Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Maturação de cardiomiócitos estaminais humanas derivadas de células em Biowires Usando Electrical Stimulation

doi: 10.3791/55373 Published: May 6, 2017

Summary

A plataforma biowire cardíaca é um método in vitro utilizado para amadurecer embrionário humano e cardiomiócitos derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas (HPSC-CM) através da combinação de cultura de células tridimensional com estimulação eléctrica. Este manuscrito apresenta a configuração detalhada da plataforma biowire cardíaca.

Abstract

cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (HPSC-CMS) têm sido uma fonte de células promissor e, assim, encorajados a investigação de suas possíveis aplicações na pesquisa cardíaca, incluindo a descoberta de medicamentos, modelagem de doença, a engenharia de tecidos e medicina regenerativa. No entanto, as células produzidas por protocolos existentes exibir uma gama de imaturidade comparado com cardiomiócitos ventriculares adulto nativas. Muitos esforços têm sido feitos para amadurecer HPSC-CMs, com apenas maturação moderada alcançado até agora. Portanto, um sistema de engenharia, chamado biowire, foi concebida, fornecendo pistas tanto físicas e eléctricas para levar HPSC-MC para um estado mais maduro in vitro. O sistema utiliza uma plataforma microfabricado para semear HPSC-CMs em colagénio do tipo I gel ao longo de um fio de sutura molde rígido para montar em tecido cardíaco alinhados (biowire), que é submetido a estimulação do campo eléctrico com uma frequência progressivamente crescente. Em comparação com os controlos não estimulados,estimulada biowired cardiomiócitos exibem um maior grau de maturação estrutural e electrofisiológica. Tais alterações são dependentes da taxa de estimulação. Este manuscrito descreve em detalhe a concepção e criação de biowires.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

terapia baseada em celular é uma das mais promissoras e investigados para alcançar cardíaca reparação / regeneração. Ele foi auxiliado por engenharia de tecidos cardíaco e o co-entrega de biomateriais 1, 2. A maioria das fontes celulares disponíveis têm sido estudados em modelos animais para os seus efeitos potencialmente benéficos sobre danificados, doentes, ou corações com idades entre 3. Em particular, os esforços significativos foram feitos para usar células-tronco pluripotentes humanas (HPSC) derivada de cardiomiócitos (HPSC-CM), uma fonte de células autólogas potencialmente ilimitado para a engenharia de tecido cardíaco. HPSC-CMs pode ser produzido usando vários protocolos estabelecidos 4, 5, 6. No entanto, as células obtidas a exibir os fenótipos fetais semelhante, com uma gama de características imaturas em comparação com cardiomiócitos ventriculares do adulto 7, 8. Isso pode ser um obstáculo para a aplicação de HPSC-CMs como modelos de tecido cardíaco de adultos na pesquisa de descoberta de drogas e no desenvolvimento de adultos modelos de doenças cardíacas 9.

De modo a ultrapassar esta limitação de imaturidade fenotípica, novas abordagens têm sido investigado activamente para promover a maturação de cardiomiócitos. Os primeiros estudos revelaram propriedades pró-maturação eficazes em cardiomiócitos de ratos neonatais através cíclico mecânico 10 ou estimulação eléctrica 11. Compactação do gel e estimulação mecânica cíclico também foram exibidas para melhorar alguns aspectos da HPSC-CM maturação 12, 13, com realce mínimo das propriedades de manuseamento electrofisiológicos e de cálcio. Portanto, um sistema de plataforma chamado "fio biológica" (biowire) foi concebido, fornecendo ambas as pistas estruturais e estimulação do campo eléctricon para melhorar a maturação de HPSC-CMs 14. Este sistema utiliza uma plataforma microfabricado para criar tecido cardíaco alinhados que é passível de estimulação do campo eléctrico. Isso pode ser usado para melhorar a maturidade estrutural e eletrofisiológica da HPSC-CMS. Aqui, descrevemos os detalhes de fazer tais biowires.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Projeto mestre e fabricação

NOTA: Use litografia suave para a fabricação do dispositivo. Faça um mestre SU-8 de duas camadas para a moldagem de polidimetilsiloxano (PDMS).

  1. Desenhe o dispositivo usando um software de desenho e desenho ( Figura 1A , à esquerda). Desenhe cada camada do mestre separadamente. Imprima o desenho do dispositivo em duas fotomassagens a 20.000 dpi, correspondendo às duas camadas do mestre 15 . Definir o padrão do dispositivo como transparente ea área circundante como escuro; As máscaras servem como molde para transferir opticamente o padrão de dispositivo para SU-8 por litografia (como descrito por outros 15 ).
  2. Distribuir cerca de 4 mL de SU-8 50 no centro de uma bolacha de silício de 4 polegadas. Revestimento do SU-8 50 uniformemente sobre a bolacha usando um revestidor rotativo girando a 2.000 rotações por minuto (RPM) por 30 s. Asse a bolacha numa placa de aquecimento a 95 ° C durante 10 min. Expor a bolacha para ultravioleta (UV) light a 200 mJ / cm 2.
  3. Pour cerca de 4 mL de SU-2050 8 para o centro da pastilha e centrifugação a 2500 RPM, durante 30 s. Coza no 95 ° C placa de aquecimento durante 15 min. Arrefecer até à temperatura ambiente (TA).
  4. Repita o passo 1.3 mais duas vezes.
  5. Cobrir a pastilha revestida com a foto-mascara transparência da primeira camada. Expor a bolacha de luz UV a 270 mJ / cm 2 para fazer a primeira camada. Coza no 95 ° C placa de aquecimento durante 15 min.
  6. Fazer a segunda camada de SU-2050 8, repetindo o passo 1.3 duas vezes.
  7. Alinhar a máscara da segunda camada para as características sobre a primeira camada utilizando um alinhador de máscara. Em seguida, expor a luz UV a 240 mJ / cm2. Cozer a 95 ° C durante 15 min.
    NOTA: O tempo de exposição é determinada pela dose de UV total requerida e a intensidade de saída de luz UV medida no dia antes do uso.
  8. Desenvolver a bolacha, submergindo-o em acetato de propileno glicol monometil éter (PGMEA) e agitação a 200 rpm durante 30 min num agitador orbital.
  9. Lugar, colocaro mestre em uma placa de Petri e cuidadosamente verter a mistura de PDMS (base relativamente ao agente reticulante, na proporção de 10: 1 em peso) no centro da bolacha. Cobrir todas as características e evitar bolhas de ar.
  10. Calor num forno a 70 ° C durante 2 h. Utilizar uma lâmina afiada para cortar em torno da borda do molde biowire PDMS (figura 1A, direita). Descasque as PDMS do mestre. Aparar o dispositivo com a lâmina. Coloque o molde biowire PDMS em uma bolsa de esterilização e de vapor em autoclave a 121 ° C durante 20 min.
  11. Em uma cabine de segurança biológica (BSC), coloque os PDMS biowire modelo para uma placa de Petri. Use pinças para prender e montar um pedaço de fio de sutura cirúrgica esterilizada de seda (6-0) no centro do canal do micropoço PDMS por assentando-o nas ranhuras em ambas as extremidades do canal (Figura 1B-I).

2. Criação da Estimulação Elétrica Câmara

  1. Fazer um par de peças de policarbonato retangular (comprimento x largura x espessura: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) e utilizá-los como a estrutura da câmara de estimulação eléctrica (Figura 2).
  2. Perfurar dois buracos 3 milímetros de largura 2 cm de distância ao longo da linha central de cada peça da estrutura de policarbonato.
  3. Cortar duas peças de 1,5 cm de comprimento hastes de carbono. Perfurar um furo 1 mm de largura através da haste de carbono cerca de 3 mm da extremidade. Um fio de fio de platina através do orifício de haste de carbono e apertar o fio enrolando-o em torno da haste de carbono. Anexar um grampo para a outra extremidade do fio de platina para a ligação posterior com o estimulador eléctrico.
  4. Inserir as varetas de carbono para as peças da estrutura de policarbonato. Coloque a estrutura montada com as varetas de carbono dentro de um poço de uma placa de seis poços.
  5. Pour 2 ml de PDMS no poço. Mergulhe a parte inferior dos quadros de policarbonato em PDMS, mantendo o nível da superfície PDMS perto, mas não chegar ao fundo das hastes de carbono. Calor num forno a 70 ° C durante 2 h.
  6. Leve a câmara de estimulação elétrica dos seis-bem placa e colocá-lo em uma bolsa de esterilização para a esterilização por vapor a 121 ° C durante 20 min.

3. enzimática dissociação de HPSC-CMs

  1. HPSC induzir a diferenciação em cardiomiócitos utilizando um protocolo estabelecido 4.
    NOTA: Resumidamente, gerar cardiomiócitos via corpo embrióide estabelecido (EB) na haste protocolos forma pró através da suplementação sequencial com proteína morfogenética do osso 4, factor de crescimento de fibroblastos básico, activina A, factor de crescimento endotelial vascular, e Dickkopf homólogo 1 4. Use EBs do dia 20-34 de diferenciação para fazer biowires.
  2. Recolher os CEs a partir da placa de baixa ligação com uma ponta de pipeta P1,000 e transferir para um tubo cónico. Sedimentar por centrifugação durante 5 min a 125 xg e RT. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet com pré-aquecida, 37 ° C colagenase de tipo I contendo 1% de desoxirribonuclease I (ADNase I). Incubar a 37 ° C durante 2 hpara a digestão.
  3. Adicionam-se 5 mL de pré-aquecida, 37 ° C do meio de lavagem e centrifuga-se durante 5 min a 125 xg e RT. Descartar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento com 2 mL de solução de tripsina / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incubar a 37 ° C durante 5 min.
  4. Adicionar 1 mL de meio de paragem contendo 3% (v / v) de ADNase I.
  5. Anexar uma agulha 20 G (0,9 mm) para uma seringa de 5 mL e passar a suspensão através de EB que 3-5 vezes.
  6. Adicionar 7 mL de meio de lavagem e centrifugar a 280 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em modificado por Dulbecco Iscove médio (IMDM) e guardar no gelo. Determinar o número de células com um hemocitómetro. Tome 0,5 x 10 6 culas e sedimento por centrifugação a 280 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante.
  7. Pré-cool todos os componentes do gel em gelo antes de misturá-los num tubo estéril. Misturar os seguintes componentes de gel de colagénio (concentração final): 2,1 mg / ml de colagénio tipo I da cauda de rato, glicose 24,9 mM, NaH 23,8 mMCO 3, NaOH a 14,3 mM, HEPES 10 mM e 10% de matriz extracelular em meio 1x M199. Adicione o colágeno e matriz extracelular passado. Misturar por pipetagem cima e para baixo.
  8. Ressuspender 0,5 x 10 6 culas com 3,5 mL de gel de colagénio e misturar bem.
  9. Utilizar uma ponta de pipeta P10 para adicionar 4 uL da suspensão de células para a 0,5 cm de comprimento do canal (Figura 1B-II). Ajustar a posição do fio de sutura com uma pinça estéril se necessário.
  10. Cubra o fundo da placa de Petri com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS), tomando cuidado para não tocar no gel. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
  11. Substituir o PBS com 12 mL de meio de cultura (por exemplo, caule ou pró meio recomendado pelo fabricante de células), o suficiente para cobrir as células (Figura 1B-III). Cultura numa incubadora a 37 ° C durante 1 semana. Alterar o meio de todos os outros dias.

4. Estimulação Elétrica para Biowire Cultivo

  1. DentroO BSC, adicione 2 mL de PBS a cada poço de uma placa de seis poços que vai abrigar uma câmara de estimulador elétrico. Use pinças estéreis para colocar suavemente o dispositivo de estimulação elétrica autoclavado no poço. Descarte o PBS do poço.
  2. Cubra as hastes de carbono com 5 mL de meio de cultura pré-aquecido. Use pinças estéreis para montar os biowires na câmara de estimulação elétrica e orientá-los perpendicularmente às hastes de carbono ( Figura 2 ).
  3. Coloque a tampa em cima da placa de seis poços, mas deixe fios de platina suficientes chegar fora da placa para conectar com o estimulador elétrico. Colocar a placa de seis poços numa incubadora de cultura de células a 37 ° C e ligar o fio de platina ao estimulador eléctrico.
  4. Estimular os biowires usando um estimulador elétrico com a seguinte configuração: pulso repetitivo bifásico, duração de pulso de 1 ms, 3 V / cm, e 1 pulso por segundo (PPS). Aumentar o PPS a cada 24 h para os seguintes valores: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15, e 6. Alterar o meio de todos os outros dias.
  5. Observar a contractilidade dos cardiomiócitos em resposta à estimulação eléctrica sob um microscópio com aumento de 10x.
    NOTA: Depois de uma semana de estimulação, os biowires torna-se maduro (veja a seção de resultados).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

O racional para o uso de uma sutura no biowires é servir como um molde para a formação de construções 3D que se alinham em um eixo e imitam a forma de fibras cardíacas. Mostramos que após sete dias de cultura no biowire, as células remodelaram o gel ao redor da sutura ( Figura 3A ). As células foram montadas ao longo do eixo da sutura para formar o tecido cardíaco alinhado ( Figura 3 ). Após 7 dias de pré-cultura, os biowires foram submetidos a 7 dias de estimulação de campo elétrico e exibiram ainda propriedades compatíveis com a maturação estrutural e funcional de cardiomiócitos.

Os PSC-CMs humanos em biowires exibiram express� forte de prote�as contr�teis card�cas, α-actinina sarcom�ica e actina ( Figura 4A ). Observamos bandagem sarcomérica do aparelho contrátil hPSC-CM e alinhamento das estenoses miofibrilaresao longo do eixo do fio de sutura. Este é qualitativamente semelhante à estrutura no coração de adulto (Figura 4A). Em segundo lugar, em comparação com os de EBS, estas células estaminais embrionárias humanas biowired-CMs exibida taxa de proliferação mais baixos (Figura 4B). Em terceiro lugar, a células estaminais embrionárias humanas biowired-CMs apresentaram propriedades melhoradas de manuseamento de cálcio (Figura 5) e na maturação de cardiomiócitos electrofisiologia (Figura 6). Em cardiomiócitos maduras, o tratamento com cafeína induz uma libertação brusca de Ca2 + do retículo sarcoplasmático 8. Tais transientes de Ca 2+ foram encontrados em células estaminais embrionárias humanas estimuladas electricamente-CMs, mas não em células de controlo não estimuladas (Figura 5A-C). A resposta à cafeína nas células estimuladas electricamente, em comparação com os controlos não-estimulados, revelou uma amplitude significativamente maior de intensidade de uma forma dependente da frequência de estimulação (Figura 5D e E). Enquanto isso, HPSC-CMsem biowires mostrou corrente e corrente rectificadora para o interior (I K1) densidades de hERG, o qual foi ainda reforçada por estimulação eléctrica (Figura 6A e B) melhorou. Tais melhorias na corrente I k1 estão em conformidade com uma indução da expressão do gene do canal (KCNJ2) proteína de potássio de rectificação para o interior nas biowires (Figura 6C).

Outro parâmetro importante em relação a maturação é a capacidade dos cardiomiócitos de bater espontaneamente, também conhecido como automatismo, que é um sinal de imaturidade em trabalhar cardiomiócitos (atrial e ventricular) 16. A automaticidade foi significativamente maior em cardiomiócitos EB-derivadas em comparação com biowires de controlo (Figura 6D), o que foi comparável à que em biowires submetidos a um regime de 6 Hz.

Levarn em conjunto, estes resultados indicam que a cultura em biowire com estimulação eléctrica promoveu a maturação estrutural e electrofisiológica de HPSC-CMs 14.

figura 1
Figura 1: Biowire Plataforma Cultura. (A) Esquema (esquerda) e real (direita) PDMS molde de biowire. Barra de escala = 2 mm. (B) Para configurar o biowire, uma sutura foi montado centralmente no canal (I). Uma suspensão de células estaminais embrionárias humanas-CM em gel de colagénio do tipo I foi semeada em torno do fio de sutura no canal (II) e incubadas em meio (III). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: AO Biowire foi cultivado na Câmara de Estimulação Elétrica durante a Segunda Semana de Cultivo. O biowire foi colocado perpendicular aos eletrodos de carbono. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Remodelação de Células e Contração de Gel ao redor da Sutura após 7 dias de Pré-Cultivo em Biowire. ( A ) Imagens em campo claro de hESC-CMs nos dias indicados de pré-cultura no molde de biowire. Barra de escala = 200 μm. ( B ) Quantificação da compactação do gel nos dias de cultura indicados (média ± DP). ( C ) Hematoxilina e eosina (H & E) e coloração tricrômica (MT) de Masson de seções de biowire (as setas de dupla-cabeça representam o eixo de sutura). Balançar = 100 pm. Esta figura foi modificado a partir de referência 14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Fisiologia de cardiomiócitos cultivados na Plataforma Biowire. (A) imagens confocais representativos de não-estimulada (controlo) e biowires estimuladas electricamente (3 Hz e 6 Hz), mostrando os regimes de alinhamento de cardiomiócitos e Z-discos frequentes (as setas de cabeça dupla representa o eixo de sutura). Verde, α-actinina; vermelho, actina. Escala da barra = 20 m. (B) a proliferação dos cardiomiócitos nas biowires foi menor do que nos EB. A proliferação foi avaliada por coloração dupla para sarcomérica α-actinina e Ki67 (n = 3-4 para cada condição, ± médios; SD). *, **, # e & representam diferenças estatisticamente significativas em comparação com EBd34 (t de Student -teste). Esta figura foi modificado a partir de referência 14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: estimulação elétrica melhorias promovidas em Ca 2+ Handling Propriedades. (AC) traços representativos de Ca 2+ libertação em resposta a cafeína em células não estimuladas de controlo (A) e das células submetidas ao regime de 3 Hz (B) e o regime de 6 Hz (C). (D) a mudança induzida por cafeína da intensidade do pico de fluorescência entre os grupos experimentais (média ± SEM após normalização da fluorescência do pico intensity antes da administração de cafeína; controlo versus 3 Hz, P = 1,1 x 10-6; controlo versus 6 Hz, P = 2,1 x 10-7; 3 Hz versus 6 Hz, P = 0,003; n = 10 (controlo), n = 6 (3 Hz), e n = 9 (6 Hz) (teste t de Student). (E) representativas gravação fluorescente de Ca 2+ transientes antes e após a administração de cafeína a 5 mM (seta) em células sujeitas a um regime de 6 Hz. Esta figura foi modificado a partir de referência 14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Estimulação elétrica melhora as propriedades eletrofisiológicas e automaticidade. Electrophysiologpropriedades icas em cardiomiócitos individuais isolados a partir de biowires ou corpos embrióides (EBS) foram registados com um patch clamp. (A) hERG cauda densidade de corrente. Densidade de corrente (B) I K1 medido a -100 mV. (C) A sobre-regulação de potássio de rectificação para o interior do gene do canal (KCNJ2). (D) Relação de células que exibem o batimento espontâneo (automaticidade) ou nenhuma batida espontânea (sem automaticidade). Os dados em AD representam a média ± SEM As diferenças entre os grupos experimentais foram analisados por meio de Student t, teste de qui-quadrado, e ANOVA (múltiplas comparações de pares, método de Holm-Sidak). Esta figura foi modificado a partir de referência 14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

<td colspan = "5"> Evite qualquer dano ao fio de platina, cobrindo a tampa com cuidado. Use fita adesiva para prender a tampa corretamente na placa no caso da tampa não fecha totalmente. Ao fechar as portas da incubadora, coloque a porção mais fina dos fios do estimulador eléctrico para os pontos de fecho da porta para assegurar a vedação adequada da incubadora.
Protocolo etapa # Passos Críticos
2,4 Coloque as hastes de carbono de 1 a 2 cm ou na menor distância possível para evitar a estimulação de alta energia ea morte celular.
2,6 Teste as conexões entre o fio de platina eo carbono uma vez que a câmara de estimulação é feita pela primeira vez. Ligação da câmara de estimulação para o estimulador elétrico e, em seguida, definir uma tensão desejada. Coloque um fio volt em cada uma das duas hastes de carbono. A tensão de saída da câmara de estimulação deve ser a mesma tensão lida no voltímetro. Quaisquer leituras incorrectas indicam o possível revestimento do fio de platina com PDMS ou outra ligação defeituosa no sistema.
3.1 Utilizaram-se células isoladas para semear o biowire. Para a dissociação, a incubaçãoN tempo com colagenase é crítico e deve ser determinado pela idade das células eo protocolo de diferenciação (EBs versus monocamadas). Neste protocolo, é recomendado um tempo de incubação de 2 h para EBs do dia 21 e 30 min para monocamadas. Para células de outras idades, o tempo de digestão da colagenase pode necessitar de optimização monitorizando a viabilidade celular e a função contráctil pós-digestão.
3,3 Tripsina pode danificar as células; Assim, limitar a duração da incubação a não mais de 5 min.
3,5 Evite introduzir contaminantes segurando apenas a extremidade da seringa para prender a seringa à ponta da agulha. O número de mergulhos é determinado pela ausência de grandes grupos de células. Minimizar a interrupção da agulha para evitar a morte celular. Evite a formação de bolhas. No caso de grumos visíveis após interrupção da agulha, prolongar o tempo de incubação em colagenase em isolamentos subsequentes em vez de aumentar aTempo de incubação em tripsina ou o número de mergulhos.
3.6 Remover o sobrenadante completamente antes da adição de gel. O meio residual pode diluir a proporção de células: gel e afectar a polimerização em gel.
3,7 Manter as concentrações dos componentes de gel de colágeno quando escala para cima ou para baixo. Tenha em mente que as concentrações de estoque podem variar de acordo com o lote ou a preparação dos reagentes.
3.11 Para garantir que os micropoços PDMS permaneçam no fundo da placa de Petri, certifique-se de que a placa de Petri está seca e use um par de pinças estéreis para empurrar os micropoços PDMS para baixo.
4,2 Certifique-se de que todos os biowires estão no lugar. Cubra os biowires completamente com o meio na câmara de estimulação elétrica. Organizar todos os biowires perpendicular às hastes de carbono.
4.3
4,4 Desligue o estimulador eléctrico para o meio de alterações. Use um P1000 para remover apenas a parte superior do meio de idade e, em seguida, adicionar meio fresco. Assegurar que os biowires são sempre submerso em meio.

Tabela 1: passos críticos no protocolo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Este manuscrito descreve a configuração e a implementação da plataforma de engenharia, biowire, para melhorar a maturao de HPSC-CMs. O dispositivo pode ser feito em instalações de microfabricação padrão, e biowires pode ser produzido com técnicas de cultura de células comuns e um estimulador elétrico.

Para nosso conhecimento, não há nenhum método relatado semelhante ao biowires. Esta estratégia revela que a melhoria das propriedades de maturação foram dependentes do regime de estimulação eléctrica, como evidenciado pelo maior nível de maturação obtidas nos biowires submetidas ao regime de estimulação maior taxa de aceleração (6 Hz versus 3 Hz). Cardiomiócitos em biowires demonstrada automatismo menos e mais elevadas correntes de hERG e IK1 em comparação com EBs cultivada durante 20 dias (EBd20) ou para 40-44 dias (EBd44). EBd20 cardiomiócitos representadas as propriedades de células antes da sua incorporação biowires, ao passo que os cardiomiócitos EBd44 foram cultivados 10 dias longer do que o tempo de cultura biowire e mostra que, mesmo com um tempo mais longo em cultura em formato EB, cardiomiócitos não pode chegar a propriedades de maturação equivalentes como as induzidas por estimulação eléctrica em biowires. No entanto, os cardiomiócitos obtidos através biowires ainda não são tão maduro como cardiomiócitos adultos.

A estimulação mecânica tem sido sugerido para ser eficaz na indução de proteínas estruturais de HPSC-CMs. No entanto, a estimulação mecânica não conduziu a maturação electrofisiológico 12. Isto poderia sugerir a necessidade de combinar a estimulação eléctrica e o stress mecânico, sequencialmente ou simultaneamente, para induzir a diferenciação terminal em cardiomiócitos HPSC-derivados. A combinação de estimulação eléctrica com outros métodos, incluindo a entrega de bioquímica factores 17 e o alinhamento das células em tecidos 3D 18, pode ser capaz de alcançar uma strate pró-maturação mais eficazPara futuros estudos in vivo .

As dimensões do dispositivo de biowire usado aqui são 5 mm x 1 mm x 0,3 mm (comprimento x largura x altura), mas é possível modificar o dispositivo para produzir biowires mais longos. No entanto, a altura dos biowires é limitada a 0,3 mm (com um raio de ~ 300 μm após a compactação do gel), dadas as limitações no fornecimento de oxigênio em tecidos maiores. Para ultrapassar esta limitação de geração de tecidos mais espessos, seria necessário um método de perfusão 19 . No entanto, recomenda-se manter a proporção de 0,5 x 10 6 células / 0,5 cm de fio de comprimento. Para biowires mais longos, a polimerização do gel do colagénio pode fazer exame mais por muito tempo, e as mudanças mais freqüentes do meio podem ser necessitadas devido ao número aumentado das pilhas. Além disso, a configuração actual do biowire utilizando sutura de seda não permite a medição da força de contracção gerada pelos cardiomiócitos semeados. No entanto, o uso de uma sutura biodegradávelE isto possível no futuro.

O tipo de célula utilizado para fazer o biowire aqui descrito é hESC-CM utilizando a linha de células Hes2 20 . O protocolo também poderia utilizar linhas de células HiPSC ( eg, CDI-MRB e HR-I-2Cr-2R) 14 . A capacidade cardiomiogénica de diferentes linhas de células estaminais humanas pode ser diferente e a adequação para esta plataforma deve ser determinada experimentalmente e as condições optimizadas conforme necessário. Existem várias etapas críticas dentro do protocolo (consulte a Tabela 1 ).

Adicionalmente, os biowires foram projetados para caber em uma placa de 6 poços, eo exemplo aqui mostrou a fabricação de um biowire. No entanto, é possível cultivar e estimular eletricamente múltiplos biowires simultaneamente em um poço.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa-in-aid from the Heart and Stroke Foundation of Canada (G-14-0006265), subvenções de funcionamento dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (137352 e 143066), e um subsídio da Fundação JP Bickell (1013821 ) à SSN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Ascorbic acid Sigma A-4544 hPSC-CM culture media componet
AutoCAD Autodesk, Inc Software to design device
Carbon rods, Ø 3 mm Electrical stimulator chamber component
Collagen, type 1, rat tail BD Biosciences 354249 Collagen gel: 2.1 mg/mL of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1x M199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel.
Collagenase type I  Sigma C0130 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 mL aliquots. Store at -20 °C.
Deoxyribonuclease I (DNase I) EMD Millipore 260913-25MU Make 1 mg/mL DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 mL aliquots at −20 °C
Drill & drill bits (Ø 1 mm and 2 mm) Dremel Drill holes in polycarbonate frames
Electrical stimulator Grass s88x
Fetal bovine serum (FBS) WISENT Inc. 080-450
D-(+)-Glucose  Sigma G5767 Collagen gel component
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
H2O MilliQ 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions
HEPES Sigma H4034 Collagen gel component
Hot plate Torrey Pines HS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440053
Mask aligner EVG  EVG 620
Matrigel, growth factor reduced  Corning 354230 Collagen gel component
Medium 199 (M199) Thermo Fisher Scientific 11825015 Collagen gel component
Monothioglycerol (MTG) Sigma M-6145 hPSC-CM culture media componet
Orbital shaker VWR 89032-088
Penicillin/Streptomycin (P/S) Thermo Fisher Scientific 15070063
Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+  Thermo Fisher Scientific 14040133
Plate (6-well) Corning 353046
Plate (6-well), low attachment Corning 3471
Platinum wires, 0.2 mm Electrical stimulator chamber component
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Doe & Ingalls Inc. To develop the wafer
Pouch, peel-open Convertors 92308 For steam sterilization
Silicon wafer, 4 inch UniversityWafer Inc.
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761 Collagen gel component
Sodium hydroxide Sigma S8045 Collagen gel component
Sprin coater Specialty Coating Systems G3P-8
StemPro-34 culture medium Thermo Fisher Scientific 10639011 hPSC-CM culture medium. To make 50 mL, add 1.3 mL supplement, 500 μL of 100× L-Glutamine, 250 μL of 30 mg/mL transferrin, 500 μl of 5 mg/mL ascorbic acid, 150 μL of 26 μl /2 mL monothioglycerol (MTG), and 500 μL (1 %) penicillin/streptomycin.
Stop media Wash medium:FBS (1:1)
SU-8 50  MicroChem Corp. photoresist, master component
SU-8 2050  MicroChem Corp. photoresist, master component
Transferrin Roche 10-652-202 hPSC-CM culture media componet
Trypsin/EDTA, 0.25% Thermo Fisher Scientific 25200056 hPSC-CM culture media componet
Wash medium IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10, (3), 034005 (2015).
  2. Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
  3. Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, (0), 85-106 (2015).
  4. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, (7194), 524-528 (2008).
  5. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, (9), 1125-1136 (2012).
  6. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (27), E1848-E1857 (2012).
  7. Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285, (6), H2355-H2363 (2003).
  8. Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24, (2), 236-245 (2006).
  9. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114, (3), 511-523 (2014).
  10. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90, (2), 223-230 (2002).
  11. Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (52), 18129-18134 (2004).
  12. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6, (10), e26397 (2011).
  13. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109, (1), 47-59 (2011).
  14. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10, (8), 781-787 (2013).
  15. Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. (2015).
  16. Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15, (24), 2791-2806 (2009).
  17. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
  18. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, (23), 5813-5820 (2013).
  19. Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93, (2), 332-343 (2006).
  20. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18, (4), 399-404 (2000).
Maturação de cardiomiócitos estaminais humanas derivadas de células em Biowires Usando Electrical Stimulation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).More

Sun, X., Nunes, S. S. Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (123), e55373, doi:10.3791/55373 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter