של השותפים באינטראקציה שלהם. טיהור קונבנציונלית מושג על ידי צנטריפוגה הפרש, משקעים, ו / או כרומטוגרפיה 4. שיטות אלה הן זמן רב, יש לשנותו לכל חלבון מטרה, ולעתים קרובות לגרום תשואות נמוכות. שיטות לטיהור מודרניות לערב את ההיתוך של תגי פפטיד למקד חלבונים, ואחריו immunoprecipitation או חילוץ על עמודות עמוסות חרוזים מאוגדים מולקולה לכידה 5,"> 6. אמנם זה להרחבה לחלבונים רבים, זה דורש שינוי רצף של היעד, וכתוצאה מכך לגרום מבנים שונים בזיקת השותפים המחייבים הרגיל שלהם. האופי העדין של כמה אינטראקציות חלבון-חלבון אומר ששיטה זו לא יכולה להיות רלוונטית לתרחישים רבים. בנוסף, מבחני הנפתח משמשים למיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא יכולים ללכוד תמונת הסלולר מדויקת, בשל מעלות מוגבלות של חופש ורמות שאינם ילידים של חלבון הפיתיון.
באופן אידיאלי, מתחמי החלבון ניתן היה לזהות מדינות האם שלהם, ללא צורך טיהור או הנפתח. ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידי כחול (BN-עמוד) פותחה כחלופה פחות-denaturing כדי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE), ומאפשר הפרדה של כמה חלבונים מתחמי מ דגימות ביולוגיות 7. עם זאת, חלבונים ב-עמוד BN להפריד מבוסס על לארGE מספר משתנים, כולל גודל, מטען, תלת ממדי המבנה, והקשר עם מולקולות אחרות. האינטראקציות של הגורמים הללו לעתים לגרום שיתוף הפרדת חלבונים, היווצרות המצרפי, ורזולוצית להקת חלבון ירודה. דו ממדי ילידים-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה פותרת חלק, אך לא כולם, של בעיות אלו 8.
כדי לעקוף את הסיבוכים הקשורים הפרדה מקומית, חלק מחברים להשתמש ריאגנטים אמינים-reactive cross-linking, כגון dithiobis (propionate succinimidyl) (DSP), כדי ללכוד קומפלקסי חלבוני lysates רקמות 4. lysates מטופלים אלה לאחר מכן ניתן מפוגל מופרד SDS-PAGE, תוך שמירה על הגודל ואיפור יליד מתחמי חלבון. עם זאת, מאז ריאגנטים cross-linking מגיב מבוססים על קרבה של מולקולה אחת לאחרת, וחלבונים ב lysates רקמות יש דרגות חופש רבות ויכולים stochastically אינטראקציה, צלב רקע ספציפי-linking יכול להיות גבוה, במיוחד דגימות מרוכזות. זה יכול להוביל לתוצאות קשות לפרש.
הנה, אנחנו מדגימים את השימוש בשיטה היברידית BN-עמוד / SDS-PAGE, כינה ג'ל אלקטרופורזה multimer-polyacrylamide (multimer-עמוד), להפריד ולהבחין מכלולים החלבון תערובות מורכבות. בתחילה, lysate התא מושעה ב ג'ל polyacrylamide באמצעות BN-עמוד. הג'ל המכילים lysate אז הוא הגיב עם DSP ריאגנט cross-linking. Pseudo-משותק ואינו מופרד מעט על ג'ל, חלבונים הם הרבה פחות סביר להגיב nonspecifically, כלומר תגובתיות רקע צולב מקשר מצטמצמות. לאחר cross-linking, להקות ג'ל הם נכרתו ומופרדים באמצעות SDS-PAGE. הג'ל כתוצאה מכן ניתן לנתח בכל אמצעי הקשורות בדרך כלל ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide. שיטה זו מאפשרת הפרדה וזיהוי של קומפלקסים חלבונים ילידים lysate רקמות ללא שינוי, ללא צורך טיהור נוסף או למשוך-דאוn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. רקמות הכנה
- הכן 10 מ"ל של 4x חיץ מדגם BN-עמוד (200 מ"מ Bis (2-hydroxyethyl) אמינו-טריס (hydroxymethyl) מתאן (BIS-טריס), 200 מ"מ NaCl, 40% w / גליצרול נ, 0.004% Ponceau S, pH 7.2 ).
הערה: פתרון מניות זה עשוי להתבצע מראש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. - לדלל 250 μL של חיץ מדגם 4x ב 750 μL DH 2 O המכילים מעכבי פרוטאז קוקטייל מסחרי 1x. וורטקס ומקררים על קרח.
- Homogenize 20 מ"ג של רקמת היעד מ"ל 1x 1 קרים כקרח חיץ מדגם BN-עמוד עם 30 משיכות של homogenizer dounce נקי.
הערה: לצורך ניסוי הפגנה זו, רקמת היעד היא רקמת מוח עכברוש כולו. לאחר הומוגניזציה, דגימות ניתן לטפל עם כזה חומר ניקוי עדין כמו 2% digitonin כדי solubilize ולהתיר אלקטרופורזה של חלבונים בממברנה. - מעביר את homogenate אל צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge, צנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 30 דקות עד גלולת תוכן סלולארי מסיס. Afteצנטריפוגה r, למזוג supernatant לתוך צינור נקי על קרח.
- פעל בהתאם להוראות היצרן כדי למדוד ריכוז חלבון supernatant באמצעות חומצה bicinchoninic (BCA) או assay quantitation חלבון דומה.
- אם המדגם homogenate (ים) מכילים חומר ניקוי, להוסיף כמות 5% Coomassie כחול G-250 בתמיסה מימית מספיק כדי להביא את הפתרון homogenate ל 0.25% Coomassie.
2. BN-עמוד
- לדלל 25 מ"ל 20x ילידי כחול (BN) אלקטרופורזה למלאי (1.0 M Bis-טריס, 1.0 M tricine, pH 6.8) לתוך 475 מ"ל DH 2 O המכיל 0.002% Coomassie כחול לעשות 500 מ"ל של חיץ ריצה 1x.
- אם דגימות מכילים חומר ניקוי, במקום לעשות 250 מ"ל של חיץ ריצה 1x המכיל 0.02% Coomassie ועוד 250 מ"ל המכיל אף.
- חיץ צ'יל (ים) 4 ° C.
- נקה ולהרכיב ג'ל polyacrylamide לשפוך קלטת בהתאם להוראות היצרן.
- לאחר ג'לים יש polymerized, יש לשטוף את הקלטת עם DH 2 O ולהרכיב מנגנון אלקטרופורזה על פי הוראות היצרן.
- הסר את המסרק היטב ולמלא את הבארות עם 1x חיץ ריצת BN-עמוד. הימנע מילוי החדר הפנימי כולו עם חיץ עד דגימות נטענות.
- אם דגימות מכילות חומר ניקוי, למלא את הבארות עם המאגר המכיל 0.02% Coomassie כחולים.
הערה: בצע שלבים 2.7-2.9 ב 4 מעלות צלזיוס.
- אם דגימות מכילות חומר ניקוי, למלא את הבארות עם המאגר המכיל 0.02% Coomassie כחולים.
- בעזרת טיפים ג'ל טעינה, פיפטה בנפח של homogenate המכיל 20 מיקרוגרם של חלבון לתוך הבארות הרצויות. פיפטה בהיקף שווה ערך של חיץ מדגם BN-עמוד 1x לתוך כל בארות בשימוש.
הערה: השתמש ריכוז החלבון נקבע מן assay BCA לחשב נפח מתאים של homogenate להוסיףהבארות. - לאחר דגימות נטענות, למלא את התא הפנימי עם חיץ ריצת BN-עמוד 1x. הקפד הג'ל הוא שקוע לגמרי במאגר. הבא, למלא את החדר החיצוני עם חיץ ריצת 1x לרמה שצוינה על ידי היצרן.
- אם דגימות מכילים חומר ניקוי, למלא את התא הפנימי עם חיץ 1x המכיל 0.02% Coomassie כחול, ואת החדר החיצוני עם חיץ ריצה 1x צבע ללא.
- חברו את האלקטרודות על אספקת החשמל, וכן electrophorese החלבונים הג'ל על 150 V עד הלהקה צבע מתקדמת ~ 2 ס"מ לתוך שכבת לפתרון. עצור לנתק את אספקת החשמל.
3. cross-linking
הערה: בצע שלבים 3.1-3.6 ב 4 מעלות צלזיוס.
- לפרק את מנגנון אלקטרופורזה, ולהפריד את שמשות הזכוכית של קלטת ג'ל. סר וזורק את שכבת הערמה.
- בזהירות לחתוך את הג'ל ממש מתחת לקצה התחתון של חזית צבע. לקחתאכפת לעשות חתך זה כמו חלק וישר ככל האפשר, ולאחר מכן למחוק את החתיכה בשימוש של ג'ל. זה ישאיר ~ 2 ס"מ רוחב, רצועה אופקית של ג'ל polyacrylamide, אשר יכיל את כל החלבון במדגם homogenate.
- חתוך משם שום חלקים בשימוש לאורך הקצוות של רצועת ג'ל.
- בזהירות במקום רצועת לתוך בופר פוספט 10 מ"ל (PBS) במיכל קטן, ומערבבים בעדינות ידי nutation למשך 30 דקות כדי לאזן.
- לאחר איזון, להשליך ולהחליף את PBS עם 10 אחר מ"ל. פיפטה 500 μL של 25 מ"מ DSP מומס sulfoxide דימתיל לתוך PBS, וממשיכים לערבב כמו לעיל (שלב 3.4) למשך 30 דקות.
- יוצקים את פתרון DSP. להוסיף 10 מ"ל של 0.375 M טריס (hydroxymethyl) הידרוכלוריד aminomethane (Tris-HCl), pH 8.8, המכיל סולפט dodecyl 2% נתרן (SDS) כדי להרוות את DSP unreacted. המשך nutation עבור 15 דקות.
4. SDS-PAGE
- בעוד רצועת הג'ל מרווה, להכין SDS-PAפתרונות ג'ל GE פי שיטות סטנדרטיות 9. אל תוסיף ריאגנטים פילמור.
- לאחר המרווה, להחזיר את רצועת ג'ל ΒΝ לטמפרטורת חדר, והטיל את הרצועה לתוך קלטת ג'ל חדשה.
- לשם כך, בזהירות להרים את ג'ל ולמקם אותו לצלחת spacer קלטת ג'ל נקיה.
- אוריינט הרצועה כך התחתון של חזית הצבע הוא קרוב ביותר אל גבי קלטת חדשה (כלומר, בצד כי נסע רחוקה במהלך-העמוד BN יש קרוב העליון של הקלטת החדשה; רצועת ג'ל יש התהפכה מ שלה לפני נטייה). ראה איור 3.
- מניח את הרצועה כך הקצה העליון שלה טמון גם עם שם בקצה העליון של הצלחת לכסות יהיה (כלומר, זה יהיה בראש של ג'ל החדש). ודא מול צבע מקביל הקצוות האופקיים של צלחת זכוכית.
- Push צד אחד של הרצועה ניכרה נגד אחד קירות spacer, ומשאיר מקום על tהוא הצד השני של ג'ל יימזג ורמת חלבון או סולם כדי לטעון.
- אם הקצה התחתון של רצועת ג'ל המכיל כל אזורים משוננים או לא אחידים, בזהירות לחתוך אותם. אם הווה, הם יהיו בועות מלכודות במהלך ג'ל לשפוך.
- לאחר ברצועת ג'ל ממוקמת כראוי, להניח את הצלחת לכסות על צלחת spacer. להפעיל לחץ עדין כדי לדחוף את כל בועות אוויר שנלכדו.
- המשך להרכיב מנגנון מזיגת ג'ל על פי הוראות היצרן.
- הוספת ריאגנטים פילמור למאגר ג'ל לפתרון, ושופכים אותו לתוך קלטת ג'ל מוכן, בעזרת פיפטה סרולוגיות. מלא את קלטת ג'ל אל ~ 2 סנטימטרים מתחת לרצועת ג'ל BN-עמוד הניכר, כדי להשאיר מקום לשכבת הערמה.
- הוספת 100 μL butanol מעל הג'ל נשפך, ולאפשר 30 דקות עבור פילמור של השכבה לפתרון. יוצקים את butanol.
- הוספת ריאגנטים פילמור לפתרון ג'ל הערמה. באמצעות serologפיפטה iCal, שופכים את השכבה בערימה כדי למלא את כל החלל הריק שנותר קלטת ג'ל.
- הטה את קלטת ג'ל כשכבת הערמה היא שפכה כדי שימלא את החלל מתחת לרצועת ג'ל, ובועות אוויר לא לכודים.
- ככל החיץ לערום ג'ל הממלא את חלל הריק מתחת לרצועת ג'ל, בהדרגה להחזיר את קלטת ג'ל אל בסיס רמה.
- המשך למלא את החלל הריק ליד רצועת ג'ל נכרת עם חיץ ג'ל הערמה, עד שהוא כמעט גולש.
- אפשר שכבת לערום לפלמר עבור 30 דקות.
הערה: הפוך חיץ ריצה 10x SDS-PAGE (250 מ"מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס), 1.9 מ 'גליצין, 1% SDS) בעוד ג'ל הוא polymerizing. זה יכול להיות גם מראש ולאחסן בטמפרטורת החדר. - לדלל 50 מ"ל 10X SDS-PAGE ריצה חיץ המניות לתוך 450 מ"ל DH 2 O לעשות חיץ עובד 1x.
- אחרי שכבת הערמה יש polymerized, להסיר את קלטת ג'ל מן לשפוךהמנגנון, לשטוף עם DH 2 O, ולהרכיב מנגנון אלקטרופורזה על פי הוראות היצרן.
- ממלא את החדר הפנימי לגמרי עם חיץ ריצת SDS-PAGE 1x, ולאחר מכן למלא את החדר החיצוני לרמה שצוינה על ידי היצרן.
- טענתי את החלל הבא לרצועת ג'ל נכרתה עם סולם משקל מולקולרי או תקן חלבון מתאים.
- צרף אלקטרודות אספקת החשמל, וכן electrophorese דגימות ב 120 V. כאשר הצבע Coomassie בורח הג'ל, להפסיק ולנתק את אספקת החשמל.
- נתח את הג'ל באמצעות שיטות סטנדרטיות של electroblotting וזיהוי חלבונים על ידי נוגדן מחייב 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסוי זה הפגנה, multimer-PAGE בוצע על lysate מוח שלם חולדה. החלבונים שהופרדו כתוצאה מכך היו מסוממים על ממברנות polyvinylidene diflouride (PVDF), ולאחר מכן לחקור עם נוגדנים נגד חלבונים הידועים כדי ליצור קומפלקסים. איור 1 מציג אימות של הפרוטוקול בשני אמצעים. ראשית, אנו מדגימים כי חלבונים צולבים הם מחוספס על ידי תוספת של סוכן הפחתת, כלומר גבוה יותר משקל המולקולרי משקל מיוצרים נוצרות על ידי מגיב חוצה מקשר, ולא בשל כל רכיב אחר של הפרוטוקול ( איור 1 א ) . שנית, אנו מראים כי הצלב המקשר הוא רגיש לתוספת של חומרי ניקוי ( איור 1 ב ), כלומר הצלב לחצות הוא ספציפי חלבונים מורכבים וכי תגובתיות אקראית בשל קרבה על הג'ל ממוזער. איור 2 מראה כי השיטה נכשלת ללכוד respיש תחולה רחבה iratory מורכב השנייה, אבל חוץ מזה ללכידת שני מתחמי מסיסי קרום נכנס.
איור 1: אימות של שיטת multimer-עמוד. (א) Capture של קומפלקסי חלבונים על ידי ג'ל cross-linking עם DSP רגיש מחשוף ידי dithiothretol (DTT). Multimer-עמוד בוצע על lysate שלם חולדה המוח בלי (A1) או עם (A2) 5 מ"מ dithiothretol נכלל הפתרון מרווה טריס / SDS. הג'ל היה electroblotted על ממברנות PVDF, ולאחר מכן נחקר עבור שרשרת kinesin כבד. להקת משקל מולקולרית גבוהה הוא ציין משני ממברנות, מתאימה סביר לכל או חלק מקומפלקס חלבון מנוע kinesin. ישנה להקה נוספת המתרחשת 126 kDa על כתם DTT שטופלו, המסה המולקולרית של הפפטיד שרשרת כבדה kinesin. Dithiothreitol הוא סוכן צמצום, והוא מסוגל להפוך CROSS-linking ידי ביקוע בהווה אג"ח דיסולפיד ב DSP. מצרף kinesin ולכן רגיש מחשוף ידי DTT. (ב) חלבון ללכוד מורכבת רגישה תוספת של denaturing דטרגנטים. Multimer-עמוד בוצע על lysate המוח עכברוש כולו כמתואר בטקסט, למעט כמויות גדלות והולכות (0 עד 2%) של SDS (משמאל) או טריטון X-100 (מימין) נוספו דגימות lysate, ולאחר מכן וטופחו על הקרח עבור 30 דקות לפני טעינת ג'ל הראשון. הג'לים הסופי היו מחק על ממברנות PVDF, ומישש עבור-synuclein α. לפחות שלוש להקות של משקל מולקולרי הגדלת נצפות, המתאים אלפא-synuclein מונומר, tetramer, ו octamer, בהתאמה. עוצמות האות של להקות oligomeric להקטין עם ריכוז חומר ניקוי הגדלה, המציין כי cross-linking יעילות תלוי של קונפורמציה בחלבון ילידים. אנא לחץ כאן כדי VIEW גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הפגנה של לכידתו של קומפלקסים חלבונים באמצעות-עמוד multimer. (א) מסיסים ומכלולי חלבון קרום נכנס נתפסו מ- (A) lysate שלם חולדת המוח או (ב) lysate וטופח עם 2% digitonin עבור 1 ש 'ב 4 ° C, על ידי ביצוע-עמוד multimer כמתואר בטקסט. הג'לים אז היו מחקו ואת ממברנות PVDF תרו אחרות מרכיבי מתחמים שונים. מיני משקל מולקולריים גבוהים הם נצפו על קרום תרה אחר טובולין acetylated, אשר ידוע לייצב microtubules. Dynein ו kinesin הם קומפלקסי חלבוני מנוע רב למקטע עם משקולות מולקולריות של 1.5 מד"א 380 kDa, בהתאמה. ממברנות תמחינה עבור רכיבים של מתחמים אלה מראים גבוהים מולקולרי משקל מינים. בנוסף, multimer-עמוד בהצלחה ג aptured דימר Hsp90. אלפא-Synuclein טפסי tetramers ו octamers, כמו גם oligomers משקל גבוה מולקולרי הנוירו. Octamer ו פס של מינים-משקל גבוה נתפסים על הקרום המוספג. dimerization VDAC הוא ציין גם. מיני משקל מולקולריים גבוהים מזוהים על ממברנות תמחינה עבור רכיבים של מתחמי המיטוכונדריה I ו- IV. עם זאת, את הממברנה תמחה על SDHA, חבר המורכבים השני, אבל זה לא מוכיחה שום להקת משקל גבוהה מולקולרית מתאימה. AcetTUB: acetylated טובולין α; βTUB: β טובולין; Dynein: שרשרת כבדה dynein; Hsp90: חלבון הלם חום 90; Kinesin: kinesin שרשרת כבדה; NDUFS3: מרכז גופרית-ברזל 3 של קומפלקס המיטוכונדריה לי; VDAC: Porin; SDHA: דהידרוגנז succinate של קומפלקס המיטוכונדריה השנייה; COXIV: מונואמין C ציטוכרום של IV מורכב המיטוכונדריה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
s = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> 
איור 3: תרשים זרימה multimer-עמוד הכללי. (א) הכן lysate רקמות בשיטות הלא denaturing, כגון שמאחד במאגר מדגם BN-עמוד. (ב) lysate פיפטה לתוך הג'ל BN-עמוד, ולאחר מכן לבצע אלקטרופורזה (150 וולט) במאגר ריצה BN-עמוד. אפשר מדגם להעביר עד לחזית צבע העביר ~ 2 ס"מ לתוך הג'ל לפתרון. (ג) הסר את שכבת גדישה חלק יחסי של השכבה לפתרון. (ד) לצלול ברצועת ג'ל ב- PBS, לאזן עם רעד במשך 30 דקות. (E) הסר את PBS, ו מחדש להטביע את רצועת ג'ל PBS המכיל 2.5 מ"מ DSP. Shake עבור 30 דקות. (F) הסר פתרון DSP, ואז שוב להטביע את רצועת ג'ל 375 מ"מ טריס המכיל 2% SDS, ולנער עבור 30 דקות. מתחמים נוכחיים ברצועת ג'ל מיוצבים עכשיו על ידי קורהים-linking. (G) סובב את ג'ל להתפשט 180 ° ומטילים לתוך ג'ל SDS-PAGE החדש. כלול גם ערמה ופתרון שכבות. (H) לפתור מדגם ידי אלקטרופורזה (120 וולט). (I) סר רצועה ג'ל ושכבת ערמה, ולאחר מכן לנתח לפתרון שכבה לפי צורך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אינטראקציות חלבון-חלבון חשובות עבור כל משימת חי דברים לפועל. מסיבה זו, הם מושא לביקורת ומחקר אינטנסיבי. Multimer-עמוד הוא שיטה חדשנית עבור לכידה, מפריד, וניתוח מגוון רחב של קומפלקסי חלבונים. הוכחנו ישימותה בעבר לומד oligimerization של 11-synuclein α חלבון הקשורים למחלות. עם זאת, היא ניתנת להרחבה ל קומפלקסי חלבונים רבים, כפי שמודגם באיור 2. בהשוואה לשיטות אחרות של לימוד קומפלקסי חלבונים,-עמוד multimer הוא יתרון בגלל הפשטות הקוצרת שלה. שעת ממדגם רקמות כדי להפריד באופן מלא ג'ל SDS הוא כ 8 שעות. מאז הגילוי יכול להיעשות על ידי כתם מערבי טיפוסי, הפרוטוקול יכול להתבצע על lysate רקמות ללא שינוי, עם מגבלות זיהוי נמוכות בהרבה מאלה המשויכים לניסויים נפתחים. בנוסף, רוב labo ביולוגיה מולקולרית מאובזרratories תוכל לבצע את הטכניקה עם השקעה מראש מעט. כפי שנידון מאוחר, רוב האתגר קשור-עמוד multimer מגיע עם פתרון בעיות ואופטימיזציה השיטה עבור כל חלבון מורכב למדו.
בעוד-עמוד multimer צריך להיות נגיש את רוב הביולוגים המולקולריים, והצלחתו תלויה מיומנות וניסיון של החוקר. אנושות, חיתוך מחדש הליהוק של רצועת ג'ל BN לתוך ג'ל SDS החדש חייב להיעשות בזהירות. חשוב לכוון את רצועת ג'ל אלקטרופורזה כך גורמת חלבונים להגר לתוך ג'ל SDS להקות במקביל. אם רצועת ג'ל מלוהקת עקומה, להקות החלבון תעבורנה לתוך אחד אחרת נתונים יאבדו. במיוחד עבור קומפלקסים גדולים, מסתובבת רצועת ג'ל לפני שמשליכים אותו לתוך ג'ל SDS-PAGE חשוב דומה. זה נותן מתחמים גדולים, אשר עשויים שלא הגרו מאוד רחוק לתוך הג'ל BN-העמוד, יותר זמן להיות מורמים אל תוך Laye לפתרוןr של ג'ל SDS-PAGE. חשוב לציין, השינויים בגודל חלבון ומאפיינים פיזיים שנגרמו על ידי cross-linking צריך גם לקחת בחשבון בעת ניתוח. לדוגמא, כמה חלבונים בעלי משקל מולקולריים נמוכים, כגון-synuclein α, אינם נשמרים היטב על ממברנות PVDF, אבל oligomers הצולב שלהם הם 12. זה יכול לבלבל ניתוח השוואתי, וחייב להילקח בחשבון.
כאשר מפרידים קומפלקס ידי-עמוד multimer בפעם הראשונה, חשוב לאמת את השיטה. אנו מציעים שלוש בדיקות אימות / פתרון בעיות. ראשית, להבטיח כי פפטיד של עניין נודד לתוך הג'ל BN-ידי ביצוע הפרוטוקול-עמוד multimer עד כריתה של רצועת ג'ל, ואז להפסיק, למחוק את הרצועה גבי קרום PVDF, וכן לחקור עבור למקטע של עניין. אם אין אות, המתחם סביר לא נודד לתוך הג'ל BN, ולכן היא צריכה להתבצע נקבובית יותר, או המדגם צריך להיות מותר להעביר הלאה לתוך resolvהשכבה. נוכחות של אות מאשרת כי לפחות יחידת משנה unbound היגרו לתוך הג'ל. בשלב זה, יהיה קשה לאשר את נוכחותו של מכלול מלא. אם ראיות של יחידת משנה מזוהה ברצועת ג'ל BN, לעבור למבחן השני. בצע multimer-PAGE ללא צעד הצלב, ולאחר מכן כתם על קרום PVDF בדיקה של יחידת משנה. יחידת משנה צריך להכחיש בנוכחות SDS ולהעביר בדרך כלל לתוך SDS ג'ל. אם זה לא קורה, יש כנראה בעיה עם הטכניקה של החוקר. רצועת הג'ל של BN עשויה להיות חתוכה בצורה גרועה, משאירה קצת חלבון מאחור, או שהג'ל SDS עשוי להפיל בצורה לא נכונה. לבסוף, לבצע multimer-PAGE עם שלב הצלב מחברים מקשר לשלב, ואז כתם בדיקה, כפי שפורט באיור 1 . זה מאשש צבירה של המתחם נובע תוספת של DSP, ולא תוצאה בלתי צפויה של חלק אחר של פרוטוקול multimer-PAGE. המחשוף צריך לגרום לצמצוםלהקת ד-עוצמת המצרפי ולהקה מונומר למקטע מוגבר בעצמה על הדמיה. אם אין להקה המצרפי ניבטה אלינו multimer-עמוד רגיל, אבל עליות הלהקה מונומר בעצמה כאשר DSP הוא בקע, המתחם הפך אותו צפוי הג'ל SDS, אבל נכשל בהעברה לתוך השכבה לפתרון.
במצב הנוכחי,-עמוד multimer ישים קומפלקסי חלבונים רבים, אבל הוא לא פרוטוקול מידה אחת מתאים לכולם. זה סביר צריך להיות שונה עבור כל מורכבות העניין. בעיה נפוצה אחת מודגם באיור 2: מתחמים שנתפסו הם לעתים קרובות כל כך גדולים שהם בקושי להעביר על-עמוד SDS. זה עשוי להיות מנוהל על ידי שינוי הנקבובי של ג'ל SDS או ביצוע אלקטרופורזה לתקופות זמן ארוכים יותר. סיבוך נוסף הוא הנוכחות המזדמנת של יותר משתי להקות על ג'ל. תגובת Incomplete עם המקשר הצולב יכולה לגרום לחלוקת להקות משקל מולקולריות ביניים 13. זה יכול לעשות את זה DIFficult כדי לקבוע אם להקות מרובות מייצגות ביניים oligomeric חשובים מבחינה פיזיולוגית, או פשוט השלכות בלתי צפויות של cross-linking חלקית. עבור חלבונים בממברנה שחייב solubilized לפני הניתוח, חשוב גם לקחת בחשבון את ההשפעה כי הבחירה של חומר ניקוי יש על ההתנהגויות של קומפלקסי חלבונים. חומר הניקוי כדי solubilize חלבונים בממברנה משפיע התצורות שלהם, עמותות עם שותפים מחייבים, ופונקציות 14, 15. בחירת דטרגנט גם משפיעה על היעילות של cross-linking 16. לפיכך, סביר להניח כי תנאי solubilizing האידיאליים ישתנו עם המורכבות נלמדות.
Multimer-עמוד נכשל מדי פעם כדי ללכוד קומפלקס, כפי שמוצג על כתם SDHA ב דהידרוגנז איור 2. succinate הוא חלק ממתחם המיטוכונדריה 124 kDa השנייה, שהוא קטן מספיק כי זה צריך לעבור בקלות לתוך הג'ל.זה לא זוהה מציין כי-עמוד multimer לא הצליח ללכוד אותו. מקרים כגון אלה יש הרבה הסברים אפשריים. רוב cross-linking ריאגנטים מכילים שני קצוות תגובתי, המהווים קשרים קוולנטיים עם שרשרות בצד חומצת אמינו. את היעילות שבה קומפלקסי חלבונים לכידים ריאגנטים cross-linking תלויה בנגישות שלהם שאריות תגובתי. במקרה של DSP, cross-linking מושגת על ידי acylation של קבוצות אמינו אליפטיות עיקריות-חשוף ממס משנית, לרוב הקבוצות ε-אמינו ליזין 17. שאריות ליזין נמצאות בדרך כלל על פני החלבון, אבל התפיסה מזדמנת שלהם במרכזי הידרופובי מקטינה את היעילות של cross-linking 13. יחידות המשנה של קומפלקס II קבורות בתוך קרום המיטוכונדריה, ועשויה להישאר נגיש DSP, גם לאחר solubilization עם digitonin 18. גדולים מאוד בצפיפות-אריזת מתחמים, כגון עמילואיד oligomeRS, עלול גם להגביל את הזמינות של שאריות ליזין השטח כדי ריאגנטים cross-linking. כתוצאה מכך, סוגים אלה של מכלולי חלבון עלולים לא להיות תואמים-עמוד multimer. אפשר גם כי Coomassie כחול, אשר נקשר לאזורים הידרופובי ושאריות קטיוני, משתהה לאחר איזון ב PBS וחוסם cross-linking ובמקרים מסוימים 19. זה עשוי להקטין או למנוע גילוי של oligomers מושפע-עמוד multimer. לכן, השיטה אינה assay אוניברסלי עבור המאפיינת את כל האסוציאציות חלבון, ולא צריך להיחשב שבו לכמת ב הרצוי. עם זאת,-עמוד multimer הוא כלי מהיר וזול, יחסית לניתוח מתחמי חלבון, ועשוי להיחשב לצד אמצעים אחרים שהוקמו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
בתמיכת DA034783 NIH / NIDA. אנו מודים בריאן א קילינגר לקבלת סיוע טכני עם-עמוד multimer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
