Summary
وتقدم (PAGE) نظام طريقة لتحقيق الاستقرار وفصل بروتين المجمعات الأم من المحللة أنسجة معدلة باستخدام بروتين عبر رابط-أمين رد الفعل مضافا إلى رواية اثنين من الأبعاد هلام بولي أكريلاميد الكهربائي.
Abstract
هناك العديد من وسائل متطورة لتنقية ودراسة البروتينات واحدة والببتيدات. ومع ذلك، يتم تنفيذ معظم الوظائف الخلوية من قبل شبكات مجمعات البروتين التفاعل، والتي غالبا ما تكون صعبة للتحقيق بسبب تجليدها هو غير التساهمية ومضطرب بسهولة عن طريق تقنيات تنقية. يصف هذا العمل وسيلة لتحقيق الاستقرار وفصل بروتين المجمعات الأم من أنسجة معدلة باستخدام ثنائي الأبعاد بولكرلميد الكهربائي للهلام. يتم تحميل الأنسجة المحللة على غير تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الأزرق الأصلي، ثم يتم تطبيق تيار كهربائي حتى يهاجر البروتين على بعد مسافة قصيرة في هلام. قطاع هلام يحتوي على بروتين ترحيلها ثم يتم رفعه وحضنت مع dithiobis-أمين رد الفعل عبر ربط الكاشف (succinimidyl بروبيونات)، والتي تستقر تساهميا مجمعات البروتين. قطاع هلام يحتوي على مجمعات عبر ربط ثم يتم صبها في دوديسيل الصوديوم هلام كبريتات بولي أكريلاميد، وريتم فصل انه المجمعات تماما. ويعتمد هذا الأسلوب على التقنيات والمواد مألوفة لمعظم علماء الأحياء الجزيئية، وهذا يعني أنها غير مكلفة وسهلة التعلم. بينما هي محدودة في قدرتها على فصل كاف مجمعات كبيرة للغاية، ولم تكن ناجحة عالميا، كانت الطريقة قادرة على التقاط مجموعة واسعة من المجمعات مدروسة، وينطبق المرجح أن العديد من الأنظمة المثيرة للاهتمام.
Introduction
وظيفة الخلوية العادية تعتمد على تفاعلات البروتين البروتين 1 و 2. ونتيجة لذلك، وغالبا ما يتم وضع علامة الأمراض التي تصيب الإنسان من الاضطرابات في التجمع وسلوك مختلف المجمعات البروتين 3. القدرة على تميز هذه التفاعلات هي بالتالي حرجة. تتطلب الوسائل الحالية للكشف عن هذه التفاعلات تنقية البروتينات المستهدفة، وغالبا ما تليها المنسدلة من شركاء التفاعل بهم. ويتم إنجاز تنقية التقليدية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي، وهطول الأمطار، و / أو اللوني 4. هذه الأساليب هي مضيعة للوقت، ويجب تغييرها لكل بروتين الهدف، وغالبا ما تؤدي إلى عوائد منخفضة. وتشمل أساليب تنقية الحديثة انصهار علامات الببتيد لاستهداف البروتينات، تليها مناعي أو استخراج على أعمدة محملة الخرز بد أن جزيء القبض على 5،"> 6. ولئن كان هذا للمد إلى العديد من البروتينات، فإنه يتطلب تسلسل تعديل الهدف، ما قد يؤدي في التركيبات التي تختلف في تقارب للشركاء ملزم المعتادة، والطبيعة الحساسة لبعض تفاعلات البروتين البروتين يعني هذا الأسلوب قد لا تكون قابلة للتطبيق في العديد من المواقف. بالإضافة إلى ذلك، المقايسات المنسدلة استخدامه لتعيين تفاعلات البروتين البروتين قد لا التقاط صورة الخلوية دقيقة، نظرا لدرجة المقيدة للحرية ومستويات غير الأصلية من البروتين الطعم.
من الناحية المثالية، يمكن أن يتم الكشف عن بروتين المجمعات في دولهم الأم، دون الحاجة إلى تنقية أو المنسدلة. وقد وضعت الأزرق الأصلي الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (BN-PAGE) كبديل أقل تغيير طبيعة لالصوديوم دوديسيل الكهربائي كبريتات بولي أكريلاميد هلام (SDS-PAGE)، ويسمح لفصل بعض البروتينات والمجمعات من العينات البيولوجية 7. ومع ذلك، والبروتينات في BN-صفحة منفصلة على أساس لارعدد جنرال الكتريك من المتغيرات، بما في ذلك حجم، تهمة، هيكل ثلاثي الأبعاد، وبالتعاون مع جزيئات أخرى. تفاعلات هذه العوامل كثيرا ما يؤدي إلى شارك في فصل البروتينات، وتشكيل الكلي، وضعف القرار الفرقة البروتين. ثنائي الأبعاد الأصلي-إس دي إس بايج حل بعض، ولكن ليس كل شيء، من هذه المشاكل 8.
للالتفاف على التعقيدات المرتبطة بفصل الأصلي، واستخدام بعض الكتاب الكواشف أمين التفاعلي عبر ربط، مثل dithiobis (succinimidyl بروبيونات) (DSP)، لالتقاط مجمعات البروتين في الأنسجة لست] (4). ويمكن بعد هذه لست] يعامل أن التشويه والتحريف ومفصولة SDS-PAGE، مع الحفاظ على حجم الأصلي وماكياج المجمعات البروتين. ومع ذلك، منذ الكواشف عبر ربط تتفاعل على أساس القرب من جزيء واحد إلى آخر، والبروتينات في أنسجة لست] ديك العديد من درجات الحرية ويمكن أن تتفاعل عشوائيا، عبر خلفية غير محدد-linking يمكن أن تكون عالية، وخاصة في عينات المركزة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى نتائج صعبة إلى تفسير.
هنا، علينا أن نظهر استخدام الأسلوب الهجين BN-PAGE / SDS-PAGE، ووصف متعدد القسيمات-بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (متعدد القسيمات-PAGE)، لفصل وكشف المجالس البروتين في الخلائط المعقدة. في البداية، يتم تعليق المحللة خلية في هلام بولي أكريلاميد عبر BN-PAGE. هلام التي تحتوي على المحللة بعد ذلك كان رد فعل مع كاشف DSP عبر ربط. ويفصل على هلام قليلا-يجمد الزائفة، والبروتينات هي أقل عرضة للرد nonspecifically الكثير، وهذا يعني تقليل الخلفية عبر رابط التفاعل. بعد عبر ربط، يتم استئصال العصابات جل وفصلها عن طريق SDS-PAGE. ثم يمكن تحليلها هلام الناتجة بأي وسيلة ترتبط عادة مع الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد. وتسمح هذه الطريقة لفصل والكشف عن بروتين المجمعات المحلية في المحللة أنسجة معدلة، دون الحاجة لتنقية إضافية أو سحب-داون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الأنسجة
- إعداد 10 مل من 4X عينة العازلة BN-PAGE (200 ملي مكرر (2-هيدروكسي) الأمينية تريس (hydroxymethyl) الميثان (مكرر تريس)، 200 مم كلوريد الصوديوم، و 40٪ ث / ت الجلسرين، 0.004٪ الشقائقية S، ودرجة الحموضة 7.2 ).
ملاحظة: قد يتم هذا الحل الأسهم في وقت مبكر وتخزينها في 4 ° C. - تمييع 250 ميكرولتر من عينة العازلة 4x وفي 750 ميكرولتر درهم 2 O تحتوي على 1X التجاري الكوكتيل مثبط البروتياز. دوامة والبرد على الجليد.
- التجانس 20 ملغ من النسيج المستهدف في المخزن المؤقت عينة 1 مل 1X الجليد الباردة BN-PAGE مع 30 السكتات الدماغية من الخالط dounce نظيفة.
ملاحظة: للحصول على هذه التجربة مظاهرة، والأنسجة المستهدفة هي كلها نسيج دماغ الفئران. بعد التجانس، يمكن معالجة العينات مع منظف معتدل مثل 2٪ ديجيتونين لإذابة والسماح الكهربائي للبروتينات الغشاء. - نقل جناسة لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل، وأجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 30 دقيقة لتكوير محتويات الخلوية غير قابلة للذوبان. بعد عملية الشراءص الطرد المركزي، صب وطاف في أنبوب نظيفة على الجليد.
- اتبع تعليمات الشركة المصنعة لقياس تركيز البروتين طاف باستخدام حمض bicinchoninic (BCA) أو ما شابه ذلك فحص البروتين الكميات.
- إذا كانت العينة جناسة (ق) تحتوي المنظفات، إضافة كمية من 5٪ Coomassie الأزرق G-250 في محلول مائي يكفي لتحقيق الحل جناسة إلى 0.25٪ Coomassie.
2. BN-PAGE
- تمييع 25 مل 20x ومواطن الأزرق (BN) الكهربائي المخزونات الاحتياطية (1.0 M مكرر تريس، 1.0 M tricine، ودرجة الحموضة 6.8) إلى 475 مل درهم 2 O تحتوي على 0.002٪ Coomassie الأزرق لجعل 500 مل من 1X العازلة على التوالي.
- إذا عينات تحتوي على المنظفات وبدلا من ذلك جعل 250 مل من 1X تشغيل العازلة التي تحتوي على 0.02٪ Coomassie و 250 مل أخرى تحتوي على لا شيء.
- عازلة البرد (ق) إلى 4 درجات مئوية.
- تنظيف وتجميع هلام بولي أكريلاميد صب كاسيت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- بعد أن بلمرة المواد الهلامية، وشطف كاسيت مع د 2 O وتجميع جهاز الكهربائي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- إزالة مشط جيدا وملء الآبار مع 1x بن-بادج تشغيل العازلة. تجنب ملء الغرفة الداخلية بأكملها مع العازلة حتى يتم تحميل العينات.
- إذا العينات تحتوي على المنظفات، وملء الآبار مع العازلة تحتوي على 0.02٪ كوماسي الأزرق.
ملاحظة: تنفيذ الخطوات 2.7-2.9 في 4 درجات مئوية.
- إذا العينات تحتوي على المنظفات، وملء الآبار مع العازلة تحتوي على 0.02٪ كوماسي الأزرق.
- باستخدام نصائح هلام التحميل، ماصة حجم التجانس التي تحتوي على 20 ميكروغرام من البروتين في الآبار المطلوبة. ماصة حجم يعادل من 1X بن-بادج العازلة عينة في أي الآبار غير المستخدمة.
ملاحظة: استخدام تركيز البروتين يحدد من مقايسة بكا لحساب الحجم المناسب من جناسة لإضافة إلىالآبار. - بعد تحميل عينات، وملء الغرفة الداخلية العازلة مع 1X BN-PAGE التوالي. مما لا شك فيه هو مغمورة هلام تماما في المخزن. المقبل، وملء الغرفة الخارجية مع العازلة 1X تشغيل إلى المستوى المشار إليه من قبل الشركة المصنعة.
- إذا عينات تحتوي على مواد التنظيف، وملء الغرفة الداخلية مع العازلة 1X تحتوي على 0.02٪ Coomassie الأزرق، وغرفة خارجية مع صبغة خالية 1X عازلة على التوالي.
- قم بتوصيل أقطاب كهربائية لإمدادات الطاقة، وelectrophorese البروتينات في هلام في 150 V حتى تقدم الفرقة صبغ ~ 2 سم إلى حل طبقة. وقف وقطع التيار الكهربائي.
3. عبر ربط
ملاحظة: تنفيذ خطوات 3،1-3،6 في 4 درجات مئوية.
- تفكيك الجهاز الكهربائي، والفصل بين الألواح الزجاجية من كاسيت هلام. إزالة والتخلص من طبقة التراص.
- قطع بعناية جل أسفل الحافة السفلية من الجبهة صبغ. يأخذالحرص على جعل هذا الخفض على نحو سلس ومستقيم ممكن، ومن ثم التخلص من قطعة غير المستخدمة من هلام. وهذا ترك ~ 2 سم واسعة، والشريط الأفقي من هلام بولي أكريلاميد، والتي سوف تحتوي على جميع البروتينات في عينة جناسة.
- تقليم بعيدا أي أجزاء غير المستخدمة على طول حواف شريط الجل.
- المكان بعناية الشريط في 10 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في وعاء صغير، وتخلط بلطف الإيماءة لمدة 30 دقيقة لكي تتوازن.
- بعد موازنة، ونبذ واستبدال PBS مع 10 مل أخرى. ماصة 500 ميكرولتر من 25 ملي DSP الذائبة في سلفوكسيد ثنائي ميثيل في برنامج تلفزيوني، ومواصلة الخلط على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 3.4) لمدة 30 دقيقة.
- تخلصي من حل DSP. إضافة 10 مل من 0.375 M تريس (hydroxymethyl) هيدروكلوريد aminomethane (تريس، حمض الهيدروكلوريك)، ودرجة الحموضة 8.8، التي تحتوي على 2٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) لإخماد DSP المتفاعل. تواصل الإيماءة لمدة 15 دقيقة.
4. SDS-PAGE
- بينما قطاع هلام تروي، وإعداد SDS-PAحلول هلام GE وفقا للأساليب القياسية 9. لا تقم بإضافة الكواشف البلمرة.
- بعد التبريد، وعودة قطاع هلام ΒΝ إلى درجة حرارة الغرفة، ويلقي الشريط في شريط كاسيت هلام جديد.
- للقيام بذلك، واختيار بعناية الجل ووضعه على طبق من ذهب هل جل كاسيت نظيفة.
- الشرق الشريط حتى الجزء السفلي من الجبهة صبغ هو أقرب إلى الجزء العلوي من الكاسيت الجديد (أي الجانب الذي سافر أبعد خلال BN-PAGE يجب أن يكون الأقرب إلى الجزء العلوي من كاسيت جديد، ويجب أن انقلبت قطاع هلام من قبل لها اتجاه). انظر الشكل 3.
- ضع الشريط بحيث حافته العليا تكمن حتى مع حيث الحافة العلوية للوحة الغلاف سيكون (أي أنه سيكون في الجزء العلوي من هلام جديد). تأكد من الجبهة صبغ موازية للحواف الأفقية للوحة من الزجاج.
- دفع جانب واحد من قطاع رفعه ضد أحد الجدران الفاصل، مما يترك مجالا على ركان الجانب الآخر للهلام أن سكب ومستوى البروتين أو سلم لتحميلها.
- إذا كانت الحافة السفلية للشريط الجل تحتوي على أي مناطق خشنة أو غير مستوية، وقطع بعناية بها بعيدا. إذا كان موجودا، وسوف فقاعات فخ خلال هلام تتدفق.
- مرة واحدة يتم وضع شريط الجل بشكل صحيح، ووضع لوحة غطاء على لوحة الفاصل. تطبيق ضغط لطيف على طرد أي فقاعات الهواء المحبوس.
- الاستمرار في تجميع الجهاز، صب جل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- إضافة الكواشف البلمرة إلى المخزن المؤقت هلام حل، وسكبه في كاسيت جل استعداد، وذلك باستخدام ماصة المصلية. ملء كاسيت هلام إلى ~ 2 سم تحت رفعه BN-PAGE شريط الجل، ليترك مجالا للطبقة التراص.
- إضافة 100 ميكرولتر بيوتانول فوق الجزء العلوي من هلام سكب، والسماح 30 دقيقة لبلمرة طبقة حل. تخلصي من بيوتانول.
- إضافة الكواشف البلمرة إلى حل هلام التراص. باستخدام serologماصة كال، صب طبقة التراص لملء كل المساحة الفارغة المتبقية في كاسيت هلام.
- إمالة كاسيت جل كما هو سكب طبقة التراص بحيث يملأ المساحة الموجودة أسفل الشريط هلام، وليس محاصرون فقاعات الهواء.
- كما العازلة هلام التراص يملأ المساحة الفارغة تحت الشريط هلام، والعودة تدريجيا كاسيت هلام لقدم مستوى.
- مواصلة لملء المساحة الفارغة بالقرب من الشريط هلام المستأصل مع العازلة هلام التراص، حتى امتدت تقريبا.
- السماح للطبقة التراص لتتبلمر لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: جعل 10X SDS-PAGE العازلة تشغيل (250 ملي تريس (hydroxymethyl) aminomethane (تريس)، 1.9 M الجلايسين، 1٪ SDS) في حين أن جل والبلمرة. وهذا يمكن أيضا أن تكون مصنوعة مسبقا وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. - تمييع 50 مل 10X SDS-PAGE مخزون احتياطي التشغيل إلى 450 مل درهم 2 O لجعل عازلة العمل 1X.
- بعد بلمرة طبقة التراص، وإزالة كاسيت جل من صبالجهاز، شطف مع DH 2 O، وتجميع الأجهزة الكهربائي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- ملء الغرفة الداخلية تماما مع العازلة تشغيل SDS-PAGE 1X، ثم ملء الغرفة الخارجية إلى المستوى المشار إليه من قبل الشركة المصنعة.
- تحميل الفضاء المجاور للشريط الجل المستأصل مع سلم الوزن الجزيئي أو مستوى البروتين المناسب.
- نعلق الأقطاب إلى إمدادات الطاقة، وelectrophorese العينات في 120 V. عند تشغيل صبغ Coomassie قبالة هلام، والتوقف عن قطع التيار الكهربائي.
- تحليل الجل باستخدام الطرق المعيارية electroblotting وكشف عن البروتين عن طريق الأجسام المضادة ملزمة 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه التجربة مظاهرة، تم تنفيذ مولتيمر-بادج على المحللة الفئران الدماغ كله. تم مسح البروتينات المنفصلة الناتجة على غشاء بولي فينيلين ديفلوريد (بفدف)، ثم بحث مع الأجسام المضادة ضد البروتينات التي من المعروف أنها تشكل المجمعات. ويبين الشكل 1 التحقق من صحة البروتوكول بواسطة وسيلتين. أولا، ونحن نبرهن على أن البروتينات عبر ربط قابلة للانشقاق عن طريق إضافة عامل الحد، وهذا يعني لوحظت أعلى ارتفاع الوزن الجزيئي الأنواع التي كتبها كاشف عبر ربط، وليس بسبب أي عنصر آخر من بروتوكول ( الشكل 1A ) . ثانيا، علينا أن نظهر أن عبر ربط حساسة لإضافة المنظفات ( الشكل 1B )، وهذا يعني عبر ربط هو محدد للبروتينات المعقدة وأن التفاعل العشوائي بسبب القرب على هلام هو الحد الأدنى. ويبين الشكل 2 أن الأسلوب فشل في التقاط ريسبمجمع iratory II، ولكن على خلاف له تطبيق واسع لالتقاط كل من مجمعات القابلة للذوبان وبغشاء.
الشكل 1: التحقق من أسلوب متعدد القسيمات-PAGE. (A) لقطة من المجمعات البروتين في جل عبر ربط مع DSP حساس للانشقاق عن طريق dithiothretol (DTT). تم إجراء متعدد القسيمات-PAGE على كامل المحللة دماغ الفئران دون (A1) أو مع (A2) 5 ملي dithiothretol المدرجة في حل التبريد تريس / SDS. وقد electroblotted الجل على الأغشية PVDF، ثم سبر لكينيسين السلسلة الثقيلة. ويلاحظ وجود الفرقة عالية الوزن الجزيئي على كل من الأغشية، من المحتمل المقابلة على كل أو جزء من مجمع البروتين كينيسين السيارات. هناك فرقة إضافية تحدث في 126 كيلو دالتون على لطخة تعامل DTT، الكتلة الجزيئية للكينيسين الثقيلة سلسلة الببتيد. Dithiothreitol هو عامل مختزل، وغير قادرة على عكس كرتابعنا ربط عن طريق الشق الحاضر ثاني كبريتيد السندات في DSP. إجمالا كينيسين وبالتالي حساسة للانشقاق عن طريق DTT. (B) البروتين القبض معقد حساس لإضافة تغيير طبيعة المنظفات. وقد أجريت متعدد القسيمات-PAGE على كامل المحللة دماغ الفئران كما هو موضح في النص، باستثناء كميات متزايدة (0-2٪) من SDS (يسار) أو تريتون X-100 (يمين) وأضيفت إلى العينات المحللة، ومن ثم حضنت على الجليد لمدة 30 دقيقة قبل تحميل هلام الأول. وقد نشف المواد الهلامية النهائية على الأغشية PVDF، وسبر لα-synuclein. لوحظ على الأقل ثلاث عصابات من زيادة الوزن الجزيئي، الموافق ألفا-synuclein مونومر، tetramer، وoctamer، على التوالي. شدة إشارة من العصابات بلازميدة قليلة القسيمات تنخفض مع زيادة تركيز المنظفات، مشيرا إلى أن عبر ربط فعالية يعتمد من التشكل البروتين الأصلي. الرجاء النقر هنا لالسادسEW نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مظاهرة من القبض على المجمعات البروتين باستخدام متعدد القسيمات-PAGE. تم القبض على (A) مجمعات البروتين القابلة للذوبان وبغشاء من (A) الفئران كله المحللة الدماغ أو (B) المحللة حضنت مع 2٪ ديجيتونين لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية، عن طريق أداء متعدد القسيمات-PAGE كما هو موضح في النص. ثم تم نشف المواد الهلامية والأغشية PVDF سبر لمكونات مختلفة المجمعات. ويلاحظ ارتفاع الأنواع الوزن الجزيئي على الغشاء بحثها عن تويولين الأسيتيل، والذي يعرف لتحقيق الاستقرار في الأنابيب الدقيقة. داينين وكينيسين ومتعددة فرعية مجمعات البروتين المحرك مع الأوزان الجزيئية 1.5 نجمة داود الحمراء و 380 كيلو دالتون، على التوالي. الأغشية نشف لمكونات هذه المجمعات تظهر الأنواع الوزن الجزيئي عالية. وبالإضافة إلى ذلك، متعدد القسيمات-PAGE بنجاح ج aptured ديمر HSP90. ألفا-Synuclein يشكل tetramers وoctamers، وكذلك أعصاب الأوليغومرات الوزن عالية الجزيئية. وينظر الى octamer ويشكل حلقة في سلسلة من الأنواع الوزن العالي على الغشاء نشف. ويلاحظ أيضا VDAC dimerization. تم الكشف عن ارتفاع الأنواع الوزن الجزيئي على الأغشية نشف لمكونات المجمعات الميتوكوندريا الأول والرابع. ومع ذلك، نشف الغشاء لSDHA، وهو عضو في مجمع II، لا تثبت أي فرقة عالية الجزيئية المناسبة الوزن. AcetTUB: الأسيتيل ألفا تويولين. βTUB: β تويولين. داينين: السلسلة الثقيلة داينين. HSP90: حرارة صدمة بروتين 90؛ كينيسين: كينيسين سلسلة الثقيلة؛ NDUFS3: مركز الحديد والكبريت 3 من مجمع الميتوكوندريا الأول؛ VDAC: PORIN. SDHA: سكسينات نازعة من مجمع الميتوكوندريا الثاني؛ COXIV: السيتوكروم C أوكسيديز من IV معقدة الميتوكوندريا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الصورة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل (3): عام متعدد القسيمات-PAGE انسيابي. (A) إعداد المحللة الأنسجة باستخدام أساليب غير تغيير طبيعة، مثل المجانسة في المخزن عينة BN-PAGE. (B) ماصة المحللة في هلام BN-PAGE، ثم أداء الكهربي (150 فولت) في المخزن BN-PAGE التوالي. تسمح عينة للهجرة حتى هاجر الجبهة صبغ ~ 2 سم في هلام حل. (C) إزالة طبقة التراص والجزء غير المستخدم من طبقة حل. (D) يغرق قطاع جل في برنامج تلفزيوني، وتتوازن مع اهتزاز لمدة 30 دقيقة. (E) إزالة PBS، وإعادة غمر قطاع جل في برنامج تلفزيوني تحتوي على 2.5 ملي DSP. يهز لمدة 30 دقيقة. (F) إزالة حل DSP، ثم إعادة غمر شريط الجل في 375 ملي تريس تحتوي على 2٪ SDS، ويهز لمدة 30 دقيقة. المجمعات الحالية في قطاع جل واستقرت الآن بواسطة كروسسري. (G) تدوير هلام تجريد 180 درجة وتلقى في هلام SDS-PAGE الجديد. تشمل كلا من التراص وحل طبقات. (H) حل عينة من قبل الكهربائي (120 فولت). (I) إزالة الشريط جل وطبقة التراص، ثم تحليل حل طبقة حسب الضرورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تفاعلات البروتين البروتين مهم لكل مهمة الكائنات الحية تنفذ. وبسبب هذا، فهي موضوع تدقيق مكثف والبحوث. متعدد القسيمات-PAGE هي طريقة جديدة لالتقاط وفصل، وتحليل مجموعة واسعة من المجمعات البروتين. لقد أثبتنا سابقا تطبيقه لدراسة oligimerization من الأمراض المرتبطة البروتين α-synuclein 11. ومع ذلك، فإنه للمد إلى العديد من المجمعات البروتين، كما هو موضح في الشكل (2). بالمقارنة مع غيرها من أساليب دراسة المجمعات البروتين، متعدد القسيمات-PAGE هو مفيد بسبب بساطته والإيجاز. الوقت من عينة الأنسجة للفصل تماما SDS جل ما يقرب من 8 ساعات. منذ يمكن أن يتم الكشف عن طريق طخة غربية نموذجية، وبروتوكول لا يمكن أن يؤديها على المحللة أنسجة معدلة، مع حدود الكشف أقل بكثير من تلك التي ترتبط مع تجارب المنسدلة. بالإضافة إلى ذلك، مجهزة تجهيزا جيدا الأكثر لبو البيولوجيا الجزيئيةسوف المصانع تكون قادرة على أداء هذه التقنية مع الاستثمار مقدما قليلا. كما نوقش في وقت لاحق، فإن معظم التحدي المرتبطة مولتيمر-بادج يأتي مع استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتحسين طريقة لكل مجمع البروتين المدروسة.
في حين أن مولتيمر-بادج يجب أن تكون في متناول معظم علماء الأحياء الجزيئية، نجاحها يعتمد على مهارة الباحث وخبرته. من الأهمية بمكان، قطع وإعادة الصب من الشريط هلام بن في هلام سدز جديد يجب أن يتم بعناية. من المهم لتوجيه قطاع هلام بحيث الكهربائي يؤدي البروتينات إلى الهجرة إلى هلام سدز في العصابات المتوازية. إذا كان يلقي الشريط هلام ملتوية، فإن العصابات البروتين تهاجر إلى بعضها البعض وسيتم فقدان البيانات. خاصة بالنسبة للمجمعات الكبيرة، وتناوب قطاع هلام قبل الصب في هلام سدز-بادج هو مهم بالمثل. وهذا يعطي مجمعات أكبر، والتي قد لا يكون قد هاجر بعيدا جدا في هلام بن-بادج، المزيد من الوقت ليتم سحبها إلى حل لايص من هلام SDS-PAGE. الأهم من ذلك، ينبغي النظر أيضا التغييرات على حجم البروتين والخصائص الفيزيائية الناجمة عن عبر ربط أثناء التحليل. على سبيل المثال، بعض منخفضة الوزن الجزيئي البروتينات، مثل α-synuclein، لا يتم الاحتفاظ بشكل جيد على الأغشية PVDF، ولكن الأوليغومرات عبر ربط هم 12. وهذا يمكن أن نخلط التحليل المقارن، ويجب أن تؤخذ بعين الاعتبار.
عندما يفصل تعقيدا-PAGE متعدد القسيمات للمرة الأولى، من المهم للتحقق من صحة هذه الطريقة. نقترح ثلاثة اختبارات التحقق من صحة / استكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولا، تأكد من أن الببتيد من الفائدة يهاجر في هلام BN باتباع بروتوكول متعدد القسيمات-PAGE حتى استئصال شريط الجل، ثم توقف، وصمة عار الشريط على غشاء PVDF، وتحقيق لالوحيدات من الفائدة. إذا كان هناك أي إشارة، مجمع على الأرجح لم يهاجر إلى هلام BN، وهذا يعني أنه ينبغي أن تكون أكثر مسامية، أو ينبغي أن يسمح للعينة لزيادة الهجرة إلى resolvجي طبقة. جود إشارة يؤكد أن الوحدة الفرعية غير منضم على الأقل هاجرت إلى هلام. في هذه المرحلة، وسوف يكون من الصعب تأكيد وجود مجمع كامل. إذا تم الكشف عن أدلة على الوحيدات في قطاع هلام BN، والانتقال إلى الاختبار الثاني. أداء-PAGE متعدد القسيمات دون خطوة عبر ربط، ثم وصمة عار على غشاء PVDF والتحقيق لالوحيدات. الوحيدات أن تفسد بحضور SDS ويهاجر عادة في هلام SDS. إذا كان هذا لا يحدث، ومن المرجح هناك بعض المشاكل مع تقنية الباحث. قطاع هلام BN قد قطعت سيئة، وترك بعض البروتين وراء، أو ربما يكون قد يلقي هلام SDS بشكل غير صحيح. وأخيرا، نفذ متعدد القسيمات-PAGE مع عبر رابط خطوة الانقسام وشملت، بعد ذلك وصمة عار والتحقيق، كما نوقش في الشكل 1. هذا يؤكد هو تجميع المجمع المقرر أن إضافة DSP، وليس نتيجة غير متوقعة من أي جزء آخر من بروتوكول متعدد القسيمات-PAGE. ينبغي أن يؤدي إلى انشقاق في الحدد-كثافة الفرقة الإجمالية وزيادة الكثافة فرعية مونومر الفرقة على التصوير. إذا لا ترى الفرقة المجمعة من العادية متعدد القسيمات-PAGE، ولكن زيادة الفرقة مونومر في كثافة عند المشقوق DSP، ومن المحتمل جعلت المجمع إلى هلام SDS، لكنها فشلت في الهجرة إلى طبقة حل.
في حالتها الراهنة، متعدد القسيمات-PAGE هي التي تنطبق على العديد من المجمعات البروتين، ولكن ليست ذات حجم واحد يناسب الجميع البروتوكول. من المحتمل يحتاج إلى تعديل لكل مجمع الفائدة. ويتجلى مشكلة واحدة مشتركة في الشكل 2: مجمعات القبض غالبا ما تكون كبيرة بحيث بالكاد الهجرة على SDS-PAGE. قد إدارة هذا عن طريق تغيير المسامية من هلام SDS أو أداء الكهربائي لفترات أطول من الوقت. تعقيد إضافي هو وجود بعض الأحيان أكثر من شريطين على هلام. رد فعل غير مكتمل مع عبر رابط يمكن أن يؤدي إلى توزيع المتوسطة العصابات الوزن الجزيئي 13. هذا يمكن أن تجعل من DIFficult لتحديد ما إذا عصابات متعددة هي ممثل سيطة بلازميدة قليلة القسيمات مهمة من الناحية الفسيولوجية، أو عواقب غير مقصودة ببساطة من الجزئي عبر ربط. للبروتينات الغشاء الذي يجب أن تذوب قبل التحليل، فمن المهم أيضا أن تنظر في تأثير أن اختيار المنظفات ديه على سلوك المجمعات البروتين. المنظفات المستخدمة لإذابة البروتينات الغشاء يؤثر على التشكل والجمعيات مع الشركاء ملزمة، والوظائف 14 و 15. اختيار المنظفات أيضا يؤثر على فعالية عبر ربط 16. وبالتالي، فمن المرجح أن الظروف الانحلال مثالية سوف تختلف مع المجمع قيد الدراسة.
متعدد القسيمات-PAGE تفشل أحيانا لالتقاط معقدة، كما هو مبين على وصمة عار SDHA في الشكل 2. سكسينات نازعة هو جزء من 124 كيلو دالتون مجمع الميتوكوندريا II، والتي هي صغيرة بما يكفي أنه يجب أن تتحرك بسهولة في هلام.التي لم يتم الكشف فإنه يشير إلى أن متعدد القسيمات-PAGE لم تتمكن من القبض عليه. مثل هذه الحالات لديها العديد من التفسيرات المحتملة. معظم الكواشف عبر ربط تحتوي على طرفي رد الفعل، والتي تشكل روابط تساهمية مع السلاسل الجانبية الأحماض الأمينية. الكفاءة التي الكواشف مجمعات البروتين القبض على ربط عبر تعتمد على إتاحتها للمخلفات رد الفعل. في حالة DSP، ويتم إنجاز عبر ربط بواسطة أسيلة المجموعات الأمينية المعرضة للمذيب الابتدائية والثانوية الدهنية، وعادة ما مجموعات ε الأمينية يسين 17. تم العثور على بقايا يسين عادة على سطح البروتين، ولكن عزل أحيانا في مراكز مسعور يقلل من كفاءة عبر ربط 13. يتم دفن مفارز مجمع II في غشاء الميتوكوندريا، ويمكن أن تبقى بعيدة عن متناول DSP، حتى بعد الإذابة مع ديجيتونين 18. المجمعات الكبيرة جدا والتعبئة الكثيفة، مثل oligome اميلويدالتمرير، قد يحد أيضا من توافر بقايا يسين السطح لالكواشف عبر ربط. ونتيجة لذلك، هذه الأنواع من المجالس البروتين قد لا تكون متوافقة مع PAGE متعدد القسيمات. ومن الممكن أيضا أن Coomassie الأزرق، الذي يربط المناطق مسعور والمخلفات الموجبة، باقية بعد موازنة في برنامج تلفزيوني وكتل عبر ربط في بعض الحالات 19. هذا قد تقليل أو القضاء على الكشف عن الأوليغومرات تتأثر متعدد القسيمات-PAGE. وبالتالي، فإن هذه الطريقة لا فحص شامل لوصف جميع الجمعيات البروتين، ويجب عدم النظر إلى حيث الكميات في المطلوب. ومع ذلك، متعدد القسيمات-PAGE هو أداة سريعة نسبيا وغير مكلفة لتحليل مجمعات البروتين، ويمكن أن ينظر إلى جانب وسائل أخرى المعمول بها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
بدعم من DA034783 NIH / النداء. نشكر بريان A. كيلينجر للحصول على المساعدة الفنية مع متعدد القسيمات-PAGE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
