Summary
अर्धसूत्रीविभाजन विकास प्रक्रिया है जिसके द्वारा gametes डीएनए प्रतिकृति के एक दौर के माध्यम से और गुणसूत्र अलगाव के दो लगातार दौर के माध्यम से गठित कर रहे हैं । स्तनधारी अर्धसूत्रीविभाजन meiotic गुणसूत्र फैलता तैयार करने के लिए एक तकनीक का उपयोग करके जांच की जा सकती है । यहां, हम माउस spermatocytes से सतह फैल नाभिक तैयार करने की एक विधि का प्रदर्शन ।
Abstract
स्तनधारी अर्धसूत्रीविभाजन एक गतिशील विकास प्रक्रिया है कि रोगाणु कोशिकाओं में होता है और अध्ययन किया जा सकता है और विशेषता है । एक विधि का उपयोग करने के लिए स्लाइड की सतह पर नाभिक प्रसार (बजाय उंहें एक ऊंचाई से छोड़ने), हम माउस spermatocytes है कि पहले १९९७ में वर्णित किया गया था पर एक अनुकूलित तकनीक का प्रदर्शन । यह विधि व्यापक रूप से प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है स्तनधारी अर्धसूत्रीविभाजन अध्ययन क्योंकि यह उच्च गुणवत्ता के एक बहुतायत पैदावार नाभिक के दौर से गुजर सेमिनीफेरस नलिकाओं पहले एक hypotonic समाधान में रखा जाता है गज़ब spermatocytes । फिर spermatocytes एक सेल निलंबन बनाने के लिए एक सुक्रोज समाधान में जारी कर रहे हैं, और नाभिक निर्धारण लथपथ गिलास स्लाइड पर फैले हुए हैं । immunostaining के बाद, प्रोटीन की विविधता meiotic प्रक्रियाओं के लिए जर्मन की जांच की जा सकती है । उदाहरण के लिए, synaptonemal कॉम्प्लेक्स के प्रोटीन, एक त्रिपक्षीय संरचना जो गुणसूत्र अक्षों को जोड़ता है/एक साथ homologs के कोर आसानी से visualized किया जा सकता है । Meiotic पुनर्संयोजन प्रोटीन, जो मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा डीएनए डबल-किनारा टूटता की मरंमत में शामिल कर रहे हैं, भी immunostained जा सकता है के लिए दौर की प्रगति का मूल्यांकन मैं । यहां हम वर्णन और विस्तार से एक तकनीक व्यापक रूप से किशोर या वयस्क पुरुष चूहों से spermatocytes में स्तनधारी अर्धसूत्रीविभाजन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया प्रदर्शन ।
Introduction
चूहों बड़े पैमाने पर एक मॉडल जीव के रूप में उपयोग किया जाता है स्तनधारियों में अर्धसूत्रीविभाजन अध्ययन । अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान होने वाली सामान्य विकासात्मक प्रक्रियाओं और दोषों दोनों का मूल्यांकन किया जा सकता है. समयरेखा और मुख्य विशेषताएं है कि मैं और उपचरण दौर के दौरान होते है की प्रगति, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट अर्धसूत्रीविभाजन के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में शामिल प्रोटीन की एक भीड़ दोनों जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती चूहों में विशेषता हो सकती है । कई विशेष प्रक्रियाओं है कि अर्धसूत्रीविभाजन मैं विस्तार से अध्ययन किया जा सकता है के दौरान हो (Handel और Schimenti1में समीक्षा की) । इनमें डीएनए डबल-किनारा तोड़ (DSB) गठन और मरंमत, पुनर्संयोजन, synaptonemal जटिल गठन, और गुणसूत्र अलगाव शामिल हैं ।
meiotic प्रक्रियाओं का अध्ययन करने का एक महत्वपूर्ण पहलू नाभिक की जांच करने की क्षमता है जो मुताबिक़ गुणसूत्रों से युक्त हैं जो नेत्रहीन और ऑप्टिकल रूप से बेहतर भेद करने के लिए हल किए गए हैं और मैं दौर के उपक्रमों की पहचान करता हूं । मैं 5 उपस्तर के शामिल है । कि synaptonemal परिसर (अनुसूचित जाति) के गठन सहित विशिष्ट सुविधाओं की विशेषता है । अनुसूचित जाति एक त्रिपक्षीय प्रोटीन पाड़ है कि बाँधना और डीएनए homologs के दोहरे-किनारा तोड़ने की मरंमत में सक्षम बनाता है । leptonema के दौरान, अनुसूचित जाति के अक्षीय तत्वों के रूप में homologs संरेखित रखी जाती है । तो zygonema के दौरान synaptonemal परिसर में केंद्रीय तत्वों की कुर्की पेयरिंग और homologs के जोड़े के बीच शारीरिक कनेक्शन (synapsis) की सुविधा. pachynema के दौरान, homologs के synapsis पूरा हो जाता है और डीएनए क्रॉसओवर डीएनए डबल-किनारा टूट मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से एक का चयन जनसंख्या की मरंमत से बनते हैं । अनुसूचित जाति diplonema के दौरान जुदा है, homologs desynapse के लिए अनुमति देता है लेकिन उनके centromeres में और डीएनए क्रॉसओवर की साइटों पर संलग्न रहते हैं । अंत में diakinesis के दौरान, homologs reसंघनित्र और metaphase के लिए संक्रमण होता है1।
ऐतिहासिक, सतह meiotic क्रोमेटिन के प्रसार कुछ नाभिक, विशेष रूप से दौर मैं2के प्रारंभिक दौर से उन उपज । नतीजतन, इन तरीकों के ऊतकों (यानी वृषण या अंडाशय), meiotic क्रोमेटिन के प्रसार की तकनीक, और मूल्यांकन के लिए उच्च गुणवत्ता meiotic नाभिक की उपज की जुदाई में सुधार करने के लिए संशोधित किया गया2,3, 4. इसके अलावा, इस विधि के रूप में प्रकाशित immunolocalization तकनीक5,6,7द्वारा प्रदर्शन के रूप में meiotic नाभिक में परमाणु और क्रोमेटिन बंधे प्रोटीन के संरक्षण में उपयोगी साबित हुआ । इसलिए, विधि शुरू में पीटर्स2 द्वारा वर्णित है और यहां प्रदर्शन कई अलग फट spermatocyte नाभिक युक्त homologs leptotene, zygotene, pachytene, diplotene, और diakinesis के दौर के दौर से गुजर रहा है ।
भूतल-प्रसार नाभिक (जिसे क्रोमेटिन स्प्रेड एनालिसिस भी कहा जाता है) तैयार करने की तकनीक का प्रयोग व्यापक रूप से प्रजनन और कोशिका जीवविज्ञान के क्षेत्रों में अर्धसूत्रीविभाजन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है. सतह प्रसार नाभिक युक्त स्लाइड बाद में ब्याज के प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी के साथ immunostained जा सकता है या चांदी धुंधला के अधीन है, और फिर माइक्रोस्कोपी के साथ विश्लेषण किया । विधि दोनों पुरुष और मादा चूहों के लिए समान है, हालांकि संशोधन महिला चूहों के लिए वर्णित किया गया है2. यह महत्वपूर्ण है सेमिनीफेरस नलिकाओं को भरती नहीं है । नाभिक भी अच्छी तरह से फैल जाना चाहिए ताकि निंनलिखित immunostaining homologs और जुड़े प्रोटीन स्पष्ट रूप से माइक्रोस्कोप के साथ देखा जाता है । सतह के प्रसार नाभिक बस कुछ ही घंटों में तैयार किया जा सकता है और या तो तुरंत immunostained या पर संग्रहित-८० ° c गल और immunostaining से पहले 3 सप्ताह की अधिकतम के लिए । हालांकि, इष्टतम परिणाम सबसे अच्छा कुछ प्रोटीन के लिए प्राप्त कर रहे है अगर immunostaining तुरंत या सतह फैल नाभिक तैयार करने के 2 सप्ताह के भीतर किया जाता है । स्लाइड्स एक मानक प्रोटोकॉल के साथ immunostained किया जा सकता है ब्याज के प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी का उपयोग, माध्यमिक एंटीबॉडी फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रंगों के लिए संयुग्मित के साथ मशीन के बाद, तो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ imaged8. प्रसव दिवस पर 15-21 वहां जंगली प्रकार परीक्षण के प्रति जोड़ी के लिए पर्याप्त ऊतक है 6-10 स्लाइड उपज, और बड़े चूहों (वयस्कों सहित) और अधिक स्लाइड निकलेगा । हालांकि, जंगली प्रकार के चूहों 6 सप्ताह की आयु और पुराने भी immunostaining के बाद स्लाइड पर अधिक पोस्ट-meiotic कोशिकाओं (यानी spermatids) उपज होगी । इसके अलावा, मैं किशोर और वयस्क चूहों में मनाया जा सकता है चरण के सभी उपस्तर । प्रसव दिनों में 10 से 15 के माध्यम से पुरुषों से परीक्षण कई और अधिक leptotene और zygotene कोशिकाओं की उपज होगी । प्रसव दिन 14 से 15 से अधिक पुराने चूहों अधिक pachytene और diplotene नाभिक उपज होगी ।
यहाँ हम वर्णन और माउस spermatocytes से सतह प्रसार नाभिक की तैयारी का एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि का प्रदर्शन.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी तरीकों को शामिल चूहों उच्च नैतिक और कल्याणकारी मानकों का उपयोग किया, और संस्थागत पशु देखभाल और चिकित्सा के Drexel विश्वविद्यालय कॉलेज में उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए ।
1. समाधान और आवश्यक उपकरणों की तैयारी
- Hypotonic निष्कर्षण बफर (HEB) ultrapure प्रयोगशाला ग्रेड पानी, पीएच ८.२-८.४ (तालिका 1) के ५० मिलीलीटर में तैयार करें । समाधान हर बार ताजा बनाओ, बर्फ पर रखने के लिए, और तैयार फैलता है की 2 ज के भीतर का उपयोग करें; इस को कम करने और डीटीटी और PMSF, क्रमशः की बाधा गतिविधियों को छेड़ने का अनुकूलन आवश्यक है । माउस testes के प्रत्येक जोड़ी के लिए HEB के 10 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
- एक १०० mM सुक्रोज समाधान (ताजा हर बार) के लिए सुक्रोज के ०.३४२ जी जोड़कर तैयार ultrapure प्रयोगशाला ग्रेड पानी की 10 मिलीलीटर । ८.२ को पीएच समायोजित करें
- निर्धारण समाधान तैयार (1% paraformaldehyde (पीएफए), ०.१५% ट्राइटन एक्स-१००, पीएच 1 एन एचसीएल या 1 एन NaOH के साथ ९.२ के लिए समायोजित) ताजा मासिक और प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर यह दुकान । एक काम कर शेयर के रूप में उपयोग के लिए 1x पंजाब में 4% करने के लिए एक 16% व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीएफए शुरू स्टॉक पतला, और फिर-20 डिग्री सेल्सियस पर 4% aliquots की दुकान ।
- निर्धारण समाधान तैयार करने के लिए, 10 मिलीलीटर 4% पीएफए समाधान और ६०० µ l के 10% ट्राइटन X-१०० से 30 मिलीलीटर के लिए 1x पंजाब के जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और पीएच को 1 n HCl या 1 n NaOH के साथ ९.२ पर समायोजित करें । एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब कमरे के तापमान पर एल्यूमीनियम पंनी में लिपटे (कोई अधिक से अधिक 4 सप्ताह के लिए) में निर्धारण समाधान की दुकान ।
- धो समाधान तैयार (जबकि स्लाइड पिछले 30 मिनट सूख रहे हैं) फोटो के साथ-फ़्लो २००:०.४% फोटो-फ़्लो 200/(३२० µ एल के फोटो-फ़्लो २०० के ८० मिलीलीटर में 1x पंजाबस) और ०.४% फोटो-फ़्लो 200/डीएच2O (१६० µ l फोटो-फ़्लो २०० की ४० एमएल में ultrapure प्रयोगशाला ग्रेड पानी) । एक समय में 10 या कम स्लाइड धोने के लिए समाधान के ४० मिलीलीटर से भरा एक ५० मिलीलीटर Coplin जार का उपयोग करें ।
- शल्य कैंची की 1 जोड़ी (त्वचा काटकर करने के लिए), ठीक टिप सर्जिकल कैंची की 1 जोड़ी (काटकर के लिए), सीधे ठीक टिप संदंश के 2 जोड़े (प्रत्येक वृषण बाहर टुकड़े करने के लिए), 1 सीधे बढ़त उस्तरा ब्लेड (प्रत्येक काटकर के लिए): निम्नलिखित उपकरणों को तैयार घुमावदार टिप संदंश के 2 जोड़े (प्रत्येक वृषण और निचोड़ बाहर सेमिनीफेरस नलिकाओं), ५० मिलीलीटर Coplin जार, Teflon मुद्रित 3 अंगूठी स्लाइड, आकार 11 ब्लेड के साथ 1 स्केलपेल, humidified चैंबर, १०० x 15 मिमी पेट्री व्यंजन, ठीक टिप स्थाई मार्कर या पेंसिल, और एक मंच घूर्णन शेखर ।
- एक ५० मिलीलीटर Coplin उपयोग जब तक निर्धारण समाधान से भरा जार में प्रीमियम unchargeable अस्वच्छ फ्रॉस्टेड अंत गिलास स्लाइड प्लेस ।
नोट: यदि स्लाइड्स को बाद में इथेनॉल की आवश्यकता वाली प्रक्रियाओं में इस्तेमाल किया जाएगा तो पेंसिल पसंद की जाती है, जैसे प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण.
- एक ५० मिलीलीटर Coplin उपयोग जब तक निर्धारण समाधान से भरा जार में प्रीमियम unchargeable अस्वच्छ फ्रॉस्टेड अंत गिलास स्लाइड प्लेस ।
२. Spermatocyte नाभिक प्रसार
- संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार एक पुरुष माउस को Euthanize (जैसे सर्वाइकल विस्थापन के साथ या बिना कं2 asphyxiation) ।
- शुक्राणुजनन की पहली लहर में meiotic कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए P10-P20 नर का प्रयोग करें; हम नियमित रूप से P15-P17 पुरुषों का उपयोग करने के लिए मैं चरण के सभी उपस्तरों से कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए वयस्क testes मैं भी दौर से कोशिकाओं को प्रदान करेगा, लेकिन वे भी ऐसे spermatids के रूप में अधिक postmeiotic कोशिकाओं, उपज होगा ।
- फसल और टेस्ट वजन (युग्मित भार रिकॉर्ड); इसके बाद उन्हें नम रखने के लिए कोल्ड HEB की कुछ बूंदों से युक्त पेट्री डिश में रखें ।
- घुमावदार टिप संदंश के साथ पकवान के नीचे के खिलाफ वृषण पकड़ो और एक सीधी बढ़त उस्तरा ब्लेड का उपयोग करने के लिए वृषण के कैप्सूल के माध्यम से एक छोटा सा ऊर्ध्वाधर midline चीरा । हालांकि अभी भी एक संदंश के साथ पकवान के नीचे के खिलाफ वृषण धारण, घुमावदार टिप संदंश या सीधे बढ़त उस्तरा ब्लेड के एक दूसरे सेट का उपयोग करने के लिए धीरे नलिकाओं से सेमिनीफेरस वृषण निचोड़ ।
- नलिकाओं को 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में रखें जिसमें 10 मिलीलीटर ठंड HEB, ट्यूब में कैप्सूल के टुकड़ों को रखने से बचने के लिए ध्यान रखना । दूसरी वृषण के साथ इन चरणों को दोहराएँ ।
- 30-60 मिनट के लिए बर्फ पर HEB युक्त शंकु ट्यूब में decapsulated सेमिनीफेरस नलिकाओं की मशीन, testes के आकार पर निर्भर करता है । एक जोड़ी से सेमिनीफेरस नलिकाओं के लिए 30 मिलीग्राम या उससे कम 30 मिनट के लिए, नलिकाओं के लिए 31 वजन ५० मिलीग्राम 30-45 मिनट के लिए परीक्षण की एक जोड़ी से, और ६० मिनट के लिए बड़ा tests । एक एकल वृषण के लिए समय को बदल नहीं है ।
नोट: इष्टतम मशीन समय प्रयोगकर्ता के अनुभव के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, इस्तेमाल किया एजेंट, और चूहों का विश्लेषण किया जा रहा. - जबकि सेमिनीफेरस नलिकाओं HEB में मशीनिंग कर रहे हैं, माउस नंबर, स्लाइड संख्या, और तारीख के साथ अशुद्ध स्लाइडों के फ्रॉस्टेड सिरों को लेबल करने के लिए मार्कर या पेंसिल का उपयोग करें । इसके बाद एक Coplin जार में पूर्व-साफ स्लाइडों को रखें, जिसमें निर्धारण समाधान हो ।
- मशीन के बाद, एक साफ पेट्री डिश में नलिकाओं और HEB डालना, और लगभग 3 मिमी व्यास के झुरमुट में अलग नलिकाओं । प्रत्येक झुरमुट पैदावार 2 स्लाइड और झुकेंगे स्लाइड की संख्या testes के आकार पर निर्भर करता है ।
नोट: हम जंगली प्रकार से 8 स्लाइड और उपउपजाऊ Chtf18-अशक्त P16 tests (जो meiotic और mitotic रोगाणु कोशिकाओं8की कम संख्या के कारण छोटे हैं) से 6 स्लाइड प्राप्त करते हैं । एक वयस्क वृषण वजन १०० मिलीग्राम या अधिक 16 स्लाइड उपज की उंमीद होगी । - एक Teflon मुद्रित, 3 अंगूठी स्लाइड की एक अंगूठी में १०० mM सुक्रोज समाधान के 23 µ एल प्लेस और अंगूठी के लिए सेमिनीफेरस नलिकाओं के एक झुरमुट जोड़ें । फिर घुमावदार टिप संदंश का उपयोग करने के लिए झुरमुट पकड़, धीरे एक आकार 11 उस्तरा ब्लेड के साथ नलिकाओं कीमा जब तक समाधान बादल बन जाता है ।
नोट: यह खंडित गुणसूत्रों में परिणाम होगा के रूप में कीमा न करें । ध्यान दें कि खंडित गुणसूत्रों भी एक उत्परिवर्ती phenotype का संकेत हो सकता है । - मलबे निकालें, सुक्रोज समाधान के एक और 23 µ एल जोड़ने के लिए, और एक micropipette का उपयोग करने के लिए धीरे मिश्रण पिपेट ऊपर और नीचे कुछ समय के लिए निलंबन में कोशिकाओं को अलग मदद करते हैं ।
- निर्धारण समाधान युक्त Coplin जार में भिगोने वाली स्लाइड को निकालें और जार पर स्लाइड को झुकाएं ताकि एक उदार छोटी बूंद स्लाइड के नीचे कोने पर एकत्र हो ।
- Teflon के रिंग से सुक्रोज सेल सस्पेंशन के प्लास्टिक 20 µ l को एक प्रीमियम फ्रॉस्टेड ग्लास स्लाइड पर निर्धारिती छोटी बूंद में 3 रिंग slide मुद्रित करें, और प्लास्टिक को ऊपर और नीचे 2-3 बार दबाएं ।
नोट: निर्धारण छोटी बूंद मात्रा में काफी बड़ा होना चाहिए ताकि सुक्रोज सेल निलंबन के 20 μL के अलावा यह पूरी स्लाइड भर में कवरेज की अनुमति देता है जब मिश्रण फैला है (नीचे २.११ देखें) ।
- Teflon के रिंग से सुक्रोज सेल सस्पेंशन के प्लास्टिक 20 µ l को एक प्रीमियम फ्रॉस्टेड ग्लास स्लाइड पर निर्धारिती छोटी बूंद में 3 रिंग slide मुद्रित करें, और प्लास्टिक को ऊपर और नीचे 2-3 बार दबाएं ।
- धीरे स्लाइड की लंबाई के साथ सेल निलंबन प्रसार करने के लिए छोटी बूंद के विपरीत पक्ष को स्लाइड झुकाव । फिर धीरे से स्लाइड को पूरी तरह से कवर करने के लिए स्लाइड की चौड़ाई के साथ कक्ष निलंबन को फैलाने के लिए वापस झुकाव को झुकाएं । स्लाइड के एक ही क्षेत्र पर निलंबन एक से अधिक एक बार अंयथा कोशिकाओं को एक दूसरे के साथ ओवरलैप जाएगा फैलने से बचें ।
- तुरंत स्लाइड फ्लैट एक humidified चैंबर में जगह और दोहराने कदम २.८ करने के लिए २.११ जब तक सेमिनीफेरस नलिकाओं के सभी झुरमुट स्लाइड बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । यह महत्वपूर्ण है सुखाने की प्रक्रिया के दौरान humidified चैंबर को स्थानांतरित करने के लिए फाड़ और अतिव्यापी कोशिकाओं से बचने के लिए नहीं है ।
- स्लाइड की अनुमति के लिए कमरे के तापमान पर एक कवर humidified कक्ष में २.५ ज के लिए ताकि वे धीरे और नहीं पूरी तरह से सूख । इस चरण में उच्च आर्द्रता और धीमी गति से सुखाने क्रोमेटिन के पर्याप्त प्रसार को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । फिर चैंबर के आवरण को हटाने और स्लाइड की अनुमति के लिए हवा सूखी पूरी तरह से एक अतिरिक्त 30 मिनट ।
- प्लेस स्लाइड (वापस करने के लिए या एक वक्र पैटर्न में) ०.४% फोटो-फ़्लो 200/1x पंजाबियों समाधान से युक्त एक Coplin जार में और दो बार स्लाइड, 5 मिनट प्रत्येक, धीरे से एक ही एक मंच घूर्णन शेखर पर Coplin जार आंदोलन से धो । प्रत्येक धोने के लिए नए सिरे से समाधान का उपयोग करें और प्रत्येक धोने के लिए अलग जार में अलग चूहों से स्लाइड रखने के लिए ।
- एक Coplin जार में स्लाइड धो ०.४% फोटो-फ़्लो 200/dH2O समाधान 5 मिनट के लिए एक बार जब आंदोलन ।
- स्लाइड्स को Coplin जार (अंतिम वाश) से निकालें, अधिक लिक्विड निकालने के लिए स्लाइड् स के किनारों और नीचे की ओर पोंछें, और एक angled, लगभग-लोगोंके स्थान पर स्लाइड्स को सूखने के लिए रखें । एक प्रयोगकर्ता जो इस तकनीक में कुशल है, एक दिन में 4 या 5 चूहों से सतह-प्रसार नाभिक की प्रक्रिया और तैयारी कर सकता है ।
- एक बार सूखी (15-20 मिनट), इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला या स्टोर के लिए तुरंत की प्रक्रिया स्लाइड-८० ° c एक कसकर बंद स्लाइड में 3 सप्ताह की एक अधिकतम के लिए प्रकाश से सुरक्षित बॉक्स में (लक्ष्य प्रोटीन मूल्यांकन किया जा रहा पर निर्भर करता है; इष्टतम परिणाम प्राप्त किया जा सकता है अगर एक ही दिन या 2 सप्ताह के भीतर दाग) ।
- यदि-८० ° c पर संग्रहीत है, तो कमरे के तापमान और 5 मिनट के लिए धुंधला करने से पहले 1x पंजाबियों या ब्लॉक युक्त एक Coplin जार में धोने के लिए आने के लिए स्लाइड की अनुमति दें ।
नोट: कई अलग इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रोटोकॉल अच्छे परिणाम प्रदान करेगा; एक immunostaining प्रोटोकॉल8के लिए Berkowitz एट अल का संदर्भ लें ।
- यदि-८० ° c पर संग्रहीत है, तो कमरे के तापमान और 5 मिनट के लिए धुंधला करने से पहले 1x पंजाबियों या ब्लॉक युक्त एक Coplin जार में धोने के लिए आने के लिए स्लाइड की अनुमति दें ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
इस विधि की क्षमता बरकरार homologs युक्त सतह प्रसार नाभिक की बड़ी संख्या प्रदान करने के लिए तीन मुख्य कारकों पर निर्भर करता है: 1) hypotonic बफर में सेमिनीफेरस नलिकाओं की उचित मशीन समय (यानी HEB) पर्याप्त रूप से प्रफुल्लित spermatocyte प्राप्त करने के लिए नाभिक कि फट लेकिन HEB में लंबे समय तक मशीन से बिखरने नहीं है, 2) micropipetting कोशिकाओं के सुक्रोज बूंदों को एक साथ नहीं झुरमुट है कि नाभिक के एक अलग निलंबन प्राप्त करने के लिए, और 3) एक समय में एक दिशा में प्रत्येक निर्धारण लेपित स्लाइड झुकाव और आगे पीछे नहीं । एक बार तैयार, सतह फैल नाभिक ब्याज के प्रोटीन के लिए फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी के साथ immunostained जा सकता है और फिर माइक्रोस्कोप के साथ imaged (प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 1 और चित्रा 2में दिखाए जाते हैं । चित्रा 1 जंगली प्रकार pachytene नाभिक के उदाहरण से पता चलता है कि अच्छी तरह से फैल रहे है (एक), असमान immunostained युक्त नाभिक, फटा दिखने homologs में गर्मी की वजह से भी लंबे समय (ख), खराब प्रसार अतिव्यापी HEB (सी), और नाभिक युक्त सेमिनीफेरस नलिकाओं (D) के "overmincing" के कारण खंडित homologs । जब तकनीक अच्छी तरह से किया जाता है, नाभिक के एक बहुतायत के दौर मैं प्राप्त किया जा सकता है के मुख्य 5 उपस्तर का प्रतिनिधित्व । चित्रा 2 leptotene, zygotene, pachytene, diplotene, और किशोर पुरुषों से जंगली प्रकार diakinesis के नाभिक में मैं दौर के spermatocytes चरणों का प्रदर्शन करता है ।
चित्रा 1: किशोर चूहों से जंगली प्रकार spermatocytes की सतह फैल नाभिक ।
Pachytene spermatocyte नाभिक विरोधी SYCP3 (हरे) के साथ दाग थे, जो synaptonemal परिसर (ए) अच्छी तरह से फैल नाभिक के अक्षीय/पार्श्व तत्वों दाग । (ख) नाभिक से सेमिनीफेरस नलिकाओं HEB में भी काफी देर तक गर्मी रही. (ग) खराब अतिव्यापी नाभिक फैला । (घ) सेमिनीफेरस नलिकाओं के "overmincing" के कारण खंडित homologs (ऐरोहेड दो छोटे homolog अंशों को इंगित करता है). स्केल बार 5 माइक्रोन है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: नाभिक के उपस्तर से मैं दौर के उदाहरण ।
जंगली प्रकार किशोर पुरुषों से spermatocytes शिखा सीरम (लाल), जो दाग centromeres के साथ दाग रहे थे, और विरोधी SYCP3 (हरा), जो दाग के सलए/पार्श्व तत्वों synaptonemal परिसर । leptotene, zygotene, pachytene, diplotene, और मैं क्रमशः, चरण के diakinesis चरणों में दिखाया गया है । स्केल बार 5 माइक्रोन है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| अभिकर्मक | मात्रा | अंतिम एकाग्रता |
| 1m Tris-Cl (pH ८.२) | १.५ एमएल | 30 एमएम |
| सुक्रोज | ०.८५५७५ छ | ५० एमएम |
| Trisodium साइट्रेट डाईहाइड्रेट | ०.२५ छ | 17 एमएम |
| ०.५ एम EDTA | ५०० μL | 5 मिमी |
| Dithiothreitol (डीटीटी) | ०.००३८५ छ | ०.५ एमएम |
| ०.२ मीटर Phenymethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF) | 25 μL | ०.१ एमएम |
तालिका 1: Hypotonic निष्कर्षण बफर (HEB) के लिए नुस्खा ।
५० मिलीलीटर ultrapure प्रयोगशाला ग्रेड पानी के लिए रिएजेंट जोड़ें और पीएच ८.२-८.४ के लिए समायोजित करें (यदि आवश्यक उपयोग 1 n NaOH समाधान या 1 एन एचसीएल) । ताजा HEB हर बार तैयार, बर्फ पर रखने के लिए, और तैयारी के 2 ज के भीतर का उपयोग करें ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
अच्छी तरह से फैल की उच्च संख्या प्राप्त करने के लिए, अच्छी गुणवत्ता spermatocyte नाभिक, इस प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण कदम HEB में सेमिनीफेरस नलिकाओं के उचित मशीन समय शामिल हैं, नख़रेबाज़ सेमिनीफेरस के उचित नलिकाओं, और करने के लिए कार्यरत तकनीक सुक्रोज सेल निलंबन को निर्धारण विलेपित स्लाइड (मों) में फैलाएं । हम जंगली प्रकार प्रसव से HEB में वयस्कता के लिए ४५ मिनट के लिए 15 से लेकर पुरुषों के परीक्षण से सेमिनीफेरस नलिकाओं गर्मी, जबकि तुलना में आयु वर्ग के Chtf18-नल चूहों केवल 30 मिनट के लिए मशीन रहे है क्योंकि tests आधे आकार के होते है और शामिल काफी कम रोगाणु कोशिकाओं8। हमारे अनुभव में, Chtf18की मशीन-नल परीक्षण के लिए लंबे समय से 30 मिनट से कोशिकाओं की अखंडता समझौता, खराब हल homologs में जिसके परिणामस्वरूप । सेमिनीफेरस नलिकाओं केवल एक बादल सुक्रोज सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए भरती हैं, और प्रत्येक स्लाइड के प्रसार से पहले निर्धारण के एक उदार छोटी बूंद शामिल होना चाहिए (२.१० देखें) । स्लाइड्स एक बार में एक दिशा में झुकाई गई हैं और आगे पीछे नहीं हैं । विधि अर्धसूत्रीविभाजन मैं अध्ययन करने के लिए आदर्श है, लेकिन यह काफी हद तक मैं दौर के उपस्तरों तक ही सीमित है । हालांकि, premeiotic एस चरण, metaphase मैं और द्वितीय में नाभिक देखा जा सकता है और7,9सूचना दी गई है ।
यह एक सरल तरीका है कि कुछ अभ्यास आवश्यक क्षमता और सबसे अच्छा परिणाम हासिल है । कई भिन्न कारणों के लिए उपयुक्त परिणाम हो सकता है । नाभिक अच्छी तरह से फैल नहीं हो सकता है, संकुल या अतिव्यापी कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप । यह तब हो सकता है यदि सुक्रोज कक्ष का निलंबन पर्याप्त रूप से pipetted नहीं है या नाभिक को अच्छी तरह से फैलाने के लिए स्लाइड पर पर्याप्त निर्धारण नहीं है । यदि स्लाइड पर्याप्त अवशिष्ट निर्धारण के साथ लेपित नहीं कर रहे है या सेल निलंबन एक चिकनी दिशा में स्लाइड भर में फैल नहीं है या फिर से आगे और पीछे फैला है, तो कोशिकाओं को ओवरलैप और झुरमुट एक साथ होगा । यदि सेमिनीफेरस नलिकाओं "है" फिर homologs खंडित हो सकता है या कुछ कटा हुआ दिखाई देते हैं । क्योंकि उत्परिवर्ती testes छोटे हो सकता है, कम spermatocytes होते हैं, और अधिक "overmincing" या सेमिनीफेरस नलिकाओं के विखंडन के लिए अतिसंवेदनशील, हम नियंत्रण पर कुछ समय अभ्यास (जैसे जंगली प्रकार) पहले परीक्षण में तकनीक का अनुकूलन करने की सिफारिश एक नौसिखिया के हाथ ।
सतह प्रसार नाभिक तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण विनियामक कदम और अर्धसूत्रीविभाजन की प्रगति, साथ ही साथ चूहों में meiotic phenotypes की विशेषता की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता तकनीक है । इसलिए, हम इस विधि का उपयोग बड़े पैमाने पर और सभी नए प्रयोगशाला सदस्यों को सिखाने के लिए यह कैसे प्रदर्शन करने के लिए । एक बार इस तकनीक में महारत हासिल है, अंय तकनीकों के असंख्य बाद में इस्तेमाल किया जा सकता है और इसके साथ संयोजन के रूप में । उदाहरण के लिए, immunostaining और/या epifluorescence, या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ widefield या फोकल सहित माइक्रोस्कोप के कई प्रकार किया जा सकता है । synaptonemal परिसर के घटकों के रूप में अर्धसूत्रीविभाजन-विशिष्ट प्रोटीन का अध्ययन करने के अलावा, अनुसूचित जाति, जैसे cohesins, multiprotein परिसरों कि मध्यस्थता सामंजस्य के साथ बातचीत उन, मूल्यांकन किया जा सकता है ( 10में समीक्षा की,11 ,12). डीएनए विदेशी गठन, प्रसंस्करण, और परिपक्वता का विनियमन हो सकता है और यह भी इस तकनीक के साथ13अध्ययन किया गया है । इसके अलावा, इस तकनीक का प्रयोग किया गया है तरीकों के उपयोग के लिए माउस spermatocytes के विशिष्ट आबादी: 1 प्राप्त करने के लिए निंनलिखित) okadaic एसिड में spermatocytes की संस्कृति के बाद G2 को प्रगति के लिए प्रेरित/ diplotene, diakinesis, और metaphase मैं14,15 और 2) फैलता है pachytene spermatocytes14की एक समृद्ध आबादी को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के बाद ।
माउस spermatocytes से सतह के फैलाव नाभिक को तैयार करने की तकनीक वर्णित है और यहां प्रदर्शित एक अत्यंत उपयोगी और सरल तकनीक है. यह हर प्रयोगशाला है कि एक मॉडल जीव के रूप में चूहों का उपयोग अर्धसूत्रीविभाजन अध्ययन करने के लिए quintessential है, लेकिन कुछ अभ्यास और चालाकी के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने की आवश्यकता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक अबीगैल हैरिस की तकनीकी सहायता स्वीकार करते हैं । उंहोंने यह भी स्वीकार करते है पाउला कोहेन और किम होलोवे की मदद करने के लिए सतह की तैयारी के प्रोटोकॉल अनुकूलित माउस spermatocytes से फैल नाभिक । लेखक भी करेन शिंडलर्स द्वारा पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने की सराहना करते हैं ।
यह काम NIH R01 GM106262 ने K.M.B. को समर्थन दिया था
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
References
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R.
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
