Summary
Ett förfarande för stabilisering och separering nativa proteinkomplex från omodifierad vävnad lysat med användning av en amin-reaktivt protein tvärbindare kopplad till en ny tvådimensionell polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) system presenteras.
Abstract
Det finns många väl utvecklade metoder för att rena och studera enstaka proteiner och peptider. Dock är de flesta cellulära funktioner som utförs av nätverk av interagerande proteinkomplex, som ofta är svåra att undersöka eftersom deras bindning är icke-kovalent och lätt störs av reningstekniker. Detta arbete beskriver ett förfarande för stabilisering och separera nativa proteinkomplex från omodifierad vävnad med användning tvådimensionell polyakrylamidgelelektrofores. Vävnads lysatet laddades på en icke-denaturer blå-nativ polyakrylamidgel, då en elektrisk ström appliceras tills proteinet migrerar ett kort avstånd in i gelén. Gelén remsan innehållande den migrerade proteinet sedan ut och inkuberades med aminreaktiva tvärbindningsreagens ditiobis (succinimidylpropionat), vilka är kovalent stabiliserar proteinkomplex. Gelén remsa innehållande tvärbundna komplexen gjutes därefter in i en natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel, och than komplexen separeras helt. Metoden bygger på tekniker och material som är kända för de flesta molekylärbiologer, vilket betyder att den är billig och lätt att lära. Även om det är begränsad i sin förmåga att på lämpligt sätt skilja extremt stora komplex, och har inte varit allmänt framgångsrika metoden kunde fånga en mängd olika väl studerade komplex, och är sannolikt tillämplig på många system är av intresse.
Introduction
Normal cellulär funktion är beroende av protein-proteininteraktioner 1, 2. Som ett resultat, är humana sjukdomar ofta kännetecknas av störningar i montering och uppförande av olika proteinkomplex 3. Förmågan att karakterisera sådana interaktioner är därför kritisk. Nuvarande medel för att detektera dessa interaktioner kräver rening av målproteiner, ofta följt av neddragnings av deras samverkande partner. Konventionell rening åstadkoms genom differentiell centrifugering, utfällning, och / eller kromatografi 4. Dessa metoder är tidskrävande, måste ändras för varje målprotein, och resulterar ofta i låga utbyten. Moderna reningsmetoder involverar fusion av peptidmärkningar till målproteiner, följt av immunfällning eller extraktion på kolonner laddade med pärlor bundna till en infångningsmolekyl 5,"> 6. Även om detta är töjbart till många proteiner, det kräver sekvens modifiering av målet, kan resultera i konstruktioner som skiljer sig i affinitet för sina vanliga bindningspartners. Den känsliga naturen hos vissa protein-protein-interaktioner innebär denna metod kanske inte är tillämpliga många scenarier. Dessutom rullgardins analyser som används för att kartlägga protein-proteininteraktioner kan inte fånga en korrekt cellulär bild, på grund av begränsade frihetsgrader och främmande nivåer av betesproteinet.
Helst skulle proteinkomplex påvisas i deras infödda stater, utan behov av rening eller pull-down. Blå nativ polyakrylamidgelelektrofores (BN-PAGE) utvecklades som en mindre-denaturerande alternativ till natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), och gör det möjligt för separation av vissa proteiner och komplex från biologiska prover 7. Emellertid proteiner i BN-PAGE separera baserad på en larGE antal variabler, inklusive storlek, laddning, tredimensionell struktur, och association med andra molekyler. Samverkan mellan dessa faktorer resulterar ofta i samtidig separation av proteiner, aggregatbildning och dålig proteinband upplösning. Tvådimensionell infödda polyakrylamidgelelektrofores löser en del, men inte alla, av dessa 8 problem.
Att kringgå de komplikationer i samband med nativt separation, vissa författare använder aminreaktiva tvärbindningsreagens, såsom ditiobis (succinimidylpropionat) (DSP), för att fånga proteinkomplex i vävnadslysat 4. Dessa behandlade lysat kan sedan denatureras och separerades genom SDS-PAGE, och samtidigt bevara den nativa storlek och makeup av proteinkomplex. Men eftersom tvärbindningsreagenser reagerar bygger på närhet av en molekyl till en annan, och proteiner i vävnads lysat har många frihetsgrader och kan stokastiskt interagera, ospecifik bakgrund kors-linking kan vara hög, särskilt i koncentrerade prover. Detta kan leda till svår tolka resultat.
Här visar vi användningen av en hybrid BN-PAGE / SDS-PAGE-metoden, benämnd multimer-polyakrylamidgelelektrofores (multimeren-PAGE), för att separera och detektera proteinaggregaten i komplexa blandningar. Initialt cellysat suspenderad i polyakrylamidgel via BN-PAGE. Lysatet innehållande gelén bringas sedan att reagera med tvärbindningsreagens DSP. Pseudo-immobiliseras och något separerade på gelén, proteiner är mycket mindre sannolikt att reagera ospecifikt, vilket innebär bakgrund tvärbindare reaktiviteten minskas. Efter tvärbindning, är de gelbanden skars ut och separeras via SDS-PAGE. Den erhållna gelén kan sedan analyseras på något sätt typiskt är associerade med polyakrylamidgelelektrofores. Denna metod tillåter för separation och detektion av nativa proteinkomplex i omodifierad vävnad lysat, utan behov av ytterligare rening eller pull-down.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vävnadsberedning
- Förbereda 10 ml 4x BN-PAGE-provbuffert (200 mM Bis (2-hydroxietyl) amino-tris (hydroximetyl) metan (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% vikt / volym glycerol, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ).
OBS: Denna stamlösning kan framställas i förväg och lagras vid 4 ° C. - Späd 250 | il av 4x provbuffert i 750 pl dH 2 O innehållande 1 x kommersiell proteasinhibitorcocktail. Vortex och chill på is.
- Homogenisera 20 mg av målvävnaden i en ml 1x iskall BN-PAGE-provbuffert med 30 slag av en ren dounce homogenisator.
OBS: För denna demonstration experiment är målvävnaden hela råtthjärnvävnad. Efter homogenisering, kan proverna behandlas med mild detergent såsom 2% digitonin för att solubilisera och medge elektrofores av membranproteiner. - Överföra homogenat till en 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 14000 xg under 30 min för att pelletera olösliga cellulära innehållet. after centrifugering, dekantera supernatanten i ett rent rör på is.
- Följ tillverkarens instruktioner för att mäta överstående proteinkoncentration med användning av bicinkoninsyra (BCA) eller liknande protein kvantifiering analys.
- Om provet homogenat (er) innehåller detergent, tillsätt en mängd av 5% Coomassie Blue G-250 i vattenlösning tillräcklig för att bringa homogenatet lösningen till 0,25% Coomassie.
2. BN-PAGE
- Späd 25 ml 20x blå nativa (BN) elektroforesbuffert lager (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M tricin, pH 6,8) till 475 ml dH 2 O innehållande 0,002% Coomassie Blue för att göra 500 ml 1x löpbufferten.
- Om prover innehåller detergent, i stället göra 250 ml 1x rinnande buffert innehållande 0,02% Coomassie och ytterligare 250 ml innehållande ingen.
- Chill-buffert (ar) till 4 ° C.
- Rengör och montera en polyakrylamidgel hälla kassett enligt tillverkarens instruktioner.
- Efter gelerna har polymeriserats, skölj kassett med dH 2 O och montera elektroforesapparaten enligt tillverkarens instruktioner.
- Ta väl kam och fyll brunnarna med 1 x BN-PAGE rinnande buffert. Undvika att fylla hela den inre kammaren med buffert tills prover laddas.
- Om prover innehåller detergent, fyll brunnarna med buffert innehållande 0,02% Coomassie Blue.
OBS: Utför steg 2,7-2,9 vid 4 ° C.
- Om prover innehåller detergent, fyll brunnarna med buffert innehållande 0,02% Coomassie Blue.
- Med användning av gel-lastning tips, pipettera en volym av homogenatet innehållande 20 ^ g protein till de önskade brunnarna. Pipettera en ekvivalent volym av 1x BN-PAGE-provbuffert i alla oanvända brunnar.
NOTERA: Använd proteinkoncentrationen bestämdes från BCA-analys för att beräkna den lämpliga volymen av homogenatet för att lägga tillbrunnarna. - Efter prover laddas, fylla den inre kammaren med 1x BN-PAGE rinnande buffert. Var noga med gelen är helt nedsänkt i buffert. Nästa, fylla den yttre kammaren med 1x rinnande buffert till den nivå som anges av tillverkaren.
- Om prover innehåller detergent, fylla den inre kammaren med 1x buffert innehållande 0,02% Coomassie Blue, och den yttre kammaren med färgämnesfria 1x löpbufferten.
- Ansluta elektroderna till kraftförsörjningen, och elektrofores proteinerna i gelén vid 150 V tills färgbandet fortskrider ~ 2 cm in i lösa skikt. Stanna och koppla bort strömförsörjningen.
3. Tvärbindning
OBS: Utför steg 3,1-3,6 vid 4 ° C.
- Isär elektroforesapparaten, och separera glasrutor av gelén kassetten. Ta bort och kasta staplingen skiktet.
- Skär försiktigt gelen strax under den nedre kanten av färgfronten. TaBryr dig om att göra denna snitt så smidig och rak som möjligt, och släng sedan bort det oanvända stycket gel. Detta kommer att lämna en ~ 2 cm bred horisontell remsa av polyakrylamidgel, som kommer att innehålla allt protein i homogenatprovet.
- Torka bort oanvända delar längs kanterna på gelremsan.
- Placera remsan försiktigt i 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en liten behållare och blanda försiktigt med nutrition i 30 minuter för att jämvikta.
- Kassera och byt ut PBS med ytterligare 10 ml efter jämviktning. Pipett 500 μl 25 mM DSP löst i dimetylsulfoxid i PBS och fortsätt att blanda som ovan (steg 3.4) i 30 min.
- Häll av DSP-lösningen. Tillsätt 10 ml 0,375 M tris (hydroximetyl) aminometanhydroklorid (Tris-HCl), pH 8,8, innehållande 2% natriumdodecylsulfat (SDS) för att släcka den oreagerade DSP. Fortsätt nutering i 15 min.
4. SDS-PAGE
- Medan gelbandet släcker, förbereda SDS-PAGE gel lösningar enligt standardmetoder 9. Lägg inte till polymerisations reagenser.
- Efter släckning, återlämna ΒΝ gelremsa till rumstemperatur och kasta remsan in i en ny gelkassett.
- För att göra detta, försiktigt plocka upp gelen och placera den på en ren gel kassettdistansplattan.
- Orient remsan så botten av färgfronten är närmast till början av ny kassett (dvs den sida som reste längst under BN-PAGE bör närmast till början av den nya kassetten; gelén remsan bör vändas från sitt tidigare orientering). Se figur 3.
- Placera remsan så att dess övre kant ligger även med där den övre kanten av täckplattan kommer att vara (dvs., det kommer att vara på toppen av den nya gel). Se till färgfronten är parallell med de horisontella kanterna av glasplattan.
- Driva ena sidan av den utskurna remsan mot en av distansväggar, som ger utrymme på than andra sidan för gel som skall hällas och en proteinstandard eller stege som skall lastas.
- Om den nedre kanten av gelen remsan innehåller några ojämna områden, försiktigt skära bort dem. Om de är närvarande, kommer de fälla bubblor under gel hälla.
- När väl gelén remsan är rätt placerad, låg täckplattan över distansplattan. Applicera ett lätt tryck för att trycka ut eventuella luftbubblor.
- Fortsätta att montera gelén-hällapparat enligt tillverkarens instruktioner.
- Lägga polymerisationsbetingelser reagens för upplösningsgelen buffert, och häll det i den förberedda gelkassetten, med användning av en serologisk pipett. Fylla gelén kassetten till ~ 2 cm under den utskurna BN-PAGE-gel remsa, för att lämna utrymme för staplingen skiktet.
- Tillsätt 100 pl butanol över toppen av den hälldes gelén, och tillåter 30 min för polymerisation av upplösningsskiktet. Häll av butanol.
- Lägga polymerisationsbetingelser reagens för staplingen gellösningen. Med hjälp av en serological pipett, häll staplingen skiktet för att fylla alla återstående tomt utrymme i gelén kassetten.
- Luta gelkassetten som staplingen skiktet hälls så den fyller utrymmet under gelremsa, och luftbubblor inte fångas.
- Som uppstaplingsgelen buffert fyller det tomma utrymmet nedanför gelremsa, gradvis återgå gelkassetten till nivå fot.
- Fortsätt att fylla det tomma utrymmet bredvid den utskurna gelén remsan med uppstaplingsgelen buffert, tills den nästan rinner över.
- Tillåta stapling skiktet polymerisera under 30 min.
OBS: 10x SDS-PAGE-rinnande buffert (250 mM tris (hydroximetyl) aminometan (tris), 1,9 M glycin, 1% SDS), medan gelén polymerisera. Detta kan också göras i förväg och lagras vid rumstemperatur. - Späd 50 ml 10X SDS-PAGE-löpbuffert lager i 450 ml dH 2 O för att göra 1x arbetsbuffert.
- Efter staplingen skiktet har polymeriserats, avlägsna gelkassetten från hällapparat, skölj med dH 2 O, och montera elektroforesapparaten enligt tillverkarens instruktioner.
- Fylla den inre kammaren helt med 1x SDS-PAGE-rinnande buffert, sedan fylla den yttre kammaren till den nivå som anges av tillverkaren.
- Ladda utrymmet intill den utskurna gelén remsan med en molekylviktstege eller lämplig proteinstandard.
- Fästa elektroderna till strömförsörjningen och elektrofores proverna vid 120 V. När Coomassie färgämnet rinner av gelén, stoppa och koppla bort strömförsörjningen.
- Analysera gelén med användning av standardmetoder för elektroblot och proteindetektion genom antikroppsbindning 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna demonstration experiment multimer-PAGE utförs på hela råtthjärna lysat. De resulterande separerade proteinerna blottades på polyvinyliden diflouride (PVDF) membran, och sonderades sedan med antikroppar mot proteiner som är kända för att bilda komplex. Figur 1 visar en validering av protokollet av två medel. Först visar vi att de tvärbundna proteiner är klyvbar genom tillsats av ett reduktionsmedel, vilket innebär de observerade högre molekylvikt är bildade av det tvärbindande reagens, och är inte på grund av någon annan komponent i protokollet (Figur 1A) . Andra, visar vi att tvärbindning är känslig för tillsats av detergenter (Figur 1B), vilket innebär att tvärbindningen är specifik för komplexbundna proteiner och att slumpmässiga reaktivitet beror på närhet på gelén minimeras. Figur 2 demonstrerar att metoden misslyckas med att fånga respIrriterande komplex II men har annars stor tillämpbarhet för att fånga både lösliga och membranbundna komplex.
Figur 1: Validering av multimer-PAGE-metoden. ( A ) Fångning av proteinkomplex genom in-gel-tvärbindning med DSP är känslig för klyvning av ditiotreol (DTT). Multimer-PAGE utfördes på hela råtthjärna-lysat utan (Al) eller med (A2) 5 mM ditiotreol inkluderat i Tris / SDS-släckningslösningen. Gelén elektroblottades på PVDF-membran och undersöktes sedan för kinesisk tung kedja. Ett högmolekylärt band observeras på båda membranen, vilket sannolikt motsvarar hela eller en del av kinesinmotorproteinkomplexet. Det finns ett ytterligare band som uppträder vid 126 kDa på den DTT-behandlade blottet, molekylmassan hos kinesins tunga kedjepeptid. Ditiotreitol är ett reduktionsmedel och kan vända cross bindning genom spjälkning av disulfidbindningen som finns i DSP. Den kinesin aggregat är därför känslig för klyvning genom DTT. (B) Protein komplex infångning är känslig för tillsats av denaturerande detergenter. Multimer-PAGE utfördes på hel råtthjäma lysat såsom beskrivs i texten, med undantag av ökande mängder (0 till 2%) av SDS (vänster) eller Triton X-100 (till höger) sattes till lysatprover, och inkuberades därefter på is under 30 min före laddning av den första gelén. De slutliga geler blottades på PVDF-membran, och sonderades för α-synuklein. Minst tre band av ökande molekylvikt observeras, vilket motsvarar till a-synuklein-monomer, tetramer, och oktamer, respektive. Signalintensiteterna hos de oligomera banden minskar med ökande tvättmedelskoncentration, vilket indikerar att tvärbindning effektivitet är beroende av nativt protein konformation. Klicka här för att view en större version av denna figur.
Figur 2: Demonstration av infångning av proteinkomplex med användning av multimer-PAGE. (A) Lösliga och membranbundna proteinkomplex fångades från (A) hel råtthjäma lysat eller (B) lysat inkuberades med 2% digitonin under 1 h vid 4 ° C, genom att utföra multimer-PAGE såsom beskrivits i texten. Gelerna blottas sedan och PVDF-membran sonde för komponenter av olika komplex. Hög molekylvikt observeras på membranet sonde för acetylerad tubulin, som är känd för att stabilisera mikrotubuli. Dynein och kinesin är multiunderenhetsmotorn proteinkomplex med molekylvikter på 1,5 MDa och 380 kDa, respektive. Membranen blottade för komponenter av dessa komplex visar hög-molekylvikt. Dessutom, en multimer-PAGE framgångsrikt captured den HSP90 dimer. a-synuklein bildar tetramerer och oktamerer, liksom neurotoxiska högmolekylära oligomerer. Oktameren och en strimma av högre-vikt ses på blottade membranet. VDAC dimerise också observerats. Hög molekylvikt detekteras på membranen blottade för komponenter av mitokondriella komplex I och IV. Emellertid, blottades membranet för SDHA, en medlem av komplex II, visar inte någon lämplig hög molekylvikt band. AcetTUB: acetylerade α-tubulin; βTUB: β-tubulin; Dynein: dynein tung kedja; HSP90: värmechockprotein 90; Kinesin: kinesin tung kedja; NDUFS3: järn-svavelcenter 3 av mitokondriell komplex I; VDAC: porin; SDHA: succinatdehydrogenas av mitokondriell komplex II; COXIV: cytokrom C oxidas av mitokondriell komplex IV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Allmänt multimer-PAGE flödesschema. (A) Förbered vävnads lysat med användning av icke-denaturerande metoder, såsom homogenisering i BN-PAGE-provbuffert. (B) Pipettera lysat i BN-PAGE-gel, sedan utföra elektrofores (150 volt) i BN-PAGE-löpbuffert. Tillåta provet att migrera tills färgen har migrerat ~ 2 cm in i upplösningsgelen. (C) Ta staplingen skiktet och oanvända delen av upplösningsskiktet. (D) Sänk gelén remsan i PBS, och jämvikt med skakning under 30 min. (E) Avlägsna PBS, och åter dränka gelremsa i PBS innehållande 2,5 mM DSP. Skaka i 30 min. (F) Ta bort DSP-lösning, sedan åter dränka gelen remsan i 375 mM Tris innehållande 2% SDS, och skaka i 30 min. Komplex som är närvarande i gelén remsan nu stabiliseras genom cross bindning. (G) Rotera gelén remsan 180 ° och göts till en ny SDS-PAGE-gel. Inkluderar både stapling och lösa skikten. (H) Lös prov genom elektrofores (120 volt). (I) Ta bort gelremsa och stapling skikt, sedan analysera lösa skikt efter behov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-proteininteraktioner är viktiga för varje uppgift levande varelser genomföra. På grund av detta, de är föremål för intensiv granskning och forskning. Multimer-PAGE är en ny metod för att ta, separering, och analysera ett brett spektrum av proteinkomplex. Vi har tidigare visat sin tillämpbarhet på studera oligimerization av sjukdomen-associerat protein α-synuklein 11. Emellertid är det töjbara att många proteinkomplex, såsom visas i figur 2. Jämfört med andra metoder för att studera proteinkomplex, är multimer-PAGE fördelaktig på grund av dess enkelhet och korthet. Tiden från vävnadsprov för att helt separeras SDS-gel är ungefär åtta timmar. Eftersom detektering kan göras genom typisk western blöt, kan protokollet utföras på omodifierad vävnad lysat, med detektionsgränser mycket lägre än de som är associerade med pull-down experiment. Dessutom, mest välutrustade molekylärbiologi laboratories kommer att kunna utföra tekniken med liten initial investering. Såsom diskuteras senare, de flesta av utmaningen associerad med multimer-PAGE kommer med felsökning och optimera metoden för varje protein-komplex studerades.
Medan multimer-sidan ska vara tillgänglig för de flesta molekylärbiologer, är dess framgång beror på forskarens skicklighet och erfarenhet. Kritiskt måste skär och återgjutning av BN gel remsan i nya SDS-gel göras med omsorg. Det är viktigt att orientera gelremsa så att elektrofores orsakar proteiner att migrera in i SDS-gelen i parallella band. Om gelén remsan gjuts krokiga, kommer proteinbanden migrera in i varandra och data kommer att förloras. Särskilt för stora komplex, är likaledes viktigt att rotera gelremsa före gjutning in den i SDS-PAGE-gel. Detta ger större komplex, som inte kan ha migrerat mycket långt in i BN-PAGE-gel, mer tid att dras in i upplösnings layer av SDS-PAGE-gel. Viktigare, bör ändringarna i proteinstorlek och fysiska egenskaper som orsakas av tvärbindning också beaktas under analys. Till exempel, vissa lågmolekylära proteiner, såsom α-synuklein, är inte väl kvarhålles på PVDF-membran, men deras tvärbundna oligomerer är 12. Detta kan förbrylla jämförande analys och måste beaktas.
När separera en komplex av multimer-PAGE för första gången, är det viktigt att validera metoden. Vi föreslår tre validering / felsökningstester. Först att peptiden av intresse migrerar in i BN-gel genom att följa multimeren-PAGE protokoll tills excision av gelén remsan, sedan stoppa, blot remsan på PVDF-membran, och sonden för subenheten av intresse. Om det inte finns någon signal, den komplexa sannolikt inte migrera in i BN gel, vilket betyder att den bör göras mer porös, eller provet bör tillåtas migrera längre in i resolving skiktet. Närvaron av en signal bekräftar att åtminstone obundet subenheten migrerat in i gelén. I detta skede kommer det att bli svårt att bekräfta förekomsten av hela komplexet. Om bevis av subenheten detekteras i BN gelremsa, gå vidare till det andra testet. Utföra multimer-PAGE utan ett tvärbindningssteg, sedan blot på PVDF-membran och sonden för subenheten. Subenheten bör denaturera i närvaro av SDS och migrera normalt in i SDS-gel. Om detta inte sker, kommer det troligtvis en del problem med forskaren teknik. BN-gel remsan kan ha dåligt skära, vilket lämnar vissa proteiner bakom eller SDS-gelen kan ha gjutits felaktigt. Slutligen utför multimer-PAGE med en inkluderad tvärbindare klyvningssteg, sedan blot och sond, såsom diskuteras i fig 1. Detta bekräftar aggregering av komplexet beror på tillsats av DSP, och inte en oväntad konsekvens av någon annan del av multimeren-PAGE-protokollet. Klyvningen bör resultera i en sänkad-intensitet aggregat bandet och en ökad intensitet subenhet monomer band efter avbildning. Om ingen aggregatband ses från normal multimer-PAGE, men monomer bandet ökar i intensitet när DSP klyvs, har komplexet troligen gjort det till SDS-gel, men misslyckades med att migrera in i upplösningsskiktet.
I sitt nuvarande tillstånd, är multimer-PAGE applicerbar på många proteinkomplex, men är inte en one-size-fits-all protokollet. Det behöver sannolikt att ändras för varje komplex av intresse. Ett vanligt problem visas i Figur 2: fångade komplex är ofta så stora att de knappt vandrar på SDS-PAGE. Detta kan hanteras genom att ändra porositet SDS-gelen eller utföra elektrofores under längre tidsperioder. En ytterligare komplikation är den enstaka närvaron av mer än två band på gelén. Ofullständig reaktion med tvärbindare kan resultera i en fördelning av mellanliggande molekylviktsbanden 13. Detta kan göra det difficult att bestämma om flera band är representativa för fysiologiskt viktiga oligomera mellanprodukter, eller helt enkelt oavsiktliga konsekvenser av partiell tvärbindning. För membranproteiner som måste solubiliseras före analys, är det också viktigt att beakta effekterna att valet av tvättmedel har på beteenden av proteinkomplex. Detergenten används för att solubilisera membranproteiner påverkar deras konformationer, föreningar med bindningspartners, och fungerar 14, 15. Detergent val påverkar också effekten av tvärbindning 16. Således är det troligt att de ideala solubiliserande förhållandena kommer att variera med den komplexa som studeras.
Multimer-PAGE ibland misslyckas med att fånga in ett komplex, såsom visas på SDHA blotten i figur 2. Succinat dehydrogenas är en del av 124 kDa mitokondriella Complex II, som är tillräckligt liten för att den skall röra sig lätt in i gelén.Att det inte upptäcktes indikerar att multimer-PAGE kunde inte fånga den. Fall som dessa har många möjliga förklaringar. De flesta tvärbindande reagens innehåller två reaktiva ändar, vilka bildar kovalenta bindningar med aminosyrasidokedjor. Den effektivitet med vilken tvärbindningsreagens fånga proteinkomplex är beroende på deras tillgänglighet till reaktiva rester. I fallet med DSP, är tvärbindning åstadkoms genom acylering av lösningsmedelsexponerade primära och sekundära alifatiska aminogrupper, vanligtvis s-aminogrupper i lysin 17. Lysinrester finns normalt på proteinytan, men deras tillfälliga sekvestrering i hydrofoba centra minskar effektiviteten av tvärbindning 13. Underenheterna av komplex II är begravda i det mitokondriella membranet, och kan förbli otillgängliga för DSP, även efter solubilisering med digitonin 18. Mycket stora och tätt-packning komplex, såsom amyloid oligomers, kan också begränsa tillgängligheten av ytan lysinrester till tvärbindande reagens. Som ett resultat, kan dessa typer av proteinaggregaten inte är kompatibla med multimer-PAGE. Det är också möjligt att Coomassie Blue, vilken binder till hydrofoba regioner och katjoniska rester, dröjer efter ekvilibrering i PBS och blockerar tvärbindning i vissa fall 19. Detta kan minska eller eliminera detektering av drabbade oligomerer av multimer-PAGE. Sålunda, är metoden inte en universell analys för att karakterisera alla proteinföreningar, och bör inte anses där kvantifiering i önskas. Emellertid är multimer-PAGE ett billigt, relativt snabba verktyg för att analysera proteinkomplex, och kan betraktas tillsammans med andra etablerade medel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Med stöd av NIH / NIDA DA034783. Vi tackar Bryan A. Killinger för tekniskt stöd med multimeren-PAGE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H.
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , CRC Press. Boca Raton. (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
