Summary
यहाँ, हम इन विट्रो प्रयोग के लिए प्रसव के बाद माउस पिल्ले से microglia अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल (दिन 1) प्रस्तुत करते हैं। अलगाव की इस तात्कालिक विधि उत्पन्न करता है दोनों उच्च उपज और पवित्रता, वैकल्पिक तरीकों में एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि microglial जीव विज्ञान का वर्णन करने के उद्देश्य से व्यापक रेंज प्रयोग अनुमति देता है।
Abstract
Microglia केंद्रीय तंत्रिका तंत्र अपमान करने के लिए प्राथमिक प्रतिसाददाताओं कर रहे हैं; हालांकि, ज्यादा neuroinflammation को विनियमित करने में उनकी भूमिका के बारे में अनजान बनी हुई है। Microglia mesodermal कोशिकाओं है कि भड़काऊ तनाव सर्वेक्षण में मैक्रोफेज की तरह ही काम कर रहे हैं। शास्त्रीय (एम 1 प्रकार) और वैकल्पिक (M2 प्रकार) मैक्रोफेज के सक्रियण भी बेहतर अंतर्निहित परस्पर क्रिया इन समलक्षणियों ऐसे पार्किंसंस, अल्जाइमर और हंटिंगटन रोग के रूप में neuroinflammatory की स्थिति में है को समझने के प्रयास में microglia के लिए बढ़ा दिया गया है। इन विट्रो प्रयोगों में प्राथमिक microglia का उपयोग तेजी से और विश्वसनीय परिणाम है कि इन विवो पर्यावरण के लिए बढ़ाया जा सकता है प्रदान करता है। हालांकि इस इन विवो प्रयोग से अधिक एक स्पष्ट लाभ, microglia अलग करते हुए इष्टतम पवित्रता की पर्याप्त पैदावार प्राप्त करने के लिए एक चुनौती रहा है। वर्तमान में उपयोग में आम तरीकों या तो कम वसूली, कम शुद्धता, या दोनों से ग्रस्त हैं। इस के साथ साथ, हम demस्तंभ से मुक्त CD11b चुंबकीय जुदाई विधि है कि एक उच्च सेल वसूली और आधे समय के लिए राशि में बढ़ाया पवित्रता को प्राप्त होता है के एक शोधन onstrate। हम neuroinflammation और neurodegeneration का अध्ययन करने के उद्देश्य से प्राथमिक microglial अलगाव की एक अत्यधिक उपयोगी मॉडल के रूप में इस अनुकूलित विधि का प्रस्ताव।
Introduction
Microglia mesodermal मूल के Myb स्वतंत्र निवासी मैक्रोफेज, जो सी किट + / CD45- से अलग जर्दी थैली 1, 2 के खून द्वीपों में पूर्वज erythromyeloid हैं। एक बार जब embryological microglia केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) उपनिवेश, वे एक डालियां फैला हुआ प्रपत्र 3 करने के लिए एक अमीबीय से संक्रमण। के बाद से उनकी गतिशील असर संभावित अपमान 4 के लिए स्वस्थ मस्तिष्क पैरेन्काइमा जांच ये वयस्क microglia चौकस के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। हालांकि microglia केवल सीएनएस सेल की आबादी का लगभग 10% करने के लिए योगदान, आपस में टाइल करने की क्षमता पैरेन्काइमा 4, 5 की अधिकतम स्कैनिंग करता है। ऐसे α-synuclein 6, 7 और एमीलोयड-β 8 या पी के रूप में खतरे जुड़े आणविक पैटर्न (damps),इस तरह के lipopolysaccharide (LPS) 9 के रूप में athogen जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs), प्रतिष्ठित एक भड़काऊ प्रतिक्रिया अमीबीय सक्रिय राज्य को प्रत्यावर्तन और नाइट्रिक ऑक्साइड के उत्पादन, ट्यूमर परिगलन कारक-α (TNFα), इंटरल्यूकिन 1β की विशेषता को बढ़ावा देने के microglia को सक्रिय (आईएल 1β), आईएल -6, आईएल 12, और केमोकाइन सीसी मूल भाव ligand 2 9, 10, 11। ऐसे पार्किंसंस रोग के रूप में neuroinflammatory स्थिति, जिसमें रोगजनक α-synuclein जमा हो गया, एक न्यूरोडीजेनेरेटिव चक्र डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स, जो और अधिक एकत्रित α-synuclein जारी की मौत से बनाया जाता है, आगे microglia 7 के शास्त्रीय सक्रियण को बढ़ावा देने के। परिधीय मैक्रोफेज की ही तरह, microglia भी, वैकल्पिक रूप से विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स आईएल 4 और आईएल 10 की उपस्थिति में सक्रिय करने के लिए क्षमता हो सकती है उन्हें शक्तिशाली दे रही हैतंत्रिका मरम्मत को बढ़ावा देने और सूजन 2, 11 attenuating की ial। सीएनएस में उनकी प्रतिरक्षा भूमिकाओं के अलावा, microglia विकास के दौरान synapses प्रूनिंग द्वारा neuronal circuitry की महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में वर्णित किया गया है। उदाहरण के लिए, Cx3cr1- KO चूहों कम घना microglia और कम अन्तर्ग्रथनी छंटाई, जो वृक्ष के समान कांटा, अपरिपक्व synapses, और एक अविकसित सीएनएस 12 के electrophysiological पैटर्न के एक अधिकता की ओर जाता है है। सीएनएस के homeostasis में इन शारीरिक जटिलताओं और microglia की विभिन्न कार्यात्मक भूमिकाओं को समझना न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों को लक्षित चिकित्सा विज्ञान के लिए खोज करने के लिए महत्वपूर्ण है।
Neuroimmunology के क्षेत्र में, इन विट्रो प्रयोगों यंत्रवत अध्ययनों के लिए अधिक से अधिक व्यवहार्यता की वजह से बहुत ही वांछनीय हैं, कम रखरखाव लागत, और कम समय और श्रम प्रधान होने के लिए। Furthermoफिर, सेल आबादी को अलग करने की क्षमता निर्धारित शर्तों के तहत उन लक्ष्य कोशिकाओं की कार्यक्षमता को चित्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। कई microglial अलगाव तरीके मौजूद हैं, लेकिन वे व्यापक प्रयोग 13, 14, 15 के लिए अपेक्षाकृत अधिक संख्या और पवित्रता प्राप्त करने के लिए अपनी क्षमता द्वारा सीमित हैं। उदाहरण के लिए, भेदभाव 11b का एक समूह (CD11b) monocytes, मैक्रोफेज, और microglia 16 का एक आम सतह मार्कर है। CD11b का शोषण करके, चुंबकीय जुदाई की एक विधि पहले एक स्तंभ आधारित दृष्टिकोण है कि झुकेंगे ~ 99.5% पवित्रता और नवजात मस्तिष्क 17 प्रति ~ 1.6 x 10 6 microglia के रूप में वर्णित किया गया था। हमारी प्रयोगशाला हाल ही में एक स्तंभ से मुक्त CD11b चुंबकीय जुदाई विधि 15 है, जो हम एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी phycoerythrin को संयुग्मित (पीई) के साथ CD11b टैग करके एक polystyrene ट्यूब में प्रदर्शन का विकास किया। एक bispecific secondary एंटीबॉडी पीई तथा पीई के साथ dextran परिसरों के लिए। एक बार ही, dextran में लिपटे चुंबकीय कणों का प्रवेश होता है जो एंटीबॉडी परिसर के dextran अंत करने के लिए बाध्य। अन्त में, polystyrene ट्यूब microglial अलगाव के लिए एक चुंबक में रखा गया है। यह दृष्टिकोण करने के लिए उपज दोगुनी ~ नवजात मस्तिष्क प्रति लेकिन ~ 97% करने के लिए पवित्रता को कम करने की कीमत पर 3.2 x 10 6 microglia।
इस के साथ साथ, हम एक तेजी से और परिष्कृत स्तंभ मुक्त CD11b चुंबकीय जुदाई प्रोटोकॉल (चित्रा 1) का प्रदर्शन। इस बेहतर विधि हमारे मूल स्तंभ से मुक्त विधि के रूप में के रूप में संभव रहता है के बाद से CD11b चुंबकीय जुदाई किट की कीमत एक ही है। पूरा होने के समय आधा है, जो सेल अस्तित्व और उपज को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है में कम है। विशेष रूप से, पवित्रता इस अनुकूलित विधि से हासिल ~> 99%, पवित्रता मूल स्तंभ मुक्त हमारी प्रयोगशाला 15 द्वारा विकसित विधि से हासिल की पर एक उल्लेखनीय सुधार है। सबसे महत्वपूर्ण बात, CD11b-PEउपयोग नहीं किया जाता है, प्रकाश से दूर सेते की आवश्यकता को समाप्त और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए लाल चैनल के उपयोग की इजाजत दी। अन्त में, मूल CD11b विधि में के रूप में, उच्च उपज और पवित्रता का एक astrocytic अंश इस बेहतर विधि के साथ प्राप्त की है। Astrocytes, सीएनएस में सबसे अनेक glial कोशिकाओं रहे हैं विचार है कि उनके होमियोस्टैटिक कार्यों pathophysiology 18 के संबंध में अपरिहार्य हैं के लिए अग्रणी। इन glial कोशिकाओं में इस तरह के रक्त मस्तिष्क बाधा के गठन, पोषक तत्व सहायता प्रदान करने, न्यूरोट्रांसमीटर homeostasis को बनाए रखने, चोट, neuroprotection के जवाब में glial निशान बनाने, सीखने और स्मृति, और neuroinflammation, glial में उनकी जांच पड़ताल संभावित दृष्टांत मान विविध शारीरिक कार्यों में एक भूमिका निभा जीव विज्ञान 19। आकृति विज्ञान और microglia और astrocytes की कार्यक्षमता कोंफोकल माइक्रोस्कोपी, पश्चिमी सोख्ता, मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT- पीसीआर), जी के माध्यम से पता लगाया गया हैरीस नाइट्राइट परख, और Luminex मल्टीप्लेक्स साइटोकाइन परख। इस प्रोटोकॉल द्वारा प्रदान की शोधन microglial या astrocytic शुद्धता, लाल चैनल की उपलब्धता के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के व्यापक आवेदन से संबंधित आत्मविश्वास में वृद्धि हुई है प्रदान करता है, और समय की बचत होती है, जो सभी इन विट्रो प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं।
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Protocol
जानवरों और प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं के उपयोग को मंजूरी दे दी और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी में (एम्स, IA, संयुक्त राज्य अमरीका) की देखरेख कर रहे थे
1. मिश्रित glial संस्कृति के बढ़ते
- 5.5 इंच ऑपरेटिंग कैंची से 1- 2 दिन पुरानी पिल्ले जल्दी से सिर काटना, और सिर बर्फ पर एक 50 एमएल ट्यूब में तुरंत जगह। ध्यान दें कि इस कत्ल इच्छामृत्यु की विधा है।
- एक लामिना airflow हुड में, खोपड़ी और 4.5 इंच सीधे सूक्ष्म चीर-फाड़ कैंची का उपयोग कर मेनिन्जेस में एक छोटा सा चीरा बनाने। दुम अंत से व्याख्यान चबूतरे वाला अंत (नाक) को काटने शुरू करो। उद्घाटन कत्ल द्वारा गठित उपयोग करके त्वचा के नीचे हो जाओ।
- चीरा के बाद, ओर करने के लिए गोलार्द्धों में से एक को निकाल दें। तब पूरे मस्तिष्क को दूर करने के घुमावदार या शौकीन चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करें।
- युक्त 0.25% ट्रिप्सिन- ethylenediaminetetraacet एक नया 50 एमएल ट्यूब में मस्तिष्क (रों) विसर्जितएक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में 15 मिनट के लिए एसिड (EDTA) खा लिया। मस्तिष्क प्रति ट्रिप्सिन- EDTA के 2 एमएल का प्रयोग करें।
- जोड़ने और हटाने के द्वारा नए सिरे से विकास मीडिया (10% एफबीएस, DMEM / F12, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1% एल glutamine, 1% सोडियम पाइरूवेट, और 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड) के साथ मस्तिष्क (रों) धो मीडिया। इस 4x दोहराएँ।
- प्रत्येक मस्तिष्क के लिए, विकास माध्यम से युक्त दो टी 75 बोतल थाली। इसलिए, ट्यूब को मस्तिष्क प्रति विकास मीडिया के 2 एमएल जोड़ें। इस प्रकार, यह प्रति टी 75 फ्लास्क विकास मीडिया के 8-9 एमएल के साथ homogenized मस्तिष्क के 1 एमएल के एक बराबर हो जाएगा।
- सबसे बड़ा से छोटी से छोटी करने के क्रम में एपर्चर आकार भिन्न, की pipettes के साथ मस्तिष्क (रों) triturating द्वारा homogenize। जब यह है कि मस्तिष्क के ऊतकों छोटे नहीं मिल रहा है, अगले पिपेट के लिए संक्रमण दिख रहा है। विचूर्णन के अंत में, निलंबन स्पष्ट किया जाना चाहिए, नहीं दिखाई मात्रा के साथ।
- एक 25 एमएल पिपेट, 5 एमएल पिपेट, और उसके बाद एक 10 एमएल पिपेट क्रमिक रूप से प्रयोग करें।
- प्रत्येक homog दर्राएक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से enous मस्तिष्क निलंबन एक एकल कोशिका संस्कृति में इसे बनाने के लिए।
- प्रत्येक homogenized मस्तिष्क के लिए, थाली दो टी 75 बोतल (प्रति टी 75 फ्लास्क विकास मीडिया के 8-9 एमएल के साथ 1 एमएल homogenized मस्तिष्क के) कदम 1.5 में वर्णित है, विकास माध्यम से युक्त।
- बाद 6 घ विकास मीडिया बदलें और 16 वें दिन पर अलगाव तक हो जाना।
2. microglial कोशिकाओं का अलगाव
- 16 दिनों के बाद, कुप्पी से विकास मीडिया को हटाने और एक ताजा 50 एमएल ट्यूब में रखें। प्रत्येक टी 75 फ्लास्क 3 एमएल 0.25% ट्रिप्सिन- EDTA जोड़ें। एक कक्षीय शेकर पर आरटी पर 5 मिनट के लिए बोतल हिला।
- अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 0.4 XG पर हटाया विकास मीडिया और बाद वाले चरण में ट्रिप्सिन- EDTA प्रतिक्रिया को रोकने के लिए इस्तेमाल करते हैं।
- 5 मिनट के लिए मिलाते हुए के बाद, ट्रिप्सिन- EDTA प्रतिक्रिया को रोकने के लिए विकास मीडिया (ताजा या 2.1.1 से इस्तेमाल किया मीडिया) के 4 एमएल की एक न्यूनतम जोड़ें।
- यह सुनिश्चित करने के Triturate कि सभी गएल अलग किया गया है।
- विचूर्णन के बाद, यह एक एकल कोशिका संस्कृति में बनाने के लिए एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से कोशिकाओं से गुजरती एक कोशिका गिनती करते हैं, और फिर 5 मिनट के लिए 0.4 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन।
- हर 100 x 10 6 कोशिकाओं (लगभग 15 एक्स टी 75 बोतल) के लिए, सेल गोली resuspend करने के लिए सिफारिश की मीडिया (2% एफबीएस, DPBS (कैल्शियम और मैग्नीशियम क्लोराइड से मुक्त), 1 मिमी EDTA) के 1 एमएल का उपयोग करें।
नोट: सभी के लिए निम्न चरण एक 1 एमएल अलग होने के लिए अनुरूप हैं। - एक 5 एमएल polystyrene ट्यूब ले लो, अनुशंसित मीडिया के 1 एमएल जोड़ने के लिए, और नवचंद्रक निशान। अनुशंसित मीडिया 2.5 एमएल को जोड़ें और इस रूप में अच्छी तरह निशान। अनुशंसित मीडिया त्यागें और 5 एमएल polystyrene ट्यूब को फिर से निलंबित कोशिकाओं हस्तांतरण।
- चूहा सीरम के 50 μL निलंबित कोशिकाओं के हर 1 एमएल के लिए जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
- घटक बी के 25 μL 25 घटक एक की μL और ये घटक मालिकाना हैं मिश्रण से चयन कॉकटेल तैयार करें।
- 50 जोड़े1; कोशिकाओं को चयन कॉकटेल के एल। आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
नोट: शुद्ध संस्कृतियों के लिए, दोहराने कदम 2.9 (अनुशंसित लेकिन अनिवार्य नहीं)। - 45 s के लिए भंवर microspheres। नमूने के 1 एमएल प्रति microspheres की 80 μL जोड़ें। आरटी पर 3 मिनट के लिए सेते हैं।
- अनुशंसित मीडिया जोड़कर polystyrene ट्यूब में 2.5 एमएल मात्रा ले आओ।
- कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए चुंबक में ट्यूब रखो। शुद्धता को बढ़ाने के लिए ऊष्मायन समायोजित करें। धीरे धीरे polystyrene ट्यूब में चुंबक अभी भी साथ एक 15 एमएल ट्यूब में अनुशंसित मीडिया बाहर डालना।
- दोहराएँ कदम 2.12 तीन बार। अतिरिक्त चुंबकीय incubations शुद्धता को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।
- विकास मीडिया के 3 एमएल जोड़ें और एक सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की संख्या गिनती।
- पाली-D-लाइसिन (पीडीएल) उपचार के लिए लेपित प्लेटों में तदनुसार प्लेट कोशिकाओं। inPDL में लिपटे प्लेटों बोने के बाद कोशिकाओं 48 घंटे उपचार करें। यह कोशिकाओं को अलग करने के तनाव से उबरने के लिए अनुमति देता है।
नोट: चेसंस्कृति के रूप में पहले से 15 में वर्णित immunocytochemistry का उपयोग कर की शुद्धता सी.के.। - नकारात्मक अंश (एक 15 एमएल ट्यूब में एकत्र), जो ज्यादातर विकास माध्यम में टी 75 बोतल में, astrocytes शामिल प्लेट।
- 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ऊष्मायन के कम से कम 6 घंटे के बाद, मध्यम बदल सकते हैं और यह हे बढ़ने / एन करते हैं। उपचार के लिए अगले दिन astrocytes विभाजित करें।
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Representative Results
Microglia CD11b सकारात्मक चयन किट का उपयोग अलग-थलग द्वितीय उच्च शुद्धता है
प्राथमिक माउस microglia ऊपर उल्लेख किया प्रोटोकॉल का उपयोग कर अलग किया और पाली-D-लाइसिन में लिपटे coverslips पर चढ़ाया अलगाव की शुद्धता की जांच करने के किए गए थे। दस हजार कोशिकाओं में अच्छी तरह से और immunocytochemical विश्लेषण प्रति प्लेटेड गया पृथक microglia की शुद्धता की जांच करने के microglia और glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) astrocytes के एक मार्कर के रूप में की एक मार्कर के रूप आयनित कैल्शियम बाध्यकारी अनुकूलक अणु 1 (Iba1) का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था । अलग संस्कृति केवल, GFAP अभिव्यक्ति (चित्रा 2 ए) के बिना Iba1 व्यक्त सुझाव है कि संस्कृति पृथक शुद्ध microglia था। प्राथमिक microglial जुदाई, जो हासिल ~ 97% शुद्धता के लिए अन्य पहले प्रकाशित तरीकों, इस पद्धति का उपयोग के विपरीत हम आधे समय में ~> 99% शुद्धता प्राप्त की। आगे वीं की शुद्धता प्रमाणित करने के लिए संस्कृति है, हम Iba1 और GFAP के लिए एक पश्चिमी धब्बा 20 भाग गया। Immunoblot विश्लेषण से पता चला कि आगे मिश्रित glial संस्कृतियों से इस अलगाव एक लगभग शुद्ध microglial संस्कृति (चित्रा 2 बी) था।
संशोधित अलगाव प्रक्रिया चुंबकीय मोतियों से किसी भी ऑटो प्रतिदीप्ति नहीं है
लाल चैनल immunocytochemistry (आईसीसी) के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है जब microglial अलग होने के लिए पिछले CD11b अलगाव किट का उपयोग के रूप में गॉर्डन एट अल द्वारा उल्लेख किया है। जुदाई के दौरान पीई लेबलिंग के प्रयोग की वजह से 15। इस नए पीई मुक्त अलगाव किट का उपयोग करना, हम immunocytochemical विश्लेषण (चित्रा 3) के लिए लाल चैनल का उपयोग कर सकते हैं। इस आईसीसी से, यह है कि इस नई विधि हमें फ्लो या अन्य फ्लोरोसेंट इमेजिंग अध्ययन के लिए सभी चैनलों का उपयोग करने के लिए सक्षम बनाता है स्पष्ट है।
ve_step "के लिए: रखने together.within-पन्ने की =" 1 "> पृथक microglial संस्कृतियों कार्यात्मक LPS उत्तेजना का जवाबसत्यापित करने के लिए कि पृथक microglia कार्यात्मक रूप से सक्रिय हैं, हम विभिन्न पूर्व-शोथ कारकों के लिए जांच से पहले, microglia सक्रिय करने के लिए 24 घंटे के लिए LPS के साथ कोशिकाओं का इलाज किया, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल उत्तेजक 9। शास्त्रीय microglial सक्रियण नाइट्राइट और विभिन्न समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई मीडिया में के साथ है। इसलिए, हम हमारे अलग microglia की कार्यात्मक गतिविधि पुष्टि करने के लिए कई पूरक assays इस्तेमाल किया। सबसे पहले, हम दिखाने के लिए कि LPS नाटकीय रूप से अलग-थलग microglia (चित्रा 4 ए) से नाइट्राइट स्राव प्रेरित Griess परख का इस्तेमाल किया। आगे पृथक microglia की गतिविधि को मान्य करने के लिए, हम QRT- पीसीआर को दिखाने के लिए (दूत ribonucleic एसिड) NOS2, microglial सूजन का एक और बानगी के mRNA के स्तर का इस्तेमाल किया, काफी बढ़ाया वाईवें LPS उपचार (चित्रा 4 बी)। इसके बाद, हम सत्यापित करें कि LPS काफी microglial संस्कृति (चित्रा 5 ए) से समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के स्राव को उत्तेजित एक मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख, Luminex 21, इस्तेमाल किया। इसके अलावा, हम QRT- पीसीआर विश्लेषण के माध्यम से सत्यापित किया है कि LPS उपचार आईएल 1β और TNFα (चित्रा 5 ब) सहित कई समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के जीन की अभिव्यक्ति के स्तर को बढ़ाया। इन सभी डेटा एक साथ सुझाव है कि प्राथमिक microglia इस नव परिष्कृत विधि का उपयोग कर अलग किया कार्यात्मक रूप से सक्रिय हैं और एक समान सक्रियण प्रोफाइल दिखाने के रूप में प्राथमिक microglia पहले प्रकाशित तरीकों का उपयोग कर अलग किया।
पृथक microglia पढ़ाई संकेतन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता
, Microglial अलगाव के पिछले तरीकों का उपयोग कर पश्चिमी blo चलसंकेत के अध्ययन के लिए टी कम उपज और पवित्रता के कारण मुश्किल और अव्यवहार्य था। इससे पहले, हम पता चला है कि फ़िन, एक एसआरसी परिवार काइनेज, microglial कोशिकाओं 9 में एक पूर्व-शोथ संकेत झरना में शामिल है। यहाँ हम एक 12 अच्छी तरह से थाली में एक लाख microglial कोशिकाओं प्लेटेड और 48 घंटे के बाद, हम देशी फ़िन के लिए पश्चिमी दाग को चलाने के लिए कोशिकाओं एकत्र और एसआरसी tyrosine अवशेषों 416 (पी-src-Y416) पर फॉस्फोरिलेटेड kinases। हम अपने अलग microglial कोशिकाओं (चित्रा 6) में दोनों फ़िन और पी-src-Y416 स्तर का पता लगाने के लिए दिखा रहा है कि इस विधि के अध्ययन संकेतन के लिए पश्चिमी सोख्ता तकनीक के लिए लागू है में सक्षम थे।
microglial जुदाई से नकारात्मक अंश astrocytes कि अध्ययन संकेत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है
Astrocytes neuroinflammation में प्रमुख खिलाड़ियों रहे हैं, और Astr पीछे संकेतन प्रक्रिया को समझनेocytic सूजन और न्यूरॉन-तारिकाकोशिका पार बात महत्वपूर्ण 19 है। यहाँ, हम बताते हैं कि microglial जुदाई से नकारात्मक अंश GFAP पॉजिटिव astrocytic कोशिकाओं (चित्रा 7A) शामिल हैं। इसके अलावा, फ़िन और पी-src-Y416 (चित्रा 7B) के लिए हमारे पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से पता चला है कि इन प्रोटीनों की दोनों नकारात्मक अंश में रूप में अच्छी तरह से पता लगाया जा सकता है। इन परिणामों को एक साथ चलता है कि नकारात्मक अंश भड़काऊ संकेतन cascades के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन की पहचान करने के उद्देश्य से astrocytic के अध्ययन के लिए एक आदर्श तैयारी है।
चित्रा 1: 1-2 दिन-पोस्ट प्रसव पिल्ले से microglial कोशिकाओं के अलगाव के योजनाबद्ध। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंइन आंकड़ों की।
चित्र 2: Microglia CD11b पॉजिटिव चयन किट का उपयोग कर द्वितीय उच्च पवित्रता है पृथक। (ए) लाल चैनल और हरे चैनल में IBA1 में GFAP के लिए जांच कर पृथक microglial संस्कृति का Immunocytochemistry। (बी) पृथक microglial संस्कृति GFAP (~ 51 केडीए), IBA1 (~ 15 केडीए) और β-एक्टिन (~ 42 केडीए) के लिए जांच की immunoblot। स्केल बार = 20 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
3 चित्र: संशोधित अलगाव प्रक्रिया चुंबकीय मोती से किसी भी ऑटो प्रतिदीप्ति नहीं है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: microglial संस्कृति में LPS उत्तेजना में वृद्धि नाइट्राट उत्पादन। (ए) पृथक microglial कोशिकाओं 24 घंटे के लिए 1 माइक्रोग्राम / एमएल LPS के साथ इलाज और उपचार मध्यम Griess परख द्वारा नाइट्राइट रिहाई निर्धारित करने के लिए एकत्र किए गए थे। (बी) Nos2 के लिए 24 घंटे के लिए LPS के साथ इलाज अलग microglia से q-आरटी-पीसीआर। आंकड़े 2 या अधिक स्वतंत्र प्रयोगों से एसई ± मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। डाटा विद्यार्थी t- परीक्षण (का उपयोग कर विश्लेषण किया गया * p0; 0.05, ** p <0.01, *** पी <0.001)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5: प्रो भड़काऊ साइटोकाइन रिलीज LPS प्रेरित microglial कोशिकाओं से। (ए) Luminex मल्टीप्लेक्स परख उपचार मध्यम 24 घंटे के लिए 1 माइक्रोग्राम / एमएल LPS के साथ इलाज अलग microglial कोशिकाओं से एकत्र पर प्रदर्शन किया था। (बी) आईएल 1βand TNFα के लिए 24 घंटे के लिए LPS के साथ इलाज अलग microglia से q-आरटी-पीसीआर। आंकड़े 2 या अधिक स्वतंत्र प्रयोगों से एसई ± मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। डाटा विद्यार्थी t- परीक्षण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया (* पी <0.05, ** p <0.01, *** पी <0.001)। कृपया यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने।
चित्र 6: पृथक Microglia सिग्नलिंग अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण दर्शाता है कि फ़िन और पी-src-Y416 हमारे नए परिष्कृत विधि के साथ पृथक microglia से पता लगाया जा सकता है।
चित्र 7: microglial पृथक्करण से नकारात्मक अंश Astrocytes कि सिग्नलिंग अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता शामिल हैं। (ए) पश्चिमी सोख्ता से पता चलता है कि नकारात्मक अंश GFAP पॉजिटिव सेल शामिल हैं। (बी) के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण दर्शाता है कि फ़िन और पी-src-Y416 GFAP पॉजिटिव कोशिकाओं से पता लगाया जा सकता।target = "_ blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| पैरामीटर | वर्तमान विधि | संशोधित विधि | |
| लागत | $ 620 | $ 620 | |
| पहर | 55 मिनट | 25 मिनट | |
| रोशनी | हाँ (लाल चैनल) | नहीं | |
| पवित्रता | ~ 97% | ~ 99% | |
तालिका 1: रिफाइंड microglial अलगाव विधि और अलगाव की मूल विधि के बीच तुलनात्मक विश्लेषण।
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Discussion
पुराने microglial अलगाव तरीकों सीमित वसूलियां कि उचित विभिन्न प्रोटीन के लिए पश्चिमी धब्बा द्वारा विश्लेषण करती है और शाही सेना QRT- पीसीआर द्वारा विश्लेषण नहीं हैं। अंतर पालन और हल्के trypsinization तरीकों कम microglial पैदावार 13, 14, 15 के साथ दो आम दृष्टिकोण हैं। स्तंभ आधारित CD11b दृष्टिकोण भी कम वसूली है, लेकिन अंतर पालन और हल्के trypsinization 13, 14, 15, 16, 17 से अधिक शुद्धता प्राप्त होता है। हमारे मूल स्तंभ मुक्त CD11b दृष्टिकोण बहुत अलग पैदावार में सुधार हुआ है, यह प्रोटीन के लिए उपयुक्त और आरएनए पश्चिमी सोख्ता और QRT- पीसीआर के रूप में इस तरह के विश्लेषण करती है, लेकिन कीमत पर की कमी हुई पवित्रता 15।
हमारे नए संशोधित विधि को बरकरार रखे हुएमूल विधि की पैदावार और से ~ 95-97% करने के लिए ~> 99% से थोड़ा पवित्रता बढ़ जाती है, लेकिन आधा पूरा होने के समय, जो कोशिका के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है में। प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण चरणों इष्टतम microglial अलगाव आश्वस्त कर सकते हैं। पिल्ले मारने का इरादा बनाया है, देखभाल बर्फ पर सिर रखने के लिए और 5-10 मिनट के भीतर एक लामिना airflow कक्ष में काटना लिया जाना चाहिए। लंबे समय तक मस्तिष्क छांटना बार microglial पैदावार समझौता यह मुश्किल भरा मस्तिष्क प्राप्त करने के लिए, क्योंकि यह परिवेश तापमान में अपनी दृढ़ता कम करने के लिए शुरू होता है कर देगा। विशेष रूप से, अगर कदम 2.9 कम से कम एक बार दोहराया जाता है, वहाँ पवित्रता और व्यवहार्यता में एक नमूदार वृद्धि हुई है। तो जुदाई से उपज कम है, जुदाई की सिफारिश की मीडिया के प्रति मिली कम बोतल का उपयोग कर दोहराया जा सकता है, या जुदाई की मात्रा (> 1 एमएल) में वृद्धि से। घटाना सेल भीड़ आम तौर पर पवित्रता, व्यवहार्यता, और उपज में सुधार होगा। चुंबकीय ऊष्मायन समय शुद्धता को बढ़ाने के लिए कदम 2.12 में बढ़ाया जा सकता है। यह हो सकता हैउचित चुंबकीय microspheres कि microglia से जुड़े होते हैं के बंधन को आश्वस्त। इसके अलावा, अतिरिक्त चुंबकीय incubations पवित्रता और उपज में वृद्धि के लिए कदम 2.9 में प्रदर्शन किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल की व्यवहार्यता या मूल CD11b विधि की तुलना में बेहतर होता है; हालांकि, नई विधि परिष्कृत और कम है। एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ यह परिष्कृत विधि से प्राप्त प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, जो मूल विधि (तालिका 1) 15 में पीई के कब्जे में है के लिए लाल चैनल का उपयोग करने का विकल्प है। हालांकि हम उच्च उपज और विधि के साथ microglia की पवित्रता मिलता है, astrocytic उपज इस अलगाव से प्राप्त कम शुद्ध के बाद से यह कुछ fibroblasts को बरकरार रखे हुए है। कदम 2.17 में वर्णित है, astrocytes चढ़ाना और 6 घंटे के लिए विकासशील के बाद, विकास मीडिया ताजा मीडिया के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। Astrocytes, पहले कुप्पी को संलग्न करने के लिए कर रहे हैं, जबकि fibroblasts की ज्यादा susp में रहते हैंension। मीडिया के प्रतिस्थापन आम तौर पर दूषित fibroblasts के बहुमत को हटा देगा। हालांकि इस तकनीक astrocytes के एक उच्च शुद्धता का आश्वासन दिया, शुद्ध संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए एक उच्च माध्यमिक शोधन विधि न्यायसंगत न हो।
कुल मिलाकर, इस संशोधित CD11b अलगाव विधि समय की एक छोटी राशि में अत्यधिक शुद्ध प्राथमिक microglial कोशिकाओं और astrocytes उत्पन्न करता है। कम अलगाव समय आम तौर पर सेल बचने की दर में सुधार। यह दोनों microglial और astroglial जीव विज्ञान अंतर्निहित संकेतन तंत्र का वर्णन के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।
Acknowledgments
NS088206 और ES026892: इस काम के स्वास्थ्य (एनआईएच) के राष्ट्रीय संस्थानों अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। डब्ल्यू यूजीन और लिंडा लॉयड संपन्न चेयर Agk करने और डीन प्रोफेसरशिप एके को भी स्वीकार किया जाता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
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