Summary
Представлен способ стабилизации и отделения нативных белковых комплексов из немодифицированного тканевого лизата с использованием реакционноспособного по аминогруппе белкового сшивающего агента, связанного с новой двухмерной системой электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE).
Abstract
Есть много хорошо разработанных методов для очистки и изучения одиночных белков и пептидов. Тем не менее, большинство клеточных функций осуществляется сетей взаимодействующих белковых комплексов, которые зачастую трудно исследовать, поскольку их связывания не является ковалентной и легко возмущается методами очистки. Эта работа описывает способ стабилизации и разделения нативные белковые комплексы из немодифицированной ткани с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Ткань лизат наносили на неденатурирующем сине-родной полиакриламидном геле, а затем электрический ток подается до тех пор, пока белок мигрирует на короткое расстояние в геле. Полоска геля, содержащая перенесенный белок затем вырезала и инкубировала с дитиобисом аминного реакционноспособным сшивающим реагентов (сукцинимидилпропионат), который ковалентно стабилизирует белковые комплексы. Полосы гель, содержащий поперечно-сшитые комплексы затем отливают в сульфат полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и третон комплексы разделены полностью. Метод основан на методах и материалах, знакомых большинству молекулярных биологов, это означает, что это недорогой и простой в освоении. В то время как он ограничен в своей способности адекватно отделить чрезвычайно крупные комплексы, и не было универсально успешным, метод был в состоянии захватить широкий спектр хорошо изученных комплексов, и, вероятно, применимо ко многим системам, представляющим интерес.
Introduction
Нормальная клеточная функция зависит от белок-белковых взаимодействий , 1, 2. В результате болезнь человека часто отмечается возмущениями в сборке и поведении различных белковых комплексов 3. Способность характеризовать такие взаимодействия Поэтому крайне важно. Современные средства обнаружения этих взаимодействий требует очистки белков-мишеней, часто с последующим раскрывающихся их взаимодействующих партнеров. Обычная очистка осуществляется дифференциальным центрифугированием, осаждением и / или хроматографически 4. Эти методы требуют больших затрат времени, должны быть изменены для каждого белка-мишени, и часто приводят к низким выходам. Современные методы очистки включают слияние пептидных тегов белков - мишеней, а затем с помощью иммунопреципитации или экстракции на колонках с грузом шариков , связанных с молекулой захвата 5,«> 6. Хотя это является расширяемым для многих белков, это требует модификации последовательности мишени, что потенциально приводит к конструкции , которые отличаются по сродству для своих обычных партнеров связывания. Деликатный характер некоторых белок-белковых взаимодействий означает , что этот метод не может быть применят для многих сценариев. Кроме того, выпадающие анализы, используемые для сопоставления белок-белковых взаимодействий может не захватывать точную клеточную картину, из-за ограниченных степеней свободы и неместных уровней белка приманки.
В идеале, белковые комплексы могут быть обнаружены в их родных штатах, без необходимости очистки или тянуть вниз. Синий нативный электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ-БН) была разработана в качестве менее денатурирующего электрофореза альтернативы натрия додецилсульфата в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), а также позволяет для разделения некоторых белков и комплексов из биологических образцов 7. Однако белки в BN-PAGE с отдельной на основе LARGE число переменных, включая размер, заряд, трехмерную структуру, и ассоциации с другими молекулами. Взаимодействие этих факторов часто приводит к совместному разделению белков, образованию агрегатов, и плохого разрешению полосы белка. Двумерный электрофорез нативной полиакриламидном геле устраняет некоторые, но не все из этих проблем 8.
Для того, чтобы обойти осложнения , связанные с нативным разделением, некоторые авторы используют аминные-реактивные сшивающие реагенты, такие как дитиобис (сукцинимидилпропионат) (DSP), чтобы захватить белковые комплексы в лизатах ткани 4. Эти обработанные лизаты могут быть затем денатурируют и разделяют с помощью ДСН-ПААГ, сохраняя при этом родной размер и состав белковых комплексов. Однако, так как поперечно-сшивающие реагенты реагируют на основе близости от одной молекулы к другой, а также белков в лизатах ткани имеет много степеней свободы, и может взаимодействовать стохастический, неспецифический фон крест-linking может быть высоким, особенно в концентрированных образцах. Это может привести к трудным для интерпретации результатов.
Здесь мы демонстрируют использование способа гибридного БН-PAGE / SDS-PAGE, названный мультимера-электрофорез в полиакриламидном геле (мультимер-PAGE), для разделения и обнаружения белковых агрегатов в сложных смесях. Первоначально, клеточный лизат суспендируют в полиакриламидном геле с помощью BN-PAGE. Лизат-содержащий гель затем подвергают взаимодействию с реагентом DSP сшивания. Псевдо-иммобилизованных и слегка разделенные на геле, белки гораздо реже реагируют неспецифически, а это означает фон кросс-линкер реакционная способность снижается. После сшивания, гель полосы вырезают и разделяли с помощью SDS-PAGE. Полученный гель затем могут быть проанализированы с помощью любых средств, обычно связанных с электрофорезом в полиакриламидном геле. Этот метод позволяет для разделения и обнаружения нативных белковых комплексов в лизате немодифицированной ткани, без необходимости дополнительной очистки или PULL-Дауп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка ткани
- Подготовьте 10 мл 4x BN-PAGE буфера для образцов (200 мМ бис (2-гидроксиэтил) амино-трис (гидроксиметил) метан (Bis-Tris), 200 мМ NaCl, 40% вес / объем глицерина, 0,004% Ponceau S, рН 7,2 ).
Примечание: Этот исходный раствор может быть изготовлен заранее и хранили при 4 ° С. - Разбавляют 250 мкл 4х буфера для образца в 750 мкл дН 2 O , содержащей 1x коммерческий коктейль ингибитора протеазы. Vortex и холод на льду.
- Однородные 20 мг ткани-мишени в 1 мл 1x охлажденного льда BN-PAGE образец буфере с 30 ударами чистого Даунсом гомогенизатора.
Примечание: Для этого демонстрационного эксперимента, ткань-мишени цела ткань мозга крысы. После гомогенизации, образцы могут быть обработаны с мягким моющим средством, такими как 2% дигитониной для солюбилизации и разрешить электрофорез мембранных белков. - Передача гомогената в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и центрифуги при 14000 мкг в течение 30 мин для осаждения нерастворимых клеточного содержимого. Afteг центрифугирование, декантируют надосадочную жидкость в чистую пробирку на льду.
- Следуйте инструкции производителя для измерения надосадочной концентрации белка с использованием бицинхониновой кислоты (BCA) или аналогичного анализа белка количественного определения.
- Если образец (ы) гомогената содержит моющее средство, добавить количество 5% кумасся голубой G-250 в водном растворе, достаточном для доведения раствора гомогената до 0,25% кумасся.
2. BN-PAGE
- Развести 25 мл 20x синие родные (BN) электрофорез буфера запас (1,0 М Bis-Tris, 1,0 М трицина, рН 6,8) в 475 мл дНы 2 O , содержащих 0,002% Кумасся синим , чтобы сделать 500 мл 1x подвижным буфер.
- Если образцы содержат моющие средства, вместо того, чтобы сделать 250 мл 1x подвижным буфер, содержащим 0,02% кумасся и еще 250 мл, не содержащих ни одного.
- Холод буфер (ы) до 4 ° С.
- Очистить и собрать полиакриламидного геля разливочный кассету в соответствии с инструкциями производителя.
- После того , как гели полимеризуется, промыть кассету с дН 2 O и собрать устройство электрофореза в соответствии с инструкциями производителя.
- Снимите гребень хорошо и заполнить лунки 1x BN-PAGE проточного буфера. Избегайте заполнения всю внутреннюю камеру с буфером до тех пор , пока будут загружены образцы.
- Если образцы содержат моющее средство, заполняют скважины с буфером, содержащим 0,02% кумасси синим.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 2.7-2.9 при 4 ° С.
- Если образцы содержат моющее средство, заполняют скважины с буфером, содержащим 0,02% кумасси синим.
- С помощью гель-погрузочных советов, пипетки объема гомогенаты, содержащих 20 мкг белка в желаемых скважины. Пипетировать эквивалентный объем 1x BN-PAGE образца буфера в любые неиспользованные лунки.
Примечание: Используйте концентрацию белка определяется из анализа BCA для вычисления соответствующего объема гомогената, чтобы добавить клунки. - После того, как будут загружены образцы, заполнить внутреннюю камеру с 1x БН-ПААГ рабочего буфера. Убедитесь , что гель полностью погружен в буфер. Затем заполнить внешнюю камеру с 1x Проточный буфер до уровня , указанного изготовителем.
- Если образцы содержат моющее средство, заполнить внутреннюю камеру с буфером, содержащий 1x 0,02% кумасся синим, и внешней камерой с 1x красителей подвижного буфером.
- Подключение электродов к источнику питания, и electrophorese белки в геле при 150 В до тех пор, пока полоса красителя прогрессирует ~ 2 см в решении слой. Остановить и отключить электропитание.
3. Сшивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 3.1-3.6 при 4 ° С.
- Разберите аппарат электрофореза, а также отдельные листы стекла геля кассеты. Удаляют штабелирования слой.
- Тщательно вырезать гель чуть ниже нижнего края переднего красителя. приниматьзаботиться, чтобы сделать это сокращение, как гладкий и прямой, насколько это возможно, а затем выбросить неиспользованный кусок геля. Это оставит широкие ~ 2 см, горизонтальную полосу полиакриламидный геля, который будет содержать все белка в образце гомогенаты.
- Срежьте любые неиспользованные части вдоль краев полосы геля.
- Осторожно поместите полоску в 10 мл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) в небольшой контейнер, и осторожно перемешать нутации в течение 30 мин для уравновешивания.
- После уравновешивания, выбросить и заменить PBS с еще 10 мл. Пипетка 500 мкл 25 мМ ЦОС, растворенного в диметилсульфоксиде в PBS, и продолжают смешивание, как описано выше (этап 3.4) в течение 30 мин.
- Вылейте раствор DSP. Добавляют 10 мл 0,375 М трис (гидроксиметил) аминометана гидрохлорид (Трис-HCl), рН 8,8, содержащим 2% додецилсульфата натрия (SDS) для гашения непрореагировавшего DSP. Продолжить нутации в течение 15 мин.
4. SDS-PAGE
- В то время как гель полосы закалки, готовят SDS-PAГелевые растворы GE в соответствии со стандартными методами 9. Не добавляйте реагенты полимеризации.
- После закалки, возвращают гель полоску $ N до комнатной температуры, и бросают полосу в новый гель кассеты.
- Для этого тщательно подобрать гель и поместите его на чистую гель кассеты распорной пластины.
- Восток полоса так дно фронта красителя находится ближе к верхней части новой кассеты (то есть сторона , которая путешествовала дальше всего в течение BN-PAGE должна быть ближе к верхней части новой кассеты; гель полоска должна быть перевернута от ее до ориентация). Смотри рисунок 3.
- Поместите полоску так , что ее верхний край лежит даже когда верхний край крышки будет (т.е., это будет в верхней части нового геля). Убедитесь, что передняя красителя параллельно горизонтальных края стеклянной пластины.
- Нажмите одну сторону вырезанной полосы против одного из разделительных стенок, оставляя место на тс другой стороны, он для геля, чтобы вылить и стандартный белок или лестницы должны быть загружены.
- Если нижний край полоски геля содержит любые неровные участки, тщательно вырезать их. Если присутствует, то они будут пузыри ловушки во время заливки геля.
- Как только гель полоса в правильном положении, лежали крышку над разделительной пластиной. Применить мягкое давление, чтобы вытолкнуть любые захваченные пузырьки воздуха.
- Продолжить, чтобы собрать гель-заливки устройства в соответствии с инструкциями производителя.
- Добавьте реагенты полимеризации в геле разрешающего буфера, и вылить ее в подготовленную гель кассеты, с помощью серологической пипетки. Заполните гель кассету до ~ 2 см ниже вырезанной BN-PAGE гель-полоски, чтобы оставить место для укладки слоя.
- Добавьте 100 мкл бутанол поверх залитого геля, и позволить 30 мин для полимеризации разрешающего слоя. Слить бутанол.
- Добавьте реагенты полимеризации в раствор штабелирования геля. Использование serologскую пипетку, влить штабелирования слой, чтобы заполнить все оставшееся пустое пространство в гелевой кассете.
- Наклон гель кассеты как штабелирование слой сливают, так что оно заполняет пространство ниже полосы геля, а воздушные пузырьки не зажаты.
- По мере того как буфер концентрирующий гель заполняет пустое пространство под полосой гель, постепенно возвращают гель кассету для уровня фундамента.
- Продолжить, чтобы заполнить пустое пространство рядом с вырезанным гелем полосы с буфером укладки геля, пока он почти переполнением.
- Дайте штабелирование слой полимеризуется в течение 30 мин.
Примечание: Сделать 10x SDS-PAGE рабочего буфера (250 мМ трис (гидроксиметил) аминометан (TRIS), 1,9 М глицина, 1% ДСН), в то время как гель полимеризации. Это также можно сделать заранее и хранить при комнатной температуре. - Развести 50 мл 10X SDS-PAGE работает в буферном запасе 450 мл дНы 2 O , чтобы сделать 1x рабочего буфера.
- После того, как штабелирование слой полимеризуется, удалите гель кассету из заливкиУстройство, промыть дН 2 O, и собрать устройство электрофореза в соответствии с инструкциями производителя.
- Заполните внутреннюю камеру полностью с 1x SDS-PAGE проточной буфера, а затем заполнить наружную камеру до уровня, указанного производителем.
- Загрузите пространство рядом с вырезанным гелем полосы с молекулярной лестницей веса или соответствующим белковым стандартом.
- Присоедините электроды к источнику питания, и electrophorese образцов при 120 В. Когда краситель Кумасси стекает гель, остановить и отключить электропитание.
- Анализ геля с помощью стандартных методов Электроблоттинга и детекции белка путем связывания антитела 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом демонстрационном эксперименте мультимер-PAGE проводили на всем лизате мозга крысы. Полученные в результате этого выделенные белки переносили на поливинилиденфторид дифторида (PVDF) мембраны, а затем зондировали с использованием антител против белков, которые, как известно, образуют комплексы. На рисунке 1 показана проверка протокола двумя способами. Во- первых, мы показали , что эти сшитые белки расщепляться путем добавления восстанавливающего агента, то есть наблюдаемые виды более высокой молекулярной массы образуются за счет сшивающего реагента, а также не из - за какой - либо другой компонент протокола (фиг.1А) , Во- вторыхи, мы показали , что сшивание чувствительно к добавлению моющих средств (Фигура 1В), а это означает сшивание является специфическим для закомплексованных белков и что случайные реакционная способность из - за близкое расположение на геле сведен к минимуму. Рисунок 2 показывает , что метод не отражает соотвiratory комплекс II, но в остальном имеет широкое применение для улавливания как растворимые, так и мембраносвязанных комплексов.
Рисунок 1: Проверка метода мультимер-PAGE. (А) Захват белковых комплексов в геле сшивающий с DSP чувствителен к расщеплению dithiothretol (DTT). Мультимер-ПААГ проводил на всем лизате мозга крысы без (A1) или (А2), 5 мМ dithiothretol включена в закалочной раствора Трис / SDS. Гель электроблоттингу на мембраны ПВДФ, а затем зондировали для кинезин тяжелой цепи. Высокая молекулярная масса полосы наблюдается на обеих мембран, вероятно, соответствующих всем или части белкового комплекса кинезин двигателя. Существует дополнительная полоса происходит при 126 кДа на ДТТ-блот, обработанной молекулярной массы кинезин тяжелой цепи пептида. Дитиотреитол является восстанавливающим агентом, и в состоянии обратного крOss-связывание путем расщепления дисульфидной связи, присутствующей в DSP. Таким образом, агрегат кинезина чувствителен к расщеплению посредством DTT. ( B ) Захват комплексного белка чувствителен к добавлению денатурирующих детергентов. Мультиматричный ПААГ выполняли на лизате цельного мозга крысы, как описано в тексте, за исключением того, что к образцам лизата добавляли увеличивающиеся количества (0-2%) SDS (слева) или Triton X-100 (справа) и затем инкубировали на льду В течение 30 мин перед загрузкой первого геля. Конечные гели были промоканы на мембраны из PVDF и зондировались для α-синуклеина. Наблюдаются по меньшей мере три полосы с увеличением молекулярной массы, соответствующие α-синуклеиновому мономеру, тетрамеру и октамеру соответственно. Интенсивности сигналов олигомерных полос уменьшаются с увеличением концентрации детергента, что указывает на то, что эффективность сшивания зависит от конформации нативного белка. Нажмите здесь, чтобы перейти к viЭВ большой версии этой фигуры.
Рисунок 2: Демонстрация захвата белковых комплексов с использованием мультимером-PAGE. (A) Растворимые и связанные с мембранами белковые комплексы были захвачены из (A) лизата мозга крысы вся или (B) лизат инкубировали с 2% дигитонина в течение 1 ч при 4 ° С, выполняя мультимера-PAGE , как описано в тексте. Затем гели промокали и PVDF мембрана зондировала для компонентов различных комплексов. высокомолекулярных частиц наблюдаются на мембране зондируемой для ацетилированного тубулина, который, как известно, для стабилизации микротрубочек. Dynein и кинезины состоят из нескольких субъединиц белка двигателя комплексы с молекулярной массой 1,5 МДА и 380 кДа, соответственно. Мембраны промокали для компонентов этих комплексов показывают видов с высокой молекулярной массой. Кроме того, мультимер-PAGE успешно сaptured димер HSP90. альфа-синуклеина образует тетрамеры и октамеры, а также нейротоксические олигомеры с высокой молекулярной массой. Октамеры и полоса видов высших веса видны на промокала мембрану. VDAC димеризации также наблюдается. видов с высокой молекулярной массой обнаружены на мембранах промокали для компонентов митохондриальных комплексов I и IV. Тем не менее, мембрана промокала для SDHA, члена комплекса II, не демонстрирует какую-либо соответствующая высокую молекулярную массу полосы. AcetTUB: ацетилированный альфа-тубулина; βTUB: β-тубулина; Dynein: динеин тяжелой цепи; HSP90: белок теплового шока 90; Kinesin: кинезины тяжелой цепи; NDUFS3: железо-серный центр 3 митохондриального комплекса I; VDAC: порин; SDHA: сукцинатдегидрогеназы митохондриального комплекса II; COXIV: цитохром С-оксидаза митохондриального комплекса IV. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Общие мультимер-PAGE блок - схема алгоритма. (А) Подготовить лизат тканей с использованием методов неденатурирующими, такими как гомогенизация в БНЕ-PAGE образец буфере. (В) Пипетка лизат в БН-PAGE геле, а затем выполнить электрофорез (150 вольт) в БН-PAGE проточной буфера. Разрешить образец для переноса до тех пор, пока фронт красителя мигрировала ~ 2 см в разрешающего геля. (С) Удалите штабелирования слой и неиспользованную часть разрешающего слоя. (D) Погрузите гель полосу в PBS, и уравновешивают при встряхивании в течение 30 мин. (Е) Удалить PBS и повторно погрузить гель полосу в PBS , содержащий 2,5 мМ DSP. Встряхивают в течение 30 мин. (F) Удалить решение DSP, а затем вновь погрузить гель полосу в 375 мМ Трис , содержащего 2% SDS, и встряхивают в течение 30 мин. Комплексы, присутствующие в полосе геля теперь стабилизируются КИОs структурирование. (G) , Поворот гель полосы на 180 ° и отливают в новом геле SDS-PAGE. Включите и укладку и разрешение слоев. (Н) Устранить образец методом электрофореза (120 вольт). (I) , Удалить гель полосу и укладку слой, а затем проанализировать разрешение слоя по мере необходимости. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Белок-белковые взаимодействия являются важными для каждой задачи живых существ выполнять. Из-за этого, они являются предметом пристального внимания и исследования. Мультимер-страница представляет собой новый способ для захвата, разделения и анализа широкого спектра белковых комплексов. Ранее мы показали его применимость к изучению oligimerization болезненного-ассоциированного белка альфа-синуклеина 11. Тем не менее, он является расширяемым многих белковых комплексов, как показано на рисунке 2. По сравнению с другими методами изучения белковых комплексов, мультимер-СТР является предпочтительным из-за своей простоты и краткости. Время от образца ткани, чтобы полностью разделены SDS гель составляет приблизительно 8 ч. Так как обнаружение может быть сделано с помощью типичного вестерна-блоттинга, протокол может быть выполнен на лизате немодифицированной ткани с пределами обнаружения гораздо более низкими, чем те, которые связан с экспериментами раскрывающимися. Кроме того, большинство хорошо оборудованные биологии Labo молекулярногочил будет в состоянии выполнить технику с небольшим авансом инвестиций. Как обсуждаются ниже, большая часть задачи, связанная с мультимерами-ПААГОМ приходит при поиске неисправностей и оптимизации способа для каждого белкового комплекса изученного.
В то время как мультимер-PAGE должен быть доступен для большинства молекулярных биологов, его успех зависит от мастерства и опыта исследователя. Чрезвычайно важно, режущие и повторно разливка геля полосы BN в новый гель SDS должны быть сделаны с осторожностью. Очень важно, чтобы ориентировать гель полосы таким образом, что вызывает электрофорез белков мигрируют в геле SDS в параллельных группах. Если гель полосы отливают криво, белковые полосы будут мигрировать друг в друга, и данные будут потеряны. Специально для крупных комплексов, вращая гель полосу перед заливкой его в гель SDS-PAGE является так же важно. Это дает большие комплексы, которые не могут быть перенесенными очень далеки в гель BN-PAGE, больше времени, чтобы втянуться в разрешающем Лэг геля SDS-PAGE. Важно отметить, что изменения размера белка и физические характеристики, вызванное сшиванием также должны быть рассмотрены в ходе анализа. Например, некоторые белки с низкой молекулярной массой, такие как альфа-синуклеина, не очень хорошо удерживается на ПВДФ - мембраны, но их сшитые олигомеры 12. Это может запутать сравнительный анализ, и должно быть принято во внимание.
При разделении комплекса на мультимерах-ПААГ в первый раз, важно, чтобы проверить этот метод. Мы предлагаем три теста проверки / устранения неисправностей. Во-первых, обеспечить, чтобы пептид интерес мигрирует в гель BN, следуя протоколу мультимер-PAGE до иссечения полоски геля, затем останавливается, блот полосу на PVDF мембрану, и зонд для субъединицей интерес. Если нет никакого сигнала, комплекс, вероятно, не мигрирует в гель BN, то есть она должна быть сделана более пористой, или образец должен иметь возможность дополнительно мигрировать в РезоИНГ слой. Наличие сигнала подтверждает, что, по меньшей мере несвязанная субъединица мигрировала в гель. На данном этапе, это будет трудно подтвердить наличие полного комплекса. Если доказательства субъединицей обнаружен в геле полосы BN, перейти на второй тест. Выполните мультимера-PAGE без сшивающего стадии, а затем пятно на PVDF мембрану и зонд для субъединицей. Субъединица должна денатурации в присутствии SDS и перенос обычно в геле SDS. Если этого не происходит, то, скорее всего, какая-то проблема с техникой исследователя. Гель полосы БН, возможно, были слабо вырезать, оставляя некоторое количество белка позади, или гель SDS может быть брошен некорректно. И, наконец, выполнить мультимера-PAGE с включенным кросс-линкера стадии расщепления, а затем пятно и зонд, как описано на фиг.1. Это подтверждает, агрегация комплекса обусловлена добавлению DSP, а не неожиданное последствие какой-либо другой части протокола мультимера-PAGE. Расщепление должно привести к снижениюD-интенсивность агрегатной полосы и повышенной интенсивности субъединицы мономерной полосы при визуализации. Если из нормального мультимера PAGE не видно агрегатной полосы, но интенсивность мономерной полосы увеличивается при расщеплении DSP, комплекс, скорее всего, попал в гель SDS, но не смог мигрировать в разрешающий слой.
В своем современном состоянии multimer-PAGE применим ко многим белковым комплексам, но не является универсальным протоколом. Вероятно, его нужно изменить для каждого интересующего комплекса. Одна общая проблема показана на рисунке 2: захваченные комплексы часто настолько велики, что они едва мигрируют на SDS-PAGE. Это можно регулировать путем изменения пористости геля SDS или проведения электрофореза в течение более длительных периодов времени. Дополнительным осложнением является случайное присутствие более двух полос на геле. Неполная реакция с сшивающим агентом может приводить к распределению полос промежуточной молекулярной массы 13 . Это может усложнитьficult, чтобы определить, является ли множественные полосы являются репрезентативными физиологически важными промежуточными олигомерным, или просто непреднамеренными последствиями частичной сшивки. Для мембранных белков, которые должны быть растворены перед анализом, также важно учитывать влияние, что выбор моющего средства на поведении белковых комплексов. Моющее средство для солюбилизации мембранных белков влияют на их конформацию, ассоциации с партнерами по связыванию, и функций 14, 15. Выбор моющего средства также влияет на эффективность сшивания 16. Таким образом, вполне вероятно, что идеальные условия солюбилизирующих будут меняться в зависимости от комплекса изучается.
Мультимеру-PAGE иногда не удается захватить комплекс, как показано на блоте SDHA на рисунке 2. сукцинатдегидрогеназы является частью митохондриального комплекса 124 кДа II, который достаточно мал, что она должна легко перемещаться в гель.То, что это не было обнаружено, что указывает на то мультимер-PAGE не смог захватить его. Такие случаи, как у них есть много возможных объяснений. Большинство сшивающие реагенты содержат две реакционноспособные концевые группы, которые образуют ковалентные связи с аминокислотными боковыми цепями. Эффективность, с которой сшивающие реагенты захвата белковых комплексов зависит от их доступности для реактивных остатков. В случае DSP, сшивка осуществляется путем ацилирования первичных и вторичных алифатических аминогрупп растворителя подвергаются, как правило, е-аминогрупп лизина 17. Лизин остатки обычно находятся на поверхности белка, но их иногда секвестрации в гидрофобных центрах снижают эффективность сшивания 13. В субъединиц комплекса II захоронены в митохондриальной мембране, и могут оставаться недоступными для DSP, даже после солюбилизации дигитонином 18. Очень крупные и плотно упаковки комплексы, такие как амилоид oligomeRS, может также ограничить доступность остатков лизина поверхности к сшивающим реагентам. В результате, эти типы белковых агрегатов могут быть не совместимы с мультимерами-ПААГОМ. Также возможно , что кумасси синий, который связывается с гидрофобными участками и катионных остатков, задерживается после уравновешивания в PBS и блоков сшивания в некоторых случаях 19. Это может уменьшить или устранить обнаружение пострадавших олигомеров мультимеров-ПААГ. Таким образом, метод не является универсальным для анализа для характеристики всех белковых ассоциаций, и не должен рассматриваться, где Количественная в желании. Тем не менее, мультимер-ПААГ является недорогим, относительно быстрого инструмента для анализа белковых комплексов, и может быть рассмотрен наряду с другими установленными средствами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Поддерживается DA034783 NIH / NIDA. Мы благодарим Брайан А. Киллингера за техническую помощь с мультимерами-ПААГОМ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
