Summary
Meiose er den udviklingsmæssige proces hvorved mælke dannes ved en enkelt runde af DNA-replikation og to efterfølgende runder af kromosom adskillelse. Pattedyr meiose kan undersøges ved at benytte en teknik til at forberede meiotiske kromosom spreads. Her viser vi en metode til at forberede overflade-spredning kerner fra mus spermatocytes.
Abstract
Pattedyr meiose er en dynamisk udviklingsproces, der forekommer i kimceller og kan studerede og karakteriseret. Ved hjælp af en metode til at sprede kerner på overfladen af dias (i stedet for at slippe dem fra en højde), vi vise en optimeret teknik på mus spermatocytes, der blev første gang beskrevet i 1997. Denne metode er meget udbredt i laboratorier til at studere pattedyr meiose, fordi det giver et væld af høj kvalitet kerner gennemgår substages af prophase I. Seminiferous tubules placeres først i en hypotonic løsning til at svulme spermatocytes. Så spermatocytes er udgivet i en rørsukkeropløsning til at oprette en cellesuspension, og kerner er spredt på fiksativ-gennemblødt glas lysbilleder. Efter immunfarvning, en mangfoldighed af proteiner germane til meiotiske processer kan undersøges. For eksempel, kan proteiner i synaptonemal-komplekset, en tredelt struktur, der forbinder kromosom akser/kerner af homologs sammen visualiseres nemt. Meiotiske rekombination proteiner, der er involveret i reparation af DNA dobbelt-strenget pauser af homologe rekombination, kan også være immunostained til at evaluere progression af prophase jeg. Her vi beskrive og vise i detaljer en teknik udbredt at studere pattedyr meiose i spermatocytes fra unge eller voksne mandlige mus.
Introduction
Mus er udbredt som en model organisme for at studere meiose i pattedyr. Både normale udviklingsprocesser og fejl, der opstår under meiose kan vurderes. Tidslinjen og progression af iøjnefaldende funktioner, der opstår under prophase og substages, samt et væld af specifikke proteiner involveret i processer afgørende for reguleringen af meiosen kan karakteriseres både vildtype og mutant-mus. Flere specialiserede processer, der opstår under meiose jeg kan studeres i detaljer (gennemgik i Händel og Schimenti1). Disse omfatter DNA dobbelt-strenget pause (DSB) dannelse og reparation, rekombination, synaptonemal kompleks dannelse og kromosom adskillelse.
Et vigtigt aspekt af at studere meiotiske processer er mulighed for at undersøge kerner indeholdende homologe kromosomer, der er visuelt og optisk løst for bedre at skelne og identificere substages af prophase I. Prophase jeg består af 5 substages der er kendetegnet ved bestemte funktioner, herunder dannelsen af synaptonemal complex (SC). Overvågningsudvalget er en treparts protein stillads, der gør det muligt for parring og DNA dobbelt-strenget pause reparation af homologs. Under leptonema justere homologs aksial elementer af SC er fastsat. Derefter letter tilknytning af centrale elementer til synaptonemal komplekset under zygonema parring og fysisk forbindelse (synapsis) mellem par af homologs. Under pachynema, synapsis af homologs bliver komplet og DNA delefiltre er dannet af reparation af en udvalgt population af DNA dobbelt-strenget pauser via homologe rekombination. SC dekompilerer under diplonema, så homologs desynapse men blive siddende på deres centromeres og på lokaliteter af DNA delefiltre. Endelig under diakinesis, homologs recondense og overgangen til metafase forekommer1.
Historisk, overflade-spredning af meiotiske kromatin givet få kerner, især dem fra tidlige stadier af prophase jeg2. Som et resultat, blev disse metoder ændret for at forbedre adskillelse af celler fra væv (dvs testiklerne eller æggestokkene), sprede meiotiske kromatin teknik, og udbyttet af høj kvalitet meiotiske kerner til evaluering2,3, 4. Desuden er denne metode har vist sig for at være nyttige i at bevare nukleare og kromatin bundet proteiner i meiotiske kerner, som det fremgår af offentliggjorte immunolocalization teknikker5,6,7. Derfor, metoden oprindeligt beskrevet af Peters2 og viste her udbytter mange separate brast spermatocyte kerner indeholdende homologs gennemgår leptotene, zygotene, pachytene, diplotene og diakinesis substages af prophase jeg.
Teknik til at forberede overflade-spredning kerner (også kaldet kromatin spredning analyse) er meget udbredt at studere meiose inden for reproduktiv og cellebiologi. Dias, der indeholder overflade-spredning kerner kan efterfølgende immunostained med antistoffer mod proteiner af interesse eller underkastes sølv farvning, og derefter analyseres med mikroskopi. Metoden er den samme for både mandlige og kvindelige mus, selv om ændringer er blevet beskrevet for hunmus2. Det er afgørende ikke at overmince seminiferous tubules. Kerner skal også fordeles godt, så at følge immunfarvning homologs og tilknyttede proteiner ses tydeligt med mikroskopi. Overflade-spredning kerner kan tilberedes på blot et par timer og enten immunostained straks eller opbevares ved-80 ° C i højst 3 uger før optøning og immunfarvning. Optimale resultater fås dog bedst for nogle proteiner, hvis immunfarvning udføres straks eller senest 2 uger efter udarbejdelsen af overflade-spredning kerner. Slides kan blive immunostained med en standard-protokol ved hjælp af antistoffer mod proteiner af interesse, efterfulgt af inkubation med sekundære antistoffer konjugeret til fluorescerende proteiner eller farvestoffer, så afbildet med Fluorescens mikroskopi8. Postnatal dag 15-21 er der tilstrækkelig væv pr. par vildtype testiklerne til at give 6-10 dias, og ældre mus (herunder voksne) vil give flere dias. Dog vil vilde type mus 6 ugens i alder og ældre også give mere post meiotiske celler (dvs. spermatider) på dias efter immunfarvning. Derudover alle substages af prophase jeg kan observeres hos unge og voksne mus. Testiklerne fra hanner på postnatal dage 10 gennem 15 vil give mange flere leptotene og zygotene celler. Mus ældre end postnatal dag 14-15 vil give mere pachytene og diplotene kerner.
Her vi beskrive og dokumentere en meget udbredt metode at forberede overflade-spredning kerner fra mus spermatocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder der involverer mus udnyttede høje etiske og sociale standarder, og blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på Drexel University College of Medicine.
1. forberedelse af løsninger og nødvendige instrumenter
- Forberede Hypotonic udvinding Buffer (HEB) i 50 mL ultrarent laboratorium grade vand, pH 8.2-8.4 (tabel 1). Gøre løsning frisk hver gang, holde på is, og brug inden for 2 timer til at forberede opslag; Det er nødvendigt at optimere reduktion og protease hæmmende aktiviteter af DTT og PMSF, henholdsvis. Brug 10 mL af HEB for hvert par af musen testiklerne.
- Forbered en 100 mM rørsukkeropløsning (frisk hver gang) ved at tilføje 0.342 g saccharose til 10 mL i ultrarent laboratorium grade vand. PH indstilles til 8.2
- Forberede Fikseringsvæske løsning (1% PARAFORMALDEHYD (PFA), 0,15% Triton X-100, pH justeret til 9.2 med 1 N HCl eller 1 N NaOH) friske månedlige og butik det ved stuetemperatur beskyttet mod lys. Fortynde en 16% kommercielt tilgængelige PFA start lager til 4% i 1 X PBS til brug som en arbejdende bestand, og derefter gemme 4% alikvoter ved-20 ° C.
- For at forberede den Fikseringsvæske løsning, tilsættes 10 mL af 4% PFA løsning og 600 µL af 10% Triton X-100 til 30 mL 1 X PBS, bland godt, og ph indstilles til 9.2 med 1 N HCl eller 1 N NaOH. Gemme den Fikseringsvæske løsning i en 50 mL konisk tube indpakket i alufolie ved stuetemperatur (for ikke mere end 4 uger).
- Forberede vask løsninger (mens dias tørring de sidste 30 min) med foto-Flo 200: 0,4% foto-Flo 200/PBS (320 µL af foto-Flo 200 i 80 mL 1 X PBS) og 0,4% foto-Flo 200/dH2O (160 µL af foto-Flo 200 i 40 mL ultrarent laboratorium grade vand). Brug en 50 mL Coplin krukke fyldt med 40 mL af løsninger til at vaske 10 eller færre dias ad gangen.
- Forberede følgende instrumenter: 1 par kirurgisk saks (til incise huden), 1 par fine tip kirurgisk saks (til incise bughinden), 2 par lige fin spids pincet (at dissekere ud hver testiklerne), 1 lige kant barberblad (til incise hver testiklerne), 2 par buet spids pincet (til at immobilisere hver testiklerne og klemme ud de seminiferous tubules), 50 mL Coplin krukker, Teflon udskrives 3 ring dias, 1 skalpel med størrelse 11 blade, befugtet kammer, 100 x 15 mm petriskåle, fin spids permanent markør eller blyant, og et platform roterende shaker.
- Place præmie tomt precleaned matteret ende glas dias oprejst i en 50 mL Coplin krukke fyldt med Fikseringsvæske løsning indtil brug.
Bemærk: Blyant er at foretrække hvis dias vil blive brugt senere i procedurer kræver ethanol, såsom fluorescens i situ hybridisering.
- Place præmie tomt precleaned matteret ende glas dias oprejst i en 50 mL Coplin krukke fyldt med Fikseringsvæske løsning indtil brug.
2. spermatocyte kerner spredning
- Aflive en mandlig mus efter institutionelle retningslinjer (f.eks. celleforandringer dislokation med eller uden CO2 kvælning).
- Brug P10 - P20 hanner at evaluere meiotiske celler i den første bølge af spermatogenesen; Vi bruger rutinemæssigt P15 - P17 mænd at få celler fra alle substages prophase i. voksen testiklerne vil give celler fra prophase jeg også, men de vil også give mere postmeiotiske celler, såsom spermatider.
- Høst og vejer testiklerne (optage de parrede vægte); derefter placere dem i en petriskål, som indeholder et par dråber af kolde HEB at holde dem fugtige.
- Hold testiklerne mod bunden af skålen med buet spids pincet og bruge en lige kant barberblad til at gøre en lille lodret midterlinjen snit gennem kapsel af testiklerne. Mens du stadig holder testiklerne mod bunden af skålen med en pincet, skal du bruge et andet sæt af buet spids pincet eller lige kant barberblad til forsigtigt klemme de seminiferous tubules fra testiklerne.
- Placer tubuli ind i en 15 mL konisk rør indeholdende 10 mL koldt HEB, pasning til at undgå at sætte stykker af kapsel ind i røret. Gentag disse trin med den anden testikel.
- Inkubér decapsulated seminiferous tubules i den koniske rør indeholdende HEB på is i 30-60 min., afhængigt af størrelsen af testiklerne. Inkuber seminiferous tubules fra et par af testiklerne vejer 30 mg eller mindre for 30 min, tubuli fra et par af testiklerne vejer 31 til 50 mg for 30-45 minutter, og større testikler i 60 minutter. Ændre ikke tider for en enkelt testis.
Bemærk: Den optimale inkubationstiden kan variere afhængigt af erfaringerne fra eksperimentatoren, de reagenser og mus ved at blive analyseret. - Mens seminiferous tubules inkubere i HEB, brug en markør eller blyant til at mærke matteret enderne af precleaned dias med musen nummer, diasnummer og dato. Derefter placere de pre renset dias i en Coplin krukke indeholdende den Fikseringsvæske løsning.
- Efter inkubation, hæld tubuli og HEB i en ren petriskål og separat tubuli i ca 3 mm diameter klumper. Hver klump udbytter 2 rutschebaner og antallet af dias givet afhænger af størrelsen af testiklerne.
Bemærk: Vi får 8 dias fra vildtype og 6 slides fra subfertile Chtf18-null P16 testiklerne (som er mindre på grund af nedsat antal meiotiske og mitotiske kønsceller8). Én voksen testis vejer 100 mg eller mere forventes at give 16 slides. - Plads 23 µL af 100 mM rørsukkeropløsning i en ring af en Teflon udskrives, 3 ringe dias og tilføje en klump af seminiferous tubules til ringen. Derefter bruge buet spids pincet til at holde klump, forsigtigt hakkekød tubuli med en størrelse 11 barberblad, indtil løsningen bliver overskyet.
Bemærk: Ikke overmince, da dette vil resultere i fragmenterede kromosomer. Bemærk at fragmenterede kromosomer også kunne være et tegn på en mutant fænotype. - Fjerne snavs, tilføje en anden 23 µL af rørsukkeropløsning, og bruge en mikropipette til at forsigtigt afpipetteres blandingen op og ned et par gange til at hjælpe med at adskille cellerne i suspension.
- Fjerne et dias iblødsætning i Coplin krukke indeholdende Fikseringsvæske løsning og vippe diasset over krukken, så at en generøs droplet indsamler på nederste hjørne på diaset.
- Med pipette overfoeres 20 µL af saccharose cellesuspension fra ring af Teflon trykte 3 ring dias i Fikseringsvæske slipværktøjet på en præmie frosted glas dias, og med pipette overfoeres suspension op og ned ad 2 - 3 gange.
Bemærk: Fikseringsvæske slipværktøjet skal være stor nok i volumen, således at tilsætningen af 20 μL af saccharose cellesuspension til det giver dækning på tværs af hele diaset, når blandingen spredes (Se 2.11 nedenfor).
- Med pipette overfoeres 20 µL af saccharose cellesuspension fra ring af Teflon trykte 3 ring dias i Fikseringsvæske slipværktøjet på en præmie frosted glas dias, og med pipette overfoeres suspension op og ned ad 2 - 3 gange.
- Langsomt tilt dias til side overfor denne droplet til at sprede cellesuspension langs længden af diaset. Derefter langsomt tilt dias tilbage for at sprede cellesuspension langs bredden af diaset for at dække det helt. Undgå at sprede suspension over samme område af dias mere end én gang ellers cellerne vil overlappe hinanden.
- Straks Placer slide lejlighed i en fugtig kammer og gentage trin 2.8 til 2.11 indtil alle klumper af seminiferous tubules har været brugt til at gøre dias. Det er vigtigt ikke at flytte befugtet salen under tørringen at undgå rive og overlappende celler.
- Tillad dias til inkuberes i en overdækket befugtet kammer ved rumtemperatur i 2,5 timer, således at de tørrer langsomt og ikke helt. Høj luftfugtighed og langsom tørring i dette trin er vigtigt at sikre tilstrækkelig spredning af kromatin. Derefter fjerne dækning af salen og tillade dias til at lufttørre helt en yderligere 30 min.
- Sted dias (ryg mod ryg eller i et zigzag mønster) i et Coplin krukke indeholdende 0,4% foto-Flo 200/1 X PBS løsning og vaske dias to gange, 5 min, af forsigtigt agiterer for Coplin jar på en platform, roterende shaker. Brug frisk løsning for hver vask og holde dias fra forskellige mus i separate krukker for hver af vasker.
- Vask dias i en Coplin krukke indeholdende 0,4% foto-Flo 200/dH2O løsning for 5 min gang mens agiterer.
- Fjern dias fra Coplin jar (sidste vask), forsigtigt tørre kanter og bunden af dias til at fjerne overskydende væske, og placere dias på en vinklet, næsten oprejst stilling til at tørre. En eksperimentatoren, der er dygtige i denne teknik kan behandle og forberede overflade-spredning kerner fra 4 eller 5 mus i én dag.
- Når tørre (15-20 min), behandle dias straks for immunofluorescens farvning eller opbevares ved-80 ° C i en tæt lukket dias boks beskyttet mod lys for maksimalt 3 uger (afhængigt af målet proteiner evalueres; optimale resultater kan opnås hvis farves samme dag eller inden for 2 uger).
- Hvis opbevares ved-80 ° C, lad derefter dias til at komme til stuetemperatur og vaske i et Coplin krukke indeholdende 1 X PBS eller Bloker for 5 min før farvning.
Bemærk: Mange forskellige immunofluorescens farvningsprotokoller vil give gode resultater; henvise til Berkowitz et al. for en immunfarvning protokol8.
- Hvis opbevares ved-80 ° C, lad derefter dias til at komme til stuetemperatur og vaske i et Coplin krukke indeholdende 1 X PBS eller Bloker for 5 min før farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metodes evne til at levere store mængder af overfladen spredt kerner indeholdende intakt homologs afhænger af tre hovedfaktorer: 1) passende inkubationstiden for seminiferous tubules i hypotonic buffer (dvs. HEB) at opnå tilstrækkeligt svulmede spermatocyte kerner, der brast men ikke smuldre fra forlænget inkubering i HEB, 2) micropipetting saccharose dråber af celler til at opnå en adskilt suspension af kerner, der ikke er klumpet sammen og 3) vippe hver fiksativ belagt slide i én retning ad gangen og ikke frem og tilbage. Når der tilberedes, overflade spredning kerner kan være immunostained med fluorescently mærket antistoffer til proteiner af interesse og derefter afbildet med mikroskopi (repræsentative eksempler er vist i figur 1 og figur 2. Figur 1 viser eksempler på vildtype pachytene kerner, som er godt spredt (A), kerner der indeholder ulige immunostained, laset optræder homologs på grund af inkubation i HEB for lang b, fordelt dårligt overlappende kerner (C), og kerner indeholdende fragmenterede homologs på grund af "overmincing" af seminiferous tubules (D). Når teknikken er udført godt, et væld af kerner, der repræsenterer de vigtigste 5 substages af prophase jeg kan opnås. Figur 2 viser leptotene, zygotene, pachytene, diplotene og diakinesis stadier af prophase jeg i kerner af vildtype spermatocytes fra unge mænd.
Figur 1: Overfladen spredt kerner af vildtype spermatocytes fra juvenile mus.
Pachytene spermatocyte kerner var plettet med anti-SYCP3 (grøn), som pletter aksial/lateral elementer af synaptonemal complex (A) godt spredt kerner. (B) kerner fra seminiferous tubules inkuberes i HEB for længe. (C) dårligt fordelt overlappende kerner. (D) fragmenterede homologs på grund af "overmincing" af seminiferous tubules (pilespidser angive to små homolog fragmenter). Skalalinjen er 5 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempler på kerner fra substages af prophase jeg.
Vildtype spermatocytes fra unge mænd blev farves med CREST serum (rød), som pletter centromeres, og anti-SYCP3 (grøn), som pletter aksial/lateral elementer af synaptonemal kompleks. Leptotene, zygotene, pachytene, diplotene og diakinesis stadier af prophase, henholdsvis, er vist. Skalalinjen er 5 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Mængde | Endelig koncentration |
| 1 M Tris-Cl (pH 8,2) | 1,5 mL | 30 mM |
| Saccharose | 0.85575 g | 50 mM |
| Trinatriumcitrat dihydrat | 0,25 g | 17 mM |
| 0,5 M EDTA | 500 ΜL | 5 mM |
| Dithiothreitol (DTT) | 0.00385 g | 0,5 mM |
| 0,2 M Phenymethylsulfonyl fluorid (PMSF) | 25 ΜL | 0,1 mM |
Tabel 1: Opskrift på Hypotonic ekstraktionsbuffer (HEB).
Tilføje reagenser til 50 mL ultrarent laboratorium klasse vand og justeres til pH 8.2-8.4 (hvis nødvendigt bruge 1 N NaOH opløsning eller 1 N HCl). Forberede frisk HEB hver gang, holde på is, og brug inden for 2 h af forberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at opnå høje antal godt spredt, god kvalitet spermatocyte kerner, de mest kritiske skridt af denne protokol omfatter passende inkubationstiden for seminiferous tubules i HEB, passende hakning af seminiferous tubules, og teknikken ansat til at fordelt cellesuspension saccharose på den Fikseringsvæske belagt dias. Vi Inkuber seminiferous tubules fra testiklerne vildtype hanner spænder fra postnatal dag 15 til voksenliv i HEB for 45 min, mens testiklerne fra sammenligneligt alderen Chtf18-null mus inkuberes i kun 30 min fordi testiklerne er halv størrelse og indeholder væsentligt færre kønsceller8. Vores erfaring, inkubation af Chtf18-null testiklerne for længere end 30 min kompromiser integriteten af de celler, hvilket resulterer i dårligt løst homologs. Seminiferous tubules er hakket kun for at få en overskyet saccharose cellesuspension, og hver side skal indeholde en generøs dråbe af fiksativ før spredning (Se 2.10). Dias er vippet i én retning ad gangen og ikke frem og tilbage. Metoden er ideel til at studere meiose jeg, men det er stort set begrænset til substages af prophase jeg. Men kerner i premeiotic S fase, metafase I og II kan observeres og har været rapporteret7,9.
Dette er en enkel metode, som nødvendiggør nogle praksis for at opnå kompetence og bedste resultater. Suboptimale resultater kan opstå af flere forskellige årsager. Kerner kan ikke være godt spredt, resulterer i klynger eller overlappende celler. Dette kan forekomme, hvis cellesuspension saccharose ikke er tilstrækkeligt pipetted eller der er ikke nok fiksativ på diaset for at sprede kerner godt. Hvis dias ikke er belagt med nok resterende fixativ eller cellesuspension er ikke fordelt på dias i en glat retning eller gentagne gange spredt frem og tilbage, vil celler overlapper og klumper sig sammen. Hvis seminiferous tubules er "overminced" så homologs kan være fragmenteret eller synes noget strimlet. Fordi mutant testiklerne kan være mindre, indeholder færre spermatocytes og være mere modtagelige for "overmincing" eller opsplitning af seminiferous tubules, anbefaler vi øve et par gange på kontrol (f.eks. vildtype) testiklerne først at optimere teknik i den hænderne på en novice.
Forberede overflade spredning kerner er en grundlæggende teknik, der anvendes til at undersøge vigtige lovgivningsmæssige skridt og progression af meiose, samt at karakterisere meiotiske fænotyper i mus. Derfor, vi bruge denne metode omfattende og lære alle nye lab medlemmer at udføre det. Når denne teknik er mestret, kan et utal af andre teknikker bruges efterfølgende og sammenholdt med det. For eksempel, flere typer af immunfarvning og/eller mikroskopi herunder widefield eller Konfokal med epifluorescensmikroskop eller Elektron Mikroskopi kan udføres. Ud over at studere meiose-specifikke proteiner som komponenter i synaptonemal kompleks, kan dem interagere med SC, såsom cohesins, multiprotein komplekser, der mægle samhørighed, evalueres (revideret i 10,11 12). Regulering af DNA crossover dannelse, forarbejdning og modning kan være og er også blevet undersøgt med denne teknik13. In addition, denne teknik er blevet udført efter brugen af metoder til at opnå specifikke populationer af mus spermatocytes: 1) efter kultur af spermatocytes i indhold af okadainsyre at fremkalde progression til G2/MI overgangen, giver øgede antallet af diplotene, diakinesis og metafase jeg spreder14,15 og 2) efter metoder, der anvendes til at isolere en beriget befolkning pachytene spermatocytes14.
Teknik til at forberede overflade-spredning kerner fra mus spermatocytes beskrevet og vist her er en yderst nyttig og enkel teknik. Det er indbegrebet at hvert laboratorium, der studerer meiose med mus som en model organisme, men kræver nogle praksis og finesse at opnå de bedste resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender den tekniske bistand af Abigail Harris. De erkender også Paula Cohen og Kim Holloway for at hjælpe til at optimere forbereder overflade-spredning kerner fra mus spermatocytes-protokollen. Forfatterne også sætte pris på kritisk læsning af manuskript af Karen Schindler.
Dette arbejde blev støttet af NIH R01 GM106262 til K.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
References
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R.
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
