Summary
Procédé pour la stabilisation et la séparation des complexes de protéines natives à partir de lysat de tissu non modifié en utilisant une protéine réactive amine agent de réticulation couplé à une nouvelle électrophorèse sur gel de polyacrylamide en deux dimensions (PAGE) système est présentée.
Abstract
Il existe de nombreuses méthodes bien développées pour purifier et étudier des protéines et des peptides uniques. Cependant, la plupart des fonctions cellulaires sont réalisées par des réseaux de complexes de protéines qui interagissent, qui sont souvent difficiles à étudier car leur liaison n'est pas covalente et facilement perturbée par des techniques de purification. Ce travail décrit une méthode de stabilisation et de séparation des complexes de protéines indigènes à partir de tissus non modifiés en utilisant une électrophorèse en gel de polyacrylamide bidimensionnelle. Le lysat de tissu est chargé sur un gel de polyacrylamide natif non dénaturant, puis on applique un courant électrique jusqu'à ce que la protéine migre à une courte distance dans le gel. La bande de gel contenant la protéine migrée est ensuite excisée et incubée avec le réactif réticulant réactif à l'aminé dithiobis (propionate de succinimidyle), qui stabilise de manière covalente les complexes de protéines. La bande de gel contenant des complexes réticulés est ensuite jetée dans un gel de polyacrylamide de dodécyl sulfate de sodium et til complexes sont séparés complètement. La méthode repose sur des techniques et des matériaux familiers à la plupart des biologistes moléculaires, ce qui signifie qu'il est peu coûteux et facile à apprendre. Bien qu'il soit limité dans sa capacité à séparer suffisamment complexes de très grande taille, et n'a pas été universellement avec succès, la méthode a été en mesure de capturer une grande variété de complexes bien étudiés, et probablement applicable à de nombreux systèmes d'intérêt.
Introduction
La fonction cellulaire normale est dépendante des interactions protéine-protéine 1, 2. En conséquence, les maladies humaines sont souvent marqués par des perturbations dans l'assemblage et le comportement de différents complexes protéiques 3. La capacité de caractériser ces interactions est donc essentiel. Les moyens actuels de détection de ces interactions nécessitent la purification des protéines cibles, souvent suivies de pull-down de leurs partenaires d'interaction. Purification classique est réalisée par centrifugation différentielle, la précipitation, et / ou Chromatographie 4. Ces méthodes sont de temps, doivent être modifiés pour chaque protéine cible, et donnent souvent lieu à des rendements faibles. Méthodes de purification modernes impliquent la fusion des balises de peptides à des protéines cibles, suivie par une immunoprécipitation ou par extraction sur des colonnes chargées avec des billes liées à une molécule de capture 5,« > 6. Bien que ce soit extensible à de nombreuses protéines, il nécessite une modification de la séquence de la cible, ce qui pourrait entraîner des constructions qui diffèrent par affinité pour leurs partenaires de liaison habituels. La nature délicate de certaines interactions protéine-protéine signifie que cette méthode ne peut pas être applicable de nombreux scénarios. de plus, les tests déroulants utilisés pour cartographier les interactions protéine-protéine ne peut pas capturer une image précise cellulaire, en raison de degrés de liberté restreints et les niveaux non natifs de la protéine appât.
Idéalement, les complexes de protéines pourraient être détectés dans leur état d'origine, sans nécessiter de purification ou de tirer vers le bas. Natif bleu électrophorèse sur gel de polyacrylamide (BN-PAGE) a été développé comme une alternative moins dénaturant à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), et permet la séparation de certaines protéines et des complexes à partir d' échantillons biologiques 7. Cependant, les protéines dans la base BN-PAGE séparent sur un large nombre de variables, y compris la taille, la charge, la structure en trois dimensions, et l'association avec d'autres molécules. Les interactions de ces facteurs se traduisent souvent par co-séparation des protéines, la formation d'agrégats, et une mauvaise résolution de la bande de protéine. Électrophorèse bidimensionnelle sur gel natif de polyacrylamide résout certains, mais pas tous, de ces problèmes 8.
Pour éviter les complications associées à la séparation native, certains auteurs utilisent des réactifs de reticulation réactifs avec les amines, telles que dithiobis (propionate de succinimidyle) (DSP), pour capturer des complexes protéiques dans les lysats de tissu 4. Ces lysats traités peuvent ensuite être dénaturés et séparés par SDS-PAGE, tout en conservant la taille native et le maquillage des complexes de protéines. Cependant, étant donné que les réactifs de réticulation réagissent en fonction de la proximité d'une molécule à l'autre, et les protéines dans les lysats de tissus ont beaucoup de degrés de liberté et peut interagir stochastiquement, croix de fond non spécifique-linking peut être élevé, en particulier dans les échantillons concentrés. Cela peut conduire à des résultats difficiles à interpréter.
Ici, nous démontrons l'utilisation d'un procédé hybride BN-PAGE / SDS-PAGE, appelée électrophorèse sur gel de polyacrylamide-multimère (multimère-PAGE), pour séparer et détecter des assemblages de protéines dans des mélanges complexes. Dans un premier temps, le lysat cellulaire est mis en suspension dans un gel de polyacrylamide via BN-PAGE. Le gel contenant de l'lysat est ensuite mis à réagir avec le réactif de réticulation DSP. Pseudo-immobilisé et légèrement séparés sur le gel, les protéines sont beaucoup moins susceptibles de réagir de façon non spécifique, ce qui signifie fond réactivité de réticulation est réduite. Après la reticulation, les bandes de gel sont excisées et séparées par SDS-PAGE. Le gel obtenu peut être ensuite analysé par tout moyen généralement associés à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Cette méthode permet la séparation et la détection des complexes de protéines natives dans un lysat de tissu non modifié, sans la nécessité d'une purification supplémentaire ou pull-down.
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Protocol
1. Préparation du tissu
- Préparer 10 ml de 4x tampon d'échantillon BN-PAGE (200 mM de bis (2-hydroxyéthyl) amino-tris (hydroxyméthyl) méthane (Bis-Tris), 200 mM de NaCl, 40% p / v de glycerol, 0,004% de Ponceau S, pH 7,2 ).
NOTE: Cette solution mère peut être faite à l'avance et conservé à 4 ° C. - Diluer 250 ul de tampon d'échantillon 4x dans 750 ul dH 2 O contenant un cocktail d'inhibiteurs de proteases commerciales 1x. Vortex et laisser refroidir sur la glace.
- Homogénéiser 20 mg de tissu cible dans le 1 mL 1x glacée tampon d'échantillon BN-PAGE avec 30 coups d'un homogénéisateur Dounce propre.
NOTE: Pour cette expérience de démonstration, le tissu cible est l'ensemble des tissus du cerveau de rat. Après homogénéisation, les échantillons peuvent être traités avec un détergent doux tel que 2% de digitonine pour solubiliser et permettre l'électrophorèse des protéines de la membrane. - Transférer le broyat dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml, et centrifuger à 14 000 xg pendant 30 min pour sédimenter contenus cellulaires insolubles. AFTEcentrifugation r, décanter le surnageant dans un tube propre sur la glace.
- Suivre les instructions du fabricant pour mesurer la concentration de protéine surnageant en utilisant l'acide bicinchoninique (BCA) ou une analyse de protéine de quantification similaire.
- Si l'échantillon d'homogénat (s) contient un détergent, ajouter une quantité de 5% de bleu de Coomassie G-250 en solution aqueuse suffisante pour amener la solution d'homogénat à 0,25% de Coomassie.
2. BN-PAGE
- Diluer 25 ml 20x native bleu (BN) électrophorèse stock tampon (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M tricine, pH 6,8) dans 475 ml de dH 2 O contenant 0,002% de bleu de Coomassie pour faire 500 ml de 1 x tampon de migration.
- Si les échantillons contiennent du détergent, à la place faire 250 ml de tampon de migration 1x contenant 0,02% de Coomassie et 250 mL contenant aucun.
- tampon Chill (s) à 4 ° C.
- Nettoyer et assembler une cassette de coulée du gel de polyacrylamide selon les instructions du fabricant.
- Après que les gels ont polymérisé, rincer la cassette avec dH 2 O et d' assembler l'appareil d'électrophorèse selon les instructions du fabricant.
- Retirez le bien peigne et remplir les puits avec 1x tampon de fonctionnement BN-PAGE. Éviter de remplir la totalité de la chambre intérieure avec un tampon jusqu'à ce que les échantillons sont chargés.
- Si les échantillons contiennent du détergent, remplir les puits avec le tampon contenant 0,02% de bleu de Coomassie.
REMARQUE: Effectuez les étapes 2/7 à 2/9 à 4 ° C.
- Si les échantillons contiennent du détergent, remplir les puits avec le tampon contenant 0,02% de bleu de Coomassie.
- En utilisant des pointes de chargement de gel, une pipette d'un volume d'homogénat contenant 20 ug de protéine dans les puits souhaités. Pipeter un volume équivalent de tampon d'échantillon 1x BN-PAGE dans des puits non utilisés.
REMARQUE: Utiliser la concentration en protéine déterminée à partir du dosage BCA pour calculer le volume approprié de l'homogénat à ajouter àles puits. - Après échantillons sont chargés, remplir la chambre intérieure avec un tampon de course 1x BN-PAGE. Assurez - vous que le gel est entièrement immergé dans un tampon. Ensuite, remplir la chambre externe avec un tampon de course 1x au niveau indiqué par le constructeur.
- Si les échantillons contiennent du détergent, remplir la chambre intérieure avec le tampon 1x contenant 0,02% de bleu de Coomassie, et la chambre extérieure avec un tampon en cours d'exécution 1x sans colorant.
- Connecter les électrodes à l'alimentation électrique, et l'électrophorèse des protéines dans le gel à 150 V jusqu'à ce que la bande de colorant progresse ~ 2 cm dans la résolution de couche. Arrêtez et débranchez l'alimentation.
3. La réticulation
REMARQUE: Effectuez les étapes 03.01 à 03.06 à 4 ° C.
- Désassembler l'appareil d'électrophorèse, et à séparer les panneaux de verre de la cassette de gel. Retirez et jetez la couche d'empilement.
- Couper avec soin le gel juste en dessous du bord inférieur de la face de colorant. PrendreVeillez à ce que cette coupe soit aussi lisse et droite que possible, puis jettez le morceau de gel non utilisé. Cela laissera une bande horizontale de gel de polyacrylamide de ~ 2 cm de large, qui contiendra toutes les protéines dans l'échantillon homogénat.
- Découper toutes les portions inutilisées le long des bords de la bande de gel.
- Placez soigneusement la bande dans 10 mL de solution salée tamponnée au phosphate (PBS) dans un petit récipient et mélangez délicatement par nutation pendant 30 minutes pour équilibrer.
- Après équilibrage, jeter et remplacer le PBS par 10 mL supplémentaires. Pipetter 500 μL de DSP 25 mM dissous dans du diméthylsulfoxyde dans le PBS et continuer à mélanger comme ci-dessus (étape 3.4) pendant 30 min.
- Verser la solution DSP. Ajouter 10 ml de chlorhydrate de tris (hydroxyméthyl) aminométhane 0,375 M (Tris-HCl), pH 8,8, contenant 2% de dodécylsulfate de sodium (SDS) pour étancher le DSP n'ayant pas réagi. Continuer la nutation pendant 15 min.
4. SDS-PAGE
- Alors que la bande de gel trempe, prépare SDS-PASolutions de gel GE selon des méthodes standard 9. Ne pas ajouter des réactifs de polymérisation.
- Après la trempe, le retour de la bande de gel ΒΝ à la température ambiante, et la bande coulée dans une nouvelle cassette de gel.
- Pour ce faire, choisissez soigneusement le gel et le placer sur une plaque d'espacement de cassette de gel propre.
- Orient la bande de sorte que le fond du front de colorant est la plus proche de la partie supérieure de cassette ( à savoir le côté qui a voyagé le plus loin au cours de BN-PAGE devrait être plus proche de la partie supérieure de la nouvelle cassette, la bande de gel doit être retourné à partir de son avant orientation). Voir la figure 3.
- Placer la bande de telle sorte que son bord supérieur se trouve même où le bord supérieur de la plaque de recouvrement sera ( à savoir, il sera dans le haut du nouveau gel). Assurez-vous que le front de colorant est parallèle aux bords horizontaux de la plaque de verre.
- Appuyez sur une face de la bande excisée contre l'une des parois d'entretoise, laissant la place à til autre côté pour le gel à couler et à un niveau de protéine ou une échelle à charger.
- Si le bord inférieur de la bande de gel contient des zones crénelés ou inégaux, les couper à une distance soigneusement. Le cas échéant, ils bulles piège lors de la coulée du gel.
- Une fois que la bande de gel est positionnée correctement, fixer la plaque de recouvrement au-dessus de la plaque d'espacement. Appliquer une légère pression pour pousser les bulles d'air piégées.
- Continuer d'assembler l'appareil de coulage de gel conformément aux instructions du fabricant.
- Ajouter des réactifs de polymérisation dans le tampon de gel de résolution, et le verser dans la cassette de gel préparé, en utilisant une pipette sérologique. Remplir la cassette de gel de ~ 2 cm au-dessous de la bande de gel excisée BN-PAGE, afin de laisser la place à la couche d'empilement.
- Ajouter 100 pL de butanol sur le dessus du gel coulé, et laisser 30 min pour la polymérisation de la couche de résolution. Décanter le butanol.
- Ajouter des réactifs de polymérisation à la solution de gel d'empilement. L' utilisation d' un serologpipette ical, verser la couche d'empilement pour remplir tout l'espace vide restant dans la cassette de gel.
- Incliner la cassette de gel en tant que couche d'empilement est versée afin de remplir l'espace au-dessous de la bande de gel, et des bulles d'air ne sont pas pris au piège.
- Comme le tampon de gel d'empilement remplit l'espace vide en dessous de la bande de gel, retourner progressivement la cassette de gel au pied de niveau.
- Continuer de remplir l'espace vide à côté de la bande de gel excisée avec le tampon de gel d'empilement, jusqu'à ce qu'il déborde à peu près.
- Laisser la couche d'empilement pour polymériser pendant 30 minutes.
REMARQUE: Faire un tampon en cours d'exécution 10x SDS-PAGE (250 mM de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (tris), de la glycine 1,9 M, SDS 1%), tandis que le gel est la polymérisation. Cela peut aussi être fait à l'avance et conservé à température ambiante. - Diluez 50 mL 10X stock tampon de fonctionnement SDS-PAGE dans 450 ml dH 2 O pour faire tampon de travail 1x.
- Après que la couche d'empilement est polymérisé, retirer la cassette de gel de la couléeAppareil, rincer avec dH 2 O, et assembler l'appareil d'électrophorèse selon les instructions du fabricant.
- Remplir complètement la chambre intérieure avec un tampon de course 1x SDS-PAGE, puis remplir la chambre extérieure au niveau indiqué par le constructeur.
- Charger l'espace à côté de la bande de gel excisée avec une échelle de poids moléculaire ou de la norme de protéine appropriée.
- Attacher les électrodes à l'alimentation électrique, et l'électrophorèse des échantillons à 120 V. Lorsque le colorant Coomassie coule le gel, arrêter et couper l'alimentation électrique.
- Analyse du gel en utilisant des procédés standard de détection et électrotransfert des protéines par liaison de l' anticorps 10.
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Representative Results
Dans cette expérience de démonstration, multimère-PAGE a été réalisée sur l'ensemble lysat de cerveau de rat. Les protéines séparées résultantes ont été transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF), et ensuite sondées avec des anticorps dirigés contre des protéines qui sont connues pour former des complexes. La figure 1 montre une validation du protocole par deux moyens. Tout d' abord, nous avons démontré que les protéines réticulées sont clivables par addition d'un agent réducteur, ce qui signifie les espèces de poids moléculaire plus élevés observés sont formés par le réactif de reticulation, et ne sont pas dues à tout autre composant du protocole (figure 1A) . Deuxièmement, nous démontrons que la réticulation est sensible à l' addition de détergents (figure 1B), ce qui signifie la réticulation est spécifique aux protéines complexées et que la réactivité aléatoire en raison de la proximité sur le gel est minimisé. La figure 2 démontre que la méthode ne parvient pas à saisir respiratory complexe II, mais a par ailleurs une large applicabilité pour capturer à la fois des complexes solubles et liées à la membrane.
Figure 1: Validation de la méthode multimère-PAGE. (A) la capture de complexes protéiques par réticulation avec DSP est sensible dans le gel au clivage par dithiothretol (DTT). Multimère-PAGE a été réalisée sur l'ensemble du lysat de cerveau de rat sans (A1) ou (A2) 5 mM dithiothretol inclus dans la solution de trempe Tris / SDS. Le gel a été électrotransfert sur des membranes de PVDF, puis sondé pour la chaîne lourde kinésine. Une bande de poids moléculaire élevé est observé sur les deux membranes, ce qui correspond vraisemblablement à tout ou partie du complexe de protéine motrice kinésine. Il y a une bande supplémentaire se produisant à 126 kDa sur le transfert de DTT traité, la masse moléculaire du peptide de la chaîne lourde de kinésine. Dithiothréitol est un agent réducteur, et est capable d'inverser cross-liaison par clivage de la présente liaison disulfure dans DSP. L'agrégat de la kinésine est donc sensible au clivage par la TNT. (B) Protein capture complexe est sensible à l' addition de détergents dénaturant. Multimer-PAGE a été réalisée sur l'ensemble lysat de cerveau de rat comme décrit dans le texte, à l'exception des quantités croissantes (0 à 2%) de SDS (à gauche) ou Triton X-100 (à droite) ont été ajoutés aux échantillons de lysat, puis mis en incubation sur la glace pendant 30 min avant de charger le premier gel. Les gels finales ont été transférées sur des membranes de PVDF, et sondées pour α-synucléine. Au moins trois bandes d'un poids moléculaire croissant sont observées, correspondant à l'a-synucléine monomère, tétramère et octamère, respectivement. Les intensités de signal des bandes oligomères diminuent avec l'augmentation de la concentration de détergent, ce qui indique que l'efficacité de réticulation dépend de la conformation de la protéine native. S'il vous plaît cliquer ici pour view une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Mise en évidence de la capture de complexes protéiques en utilisant multimère-PAGE. (A) des complexes de protéines solubles et liés à la membrane ont été capturés lysat provenant de (A) lysat de cerveau de rat ou (B) mis en incubation avec 2% de digitonine pendant 1 h à 4 ° C, en effectuant multimère-PAGE comme décrit dans le texte. Les gels ont ensuite été les membranes et effacés de PVDF sondé pour les composants de divers complexes. les espèces de poids moléculaire élevé sont observés sur la membrane sondé pour la tubuline acétylée, qui est connue pour stabiliser les microtubules. Dynéine et la kinésine sont des complexes de protéines de sous-unités multiples moteur ayant des poids moléculaires de 1,5 MDa et 380 kDa, respectivement. Les membranes Blotted pour les composants de ces complexes montrent des espèces de haut poids moléculaire. En outre, multimère-PAGE avec succès captured le dimère HSP90. a-synucléine forme des tétramères et octamères, ainsi que des neurotoxiques oligomères de haut poids moléculaire. Le octamère et d'une série d'espèces de poids supérieur sont visibles sur la membrane Blotted. dimérisation VDAC est également observée. les espèces de poids moléculaire élevé sont détectés sur les membranes Blotted pour des composants de complexes mitochondriaux I et IV. Cependant, la membrane épongé pour SDHA, un membre du complexe II, ne démontre aucune bande appropriée de haut poids moléculaire. AcetTUB: acétylée α-tubuline; βTUB: β-tubuline; Dynein: chaîne lourde dynein; HSP90: protéine de choc thermique 90; Kinésine: kinésine chaîne lourde; NDUFS3: centre fer-soufre de 3 complexe mitochondrial I; VDAC: Porin; SDHA: succinate déshydrogénase du complexe mitochondrial II; COXIV: cytochrome C oxydase du complexe mitochondrial IV. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Organigramme général multimère-PAGE. (A) préparer un lysat de tissu en utilisant des procédés non dénaturants, tels que l' homogénéisation dans du tampon d'échantillon BN-PAGE. (B) de lysat Pipetter dans le gel BN-PAGE, puis effectuer une électrophorèse (150 volts) dans un tampon de course BN-PAGE. Laisser l'échantillon à migrer jusqu'à ce que le front de colorant ait migré ~ 2 cm dans le gel de résolution. (C) retirer la couche d'empilage et la partie non utilisée de la couche de résolution. (D) Immerger la bande de gel dans du PBS, et équilibrer avec agitation par secousses pendant 30 min. (E) Retirer le PBS et re-plonger la bande de gel dans du PBS contenant 2,5 mM DSP. Agiter pendant 30 min. (F) éliminer la solution DSP, puis ré-immerger la bande de gel dans 375 mM Tris contenant 2% de SDS, et agiter pendant 30 min. Complexes présents dans la bande de gel sont maintenant stabilisés par crosfurtif. ( G ) Tourner la bande de gel 180 ° et la couler dans un nouveau gel SDS-PAGE. Inclure les couches d'empilement et de résolution. ( H ) Résoudre l'échantillon par électrophorèse (120 volts). ( I ) Retirez la bande de gel et la couche d'empilage, puis analysez la couche de résolution si nécessaire. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les interactions protéine-protéine sont importantes pour tous les êtres vivants réalisent la tâche. En raison de cela, ils font l'objet d'un examen minutieux et de la recherche. Multimère-PAGE est un nouveau procédé pour la saisie, la séparation et l'analyse d'une large gamme de complexes de protéines. Nous avons déjà démontré son applicabilité à l' étude oligimerization de la protéine associée à la maladie α-synucléine 11. Cependant, il est extensible à de nombreux complexes de protéines, comme le montre la figure 2. Par rapport à d'autres méthodes d'étude des complexes de protéines, multimère-PAGE est avantageuse en raison de sa simplicité et de concision. Le temps de prélèvement de tissu à séparer complètement gel SDS est d'environ 8 h. Étant donné que la détection peut se faire par transfert de type occidental, le protocole peut être effectué sur lysat de tissu non modifié, avec des limites de détection beaucoup plus faibles que ceux qui sont associés à des expériences de traction vers le bas. De plus, le mieux équipé de la biologie moléculaire laboratoires seront en mesure d'effectuer la technique avec peu d'investissement initial. Comme on le verra plus loin, la plupart des défis associés à multimère-PAGE est livré avec le dépannage et l'optimisation de la méthode pour chaque complexe protéine étudiée.
Alors que multimère-PAGE doit être accessible à la plupart des biologistes moléculaires, son succès dépend de la compétence et de l'expérience du chercheur. Critique, la découpe et re-coulée de la bande de gel BN dans le nouveau gel SDS doit être fait avec soin. Il est important d'orienter la bande de gel de telle sorte que l'électrophorèse des protéines provoque à migrer dans le gel SDS dans des bandes parallèles. Si la bande de gel est jeté de travers, les bandes de protéines vont migrer dans l'autre et les données seront perdues. En particulier pour les grands ensembles, la rotation de la bande de gel avant la coulée dans le gel SDS-PAGE est tout aussi important. Cela donne plus grands complexes, qui peuvent ne pas avoir migré très loin dans le gel BN-PAGE, plus de temps pour être tiré dans la résolution layer du gel SDS-PAGE. Fait important, les modifications apportées à la taille des protéines et des caractéristiques physiques causées par réticulation doivent également être pris en considération lors de l'analyse. Par exemple, certaines protéines de faible poids moléculaire, tels que les α-synucléine, ne sont pas bien conservés sur des membranes de PVDF, mais leurs oligomères réticulés sont 12. Cela peut confondre l'analyse comparative, et doit être pris en compte.
Lors de la séparation par un complexe multimère-PAGE pour la première fois, il est important de valider la méthode. Nous proposons trois tests de validation / dépannage. Tout d'abord, faire en sorte que le peptide d'intérêt migre dans le gel BN en suivant le protocole multimère-PAGE jusqu'à ce que l'excision de la bande de gel, puis arrêter, effacer la bande sur une membrane de PVDF, et d'une sonde pour la sous-unité d'intérêt. S'il n'y a pas de signal, le complexe n'a probablement pas migré dans le gel BN, ce qui signifie qu'il devrait être plus poreux, ou l'échantillon devrait être autorisé à migrer plus loin dans le resolvCouche d'impression. La présence d'un signal confirme que la sous-unité au moins non liée a migré dans le gel. À ce stade, il sera difficile de confirmer la présence du complexe complet. Si la détection de la sous-unité est détectée dans la bande de gel BN, passez au deuxième test. Effectuez multimer-PAGE sans étape de réticulation, puis débrancher sur une membrane PVDF et une sonde pour la sous-unité. La sous-unité devrait se dénaturer en présence de SDS et migrer normalement dans le gel SDS. Si cela ne se produit pas, il y a probablement un problème avec la technique du chercheur. La bande de gel BN peut avoir été mal coupée, laissant certaines protéines derrière, ou le gel SDS peut avoir été jeté incorrectement. Enfin, effectuez la multimer-PAGE avec une étape de clivage entre liaisons incluse, puis la tache et la sonde, comme indiqué dans la Figure 1 . Cela confirme que l'agrégation du complexe est due à l'ajout de DSP et n'est pas une conséquence inattendue d'une autre partie du protocole multimer-PAGE. Le clivage devrait entraîner une réductiond-intensité globale bande et une bande de monomères de sous-unité d'intensité accrue sur l'image. Si aucun groupe global est vu de multimère-PAGE normale, mais la bande monomères augmente en intensité lorsque DSP est clivé, le complexe a probablement fait sur le gel SDS, mais n'a pas réussi à migrer dans la couche de résolution.
Dans son état actuel, multimère-PAGE est applicable à de nombreux complexes de protéines, mais pas un one-size-fits-all protocole. Il a besoin susceptibles d'être modifiées pour chaque complexe d'intérêt. Un problème commun est démontré dans la figure 2: les complexes capturés sont souvent si grandes qu'elles migrent à peine sur SDS-PAGE. Cela peut être géré en changeant la porosité du gel SDS ou électrophorèse effectuer pendant de longues périodes de temps. Une complication supplémentaire est la présence occasionnelle de plus de deux bandes sur le gel. Une réaction incomplète avec l'agent de réticulation peut résulter en une distribution de bandes de poids moléculaires intermédiaires 13. Cela peut rendre difficile pour déterminer si de multiples bandes sont représentatives de produits intermédiaires oligomères physiologiquement importants, ou simplement conséquences non intentionnelles de réticulation partielle. Pour les protéines membranaires qui doivent être solubilisés avant l'analyse, il est également important de considérer l'impact que le choix de détergent a sur les comportements des complexes protéiques. Le détergent utilisé pour solubiliser les protéines membranaires affecte leurs conformations, des associations avec des partenaires de liaison et les fonctions 14, 15. Choix de détergent a également un impact l'efficacité de la réticulation 16. Ainsi, il est probable que les conditions idéales solubilisants varieront en fonction du complexe à l'étude.
Multimère-PAGE échoue de temps en temps pour capturer un complexe, comme cela est représenté sur la tache SDHA sur la figure 2. succinate déshydrogénase fait partie du complexe II mitochondrial 124 kDa, ce qui est assez petit qu'il doit se déplacer facilement dans le gel.Qu'il n'a pas été détecté indique que multimère-PAGE était incapable de le capturer. Des cas comme ceux-ci ont de nombreuses explications possibles. La plupart des réactifs de reticulation contiennent deux extrémités réactives, qui forment des liaisons covalentes avec des chaînes latérales d'acides aminés. L'efficacité avec laquelle les complexes protéiques capture des réactifs de reticulation dépend de leur accessibilité pour les résidus réactifs. Dans le cas du DSP, la réticulation est effectuée par acylation de groupes amino aliphatiques primaires et secondaires exposés au solvant, habituellement les groupes e-amino de la lysine 17. Les résidus lysine se trouvent normalement sur la surface de la protéine, mais leur séquestration occasionnelle dans les centres hydrophobes diminue l'efficacité de la reticulation 13. Les sous - unités de complexe II sont enterrés dans la membrane mitochondriale et peuvent rester inaccessibles aux DSP, même après 18 digitonine avec Solubilisation. Très grandes et complexes d'emballage à forte densité, comme oligome amyloïders, peuvent également limiter la disponibilité des résidus de lysine de surface pour des réactifs de reticulation. En conséquence, ces types d'assemblages de protéines peuvent ne pas être compatibles avec multimère-PAGE. Il est également possible que le bleu de Coomassie, qui se lie à des régions hydrophobes et des résidus cationiques, persiste après équilibrage dans du PBS et les blocs de réticulation dans certains cas 19. Cela pourrait réduire ou éliminer la détection des oligomères touchés par multimère-PAGE. Ainsi, la méthode n'est pas un test universel pour caractériser toutes les associations de protéines, et ne doit pas être envisagée si désiré dans la quantification. Cependant, multimère-PAGE est un peu coûteux, outil relativement rapide pour l'analyse des complexes de protéines, et peut être considéré aux côtés d'autres moyens établis.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Pris en charge par le NIH / NIDA DA034783. Nous tenons à remercier Bryan A. Killinger d'assistance technique avec le multimère-PAGE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
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