Summary
Meiose er utviklingsprosessen som dannes gameter gjennom én enkelt runde med utryddelse og to påfølgende rundene kromosom raseskille. Pattedyr meiose kan undersøkes ved å benytte en teknikk for å forberede meiotic kromosom oppslag. Her viser vi en metode for å forberede overflaten oppslag kjerner fra mus spermatocytes.
Abstract
Pattedyr meiose er en dynamisk utviklingsprosess som oppstår i bakterie celler og kan studerte og preget. Bruker en metode for å spre kjerner på overflaten av lysbildene (i stedet for å slippe dem fra en høyde), viser vi en optimalisert teknikk på musen spermatocytes som ble først beskrevet i 1997. Denne metoden er mye brukt i laboratorier for å studere pattedyr meiose fordi det gir en overflod av høy kvalitet kjerner gjennomgår substages av prophase I. Seminiferous tubules plasseres først i en hypotonisk løsning på hovne spermatocytes. Deretter spermatocytes slippes en sucrose løsning for å lage en celle suspensjon og kjerner er spredt på bindemiddel-gjennomvåt glass lysbilder. Etter immunostaining, et mangfold av proteiner germane til meiotic prosesser kan undersøkes. For eksempel proteiner av synaptonemal komplekset, en tredelt struktur som kobler kromosom akser/kjernene av homologs sammen kan være lett å visualisere. Meiotic rekombinasjon proteiner, som er involvert i reparasjon av DNA dobbel-strand bryter av homologe rekombinasjon, kan også være immunostained å vurdere progresjon av prophase jeg. Her vi beskriver og viser i detalj en metode mye brukt til å studere pattedyr meiose i spermatocytes fra juvenile eller voksne mannlige mus.
Introduction
Mus brukes mye som en modell organisme for å studere meiose i pattedyr. Både normale utviklingsprosesser og feil som oppstår under meiose kan evalueres. Tidslinjen og progresjon viktigste funksjonene som oppstår under prophase jeg og substages, samt en rekke spesifikke proteiner involvert i prosesser avgjørende for regulering av meiose kan være preget både vill type og mutant mus. Flere spesialiserte prosesser som oppstår under meiose jeg kan bli studert i detalj (omtalt i Handel og Schimenti1). Disse inkluderer DNA dobbel-strand pause (DSB) dannelse og reparasjon, rekombinasjon, synaptonemal kompleks dannelse og kromosom raseskille.
Et viktig aspekt å studere meiotic prosesser er muligheten til å undersøke kjerner inneholder homologe kromosomer som visuelt og optisk løses bedre skille og identifisere substages av prophase I. Prophase jeg består av 5 substages Det er preget av bestemte funksjoner inkludert dannelsen av synaptonemal komplekset (SC). SC er en tredelt protein skafottet som gjør at sammenkoblingen og DNA dobbel-strand pause reparasjon av homologs. Under leptonema Juster homologs som aksial elementer av SC er fastsatt. Deretter forenkler vedlegg av sentrale elementer til synaptonemal komplekset under zygonema sammenkoblingen og fysisk tilkobling (Adept) mellom par av homologs. Under pachynema, Adept av homologs blir fullført og DNA overganger er dannet av reparasjon av DNA dobbel-strand bryter via homologe rekombinasjon Velg innbyggere. SC disassembles under diplonema, slik at homologs desynapse men være knyttet til deres centromeres og på steder av DNA overganger. Endelig under diakinesis, homologs recondense og overgangen til metaphase skjer1.
Historisk overflaten-spredning av meiotic chromatin gitt noen kjerner, spesielt de fra tidlige stadier av prophase jeg2. Som et resultat, ble disse metodene endret for å bedre separasjon av celler fra vev (dvs. testikkel eller eggstokk), teknikken av spre meiotic chromatin, og avkastningen av høykvalitets meiotic kjerner for evaluering2,3, 4. I tillegg denne metoden viste seg for å være nyttig i å bevare kjernefysiske og chromatin bundet proteiner i meiotic kjerner som demonstrert av publiserte immunolocalization teknikker5,6,7. Derfor metoden først beskrevet av Peters2 og demonstrert her gir mange separate burst spermatocyte kjerner som inneholder homologs gjennomgår de leptotene, zygotene, pachytene, diplotene og diakinesis substages av prophase jeg.
Teknikken med å utarbeide overflaten oppslag kjerner (også kalt chromatin spre analyse) er mye brukt til å studere meiose innen reproduktiv og cellebiologi. Lysbilder som inneholder overflaten oppslag kjerner kan senere immunostained med antistoffer proteiner av interesse eller utsatt for sølv flekker, og deretter analysert med mikroskopi. Metoden er lik for både mannlige og kvinnelige mus, men endringene har blitt beskrevet for kvinnelige mus2. Det er viktig ikke å overmince seminiferous tubules. Kjerner må også være godt spredt slik at følgende immunostai-homologs og tilhørende proteiner er tydelig med mikroskopi. Overflaten oppslag kjerner kan være forberedt i bare noen få timer og enten immunostained umiddelbart eller lagret ved-80 ° C i opptil 3 uker før tining og immunostai. Imidlertid er optimale resultater best oppnådd for noen proteiner hvis immunostaining utføres umiddelbart eller innen 2 uker med å utarbeide overflaten oppslag kjerner. Lysbilder kan være immunostained med en standardprotokoll bruker antistoffer proteiner av interesse, etterfulgt av inkubasjon med sekundær antistoffer konjugert til fluorescerende proteiner eller fargestoffer og fotografert med fluorescens mikroskopi8. På postnatal dag 15-21 er tilstrekkelig vev per par av vill type testiklene til 6-10 lysbilder, og eldre mus (inkludert voksne) vil gi flere lysbilder. Men vil wild type mus 6 uker og eldre også gi mer etter meiotic celler (dvs. spermatids) på lysbildene etter immunostaining. Dessuten, alle substages av prophase jeg kan observeres i juvenile og voksen mus. Testiklene fra menn postnatal dager 10 til 15 vil gi mange flere leptotene og zygotene celler. Mus eldre enn postnatal dag 14 til 15 vil gi mer pachytene og diplotene kjerner.
Her vi beskriver og viser en brukte metoden med å utarbeide overflaten oppslag kjerner fra mus spermatocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som involverer mus utnyttet høy etisk og velferd standarder, og ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen på Drexel University College of Medicine.
1. forberedelse av løsninger og nødvendig
- Forberede hypotonisk utvinning Buffer (HEB) i 50 mL av ultrapure laboratorium klasse vann, pH 8.2-8.4 (tabell 1). Gjøre løsningen fersk hver gang, holde på is og bruke innen 2 timer å forberede oppslag; Dette er nødvendig å optimalisere redusere og protease begrenser aktiviteter DTT og PMSF, henholdsvis. Bruk 10 mL HEB for hvert par av musen testiklene.
- Forberede en 100 mM sucrose løsning (nye hver gang) ved å legge 0.342 g av sukrose 10 mL av ultrapure laboratorium klasse vann. Justere pH til 8,2
- Forberede etappe, den stabiliserende løsning (1% paraformaldehyde (PFA), 0,15% Triton X-100, pH justert til 9.2 med 1 N HCl eller 1 N NaOH) frisk månedlig og lager det ved romtemperatur beskyttet fra lys. Fortynne en 16% kommersielt tilgjengelig PFA Start lager 4% i 1 X PBS som en arbeider lager, og deretter lagre 4% dele på 20 ° C.
- For å forberede etappe, den stabiliserende løsningen, tilsett 10 mL av 4% PFA løsning og 600 µL av 10% Triton X-100 til 30 mL 1 X PBS, bland godt og justere pH til 9.2 med 1 N HCl eller 1 N NaOH. Lagre etappe, den stabiliserende løsningen i en 50-mL konisk tube innpakket i aluminiumsfolie ved romtemperatur (for mer enn 4 uker).
- Forberede vask løsninger (mens lysbilder er tørke de siste 30 min) med foto-Flo 200: 0,4% Foto-Flo 200/PBS (320 µL av foto-Flo 200 i 80 mL 1 X PBS) og 0,4% Foto-Flo 200/dH2O (160 µL av foto-Flo 200 i 40 mL ultrapure laboratorium klasse vann). Bruk et 50 mL Coplin glass fylt med 40 mL løsninger å vaske 10 eller færre lysbilder samtidig.
- Klargjør følgende instrumenter: 1 par kirurgisk saks (til incise huden), 1 par fine tips kirurgisk saks (til incise peritoneum), 2 par rett fin spiss tang (å dissekere ut hver testikkel), 1 rett kant barberblad (til incise hver testikkel), 2 par buede tips tang (til nakkens hver testikkel og presse ut av seminiferous tubules) 50 mL Coplin krukker, Teflon trykt 3 ring lysbilder, 1 skalpell med størrelse 11 blad, fuktet kammer, 100 x 15 mm Petri retter, fine tips permanent penn eller blyant, og plattformen roterende shaker.
- Sted premie uncharged precleaned frostet slutten glass lysbilder oppreist i et 50 mL Coplin glass fylt med etappe, den stabiliserende løsning før bruk.
Merk: Blyant er foretrukket hvis lysbildene skal brukes senere i prosedyrer krever etanol, som fluorescens i situ hybridisering.
- Sted premie uncharged precleaned frostet slutten glass lysbilder oppreist i et 50 mL Coplin glass fylt med etappe, den stabiliserende løsning før bruk.
2. spermatocyte kjerner spre
- Euthanize en mannlig mus etter institusjonelle retningslinjer (f.eks cervical forvridning med eller uten CO2 kvelning).
- Bruk P10 - P20 menn å evaluere meiotic celler i den første bølgen av spermatogenesis; Vi bruk rutinemessig P15 - P17 menn få celler fra alle substages av prophase I. voksen testiklene vil gi celler fra prophase jeg også, men de vil også gi mer postmeiotic celler, for eksempel spermatids.
- Høste og veie testiklene (registrere sammenkoblede vekter); plass dem i en Petriskål inneholder noen dråper kaldt HEB å holde dem fuktige.
- Hold testikkel mot bunnen av parabolen med buet spiss tang, og bruker en rett kant razor blad for å gjøre en liten loddrette midtlinjen snitt gjennom kapselen av testikkel. Mens du holder testikkel mot bunnen av parabolen med en tang, bruke andre buet spiss tang eller rette kant razor blad å forsiktig presse de seminiferous tubules fra testikkel.
- Plass på tubuli i en 15 mL konisk rør som inneholder 10 mL kaldt HEB, ta vare for å unngå å sette deler av kapselen inn i røret. Gjenta disse trinnene med andre testikkel.
- Inkuber decapsulated seminiferous tubules i konisk røret som inneholder HEB på is 30-60 min., avhengig av testiklene. Inkuber seminiferous tubules fra et par testiklene veier 30 mg eller mindre for 30 min, tubuli fra et par testiklene veiing 31 til 50 mg for 30-45 minutter, og større testiklene i 60 minutter. Ikke endre tidspunktene for en enkelt testikkel.
Merk: Den optimale inkubasjon tiden kan variere avhengig av eksperimentator reagensene brukes og mus blir analysert. - Mens seminiferous tubules er incubating inne HEB, Bruk markøren eller blyant merke frostet ender precleaned lysbilder med musen tall, lysbildenummer og dato. Plass pre renset lysbildene i en Coplin glasset som inneholder etappe, den stabiliserende løsningen.
- Etter inkubasjon hell tubuli og HEB i en ren Petriskål og separat tubules i ca 3 mm diameter klumper. Hver klynge gir 2 lysbilder og antall lysbilder gitt avhenger av størrelsen på testiklene.
Merk: Vi få 8 lysbilder fra vill type og 6 lysbilder fra subfertile Chtf18-null P16 testiklene (som er mindre på grunn av redusert antall meiotic og mitotisk bakterie celler8). En voksen testikkel veier 100 mg eller mer forventes å gi 16 lysbilder. - Sted 23 µL av 100 mM sucrose løsning i en ring av en Teflon trykt, 3 ring lysbilde og legge til en klynge av seminiferous tubules i ringen. Deretter bruke buet tips tang holder klump, forsiktig hakke på tubuli med størrelse 11 razor blad til løsningen blir skyet.
Merk: Ikke overmince som dette vil resultere i fragmentert kromosomer. Merk at fragmentert kromosomene også kunne være indikativ av en mutant fenotypen. - Fjerne rester, legge til en annen 23 µL av sucrose løsning og bruke brønnene å forsiktig Pipetter blanding opp og ned et par ganger å hjelpe skille cellene i suspensjon.
- Fjerne et lysbilde soaking i Coplin glasset som inneholder etappe, den stabiliserende løsning og tilt lysbildet over glasset slik som en generøs dråpe samler på nederst i lysbildet.
- Pipetter 20 µL av sukrose celle suspensjon fra ringen Teflon trykte 3 ring lysbildet i etappe, den stabiliserende slippverktøyet på en premie frostet glass lysbilde og Pipetter suspensjon opp og ned 2 - 3 ganger.
Merk: Etappe, den stabiliserende slippverktøyet bør være stort nok volum slik at tillegg av 20 μL av sukrose celle suspensjon det gir dekning over hele lysbildet når blandingen er spredt (se 2.11 nedenfor).
- Pipetter 20 µL av sukrose celle suspensjon fra ringen Teflon trykte 3 ring lysbildet i etappe, den stabiliserende slippverktøyet på en premie frostet glass lysbilde og Pipetter suspensjon opp og ned 2 - 3 ganger.
- Sakte tilt lysbildet til motsatt slippverktøyet å spre celle suspensjon langs lysbildet side. Deretter bøye langsomt lysbildet tilbake å spre celle suspensjon langs bredden på lysbildet til dekke fullstendig. Unngå å spre suspensjon over samme område i lysbildet mer enn en gang ellers cellene overlapper med hverandre.
- Umiddelbart plassere lysbilde i en fuktet kammer og Gjenta trinnene 2.8 til 2.11 til alle klumper av seminiferous tubules har blitt brukt til å lage lysbilder. Det er viktig å ikke flytte fuktet kammeret i tørking prosessen å unngå rive og overlappende cellene.
- Gi lysbildene å ruge i en dekket fuktet kammer ved romtemperatur for 2,5 t slik at de tørr sakte og ikke helt. Høy luftfuktighet og langsom tørking i dette trinnet er viktig å sikre tilstrekkelig spredning av chromatin. Så ta av dekselet over kammeret og la lysbildene air-dry helt en ytterligere 30 min.
- Plasser lysbilder (tilbake til eller i en sikk-sakk mønster) i en Coplin krukke med 0,4% Foto-Flo 200/1 X PBS løsning og vask lysbildene to ganger, 5 min, av forsiktig agitating Coplin glass på en plattform roterende shaker. Bruke friske løsning for hver vask og holde lysbilder fra forskjellige mus i separat glass for hver av vasker.
- Vask lysbildene i en Coplin krukke med 0,4% Foto-Flo 200/dH2O løsning 5 min en gang mens agiterte.
- Fjern lysbilder fra Coplin jar (siste vask), nøye tørke kanter og bunnen av lysbildene for å fjerne overflødig væske og plassere lysbilder på en vinklet, nesten-oppreist posisjon tørke. Kjent som er dyktige i denne teknikken kan behandle og forberede overflaten oppslag kjerner fra 4 eller 5 mus på en dag.
- Når tørre (15-20 min), behandle lysbilder umiddelbart immunofluorescence flekker eller butikken på-80 ° C i en tett lukket lysbildet beskyttet fra lys for maksimalt 3 uker (avhengig av målet proteiner blir evaluert; optimale resultater kan oppnås hvis farget samme dag eller innen 2 uker).
- Hvis lagret på-80 ° C, så la lysbildene komme til romtemperatur og vaske i en Coplin glasset som inneholder 1 X PBS eller blokker i 5 minutter før flekker.
Merk: Mange ulike immunofluorescence fargeprotokollene vil gi gode resultater; Referer til Berkowitz et al. for immunostai-protokoll8.
- Hvis lagret på-80 ° C, så la lysbildene komme til romtemperatur og vaske i en Coplin glasset som inneholder 1 X PBS eller blokker i 5 minutter før flekker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evne til denne metoden for å gi et stort antall overflaten spre kjerner som inneholder intakt homologs avhenger av tre hovedfaktorer: 1) riktig inkubasjon tid av seminiferous tubules i hypotonisk buffer (dvs. HEB) for å få tilstrekkelig svulmet spermatocyte kjerner som brast men ikke oppløsning fra langvarig inkubasjon i HEB, 2) micropipetting sukrose dråper av celler for å få en atskilt suspensjon av kjerner som ikke er klumpet seg sammen, og 3) vipping hver bindemiddel belagt lysbilde i én retning om gangen og ikke frem og tilbake. Når forberedt, overflaten spredning kjerner kan være immunostained med fluorescently merket antistoffer proteiner av interesse og deretter fotografert med mikroskopi (representant eksempler vises i figur 1 og figur 2. Figur 1 viser eksempler på wild type pachytene atomkjerner som er godt spredt (A), kjerner som inneholder ujevnt immunostained, fillete vises homologs på grunn av inkubasjon i HEB lenge (B), fordelt dårlig overlappende kjerner (C) og kjerner som inneholder fragmentert homologs på grunn av "overmincing" av seminiferous tubules (D). Når teknikken er utført godt, en mengde kjerner som representerer de viktigste 5 substages av prophase jeg kan oppnås. Figur 2 viser leptotene, zygotene, pachytene, diplotene og diakinesis stadier av prophase I kjerner av wild type spermatocytes fra unge menn.
Figur 1: Overflaten spre kjerner i wild type spermatocytes fra juvenile mus.
Pachytene spermatocyte kjerner var farget med anti-SYCP3 (grønn), som flekker aksial/lateral elementer av synaptonemal komplekset (A) godt kjerner. (B) kjerner fra seminiferous tubules ruges i HEB lenge. (C) dårlig spre overlappende kjerner. (D) fragmentert homologs på grunn av "overmincing" av seminiferous tubules (pilspisser indikerer to små homolog fragmenter). Skala er 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Eksempler på kjerner fra substages av prophase jeg.
Wild type spermatocytes fra unge menn var farget med CREST serum (rød), som flekker centromeres, og anti-SYCP3 (grønn), som flekker elementene aksiale/lateral i synaptonemal komplekset. Leptotene, zygotene, pachytene, diplotene og diakinesis stadier av prophase I henholdsvis vises. Skala er 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | Antall | Siste konsentrasjon |
| 1 M Tris-Cl (pH 8.2) | 1,5 mL | 30 mM |
| Sukrose | 0.85575 g | 50 mM |
| Trisodium citrate dihydrate | 0,25 g | 17 mM |
| 0,5 M EDTA | 500 ΜL | 5 mM |
| Dithiothreitol (DTT) | 0.00385 g | 0,5 mM |
| 0,2 M Phenymethylsulfonyl fluor (PMSF) | 25 ΜL | 0,1 mM |
Tabell 1: Oppskrift på hypotonisk utvinning Buffer (HEB).
Legg reagenser til 50 mL ultrapure laboratorium Vurder vann og justere pH 8.2-8.4 (hvis nødvendig bruker 1 N NaOH løsning eller 1 N HCl). Forberede frisk HEB hver gang, holde på is, og bruke i 2 timer med forberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å få høyt antall godt spredt, god kvalitet spermatocyte kjerner, de viktigste trinnene i denne protokollen inkludere passende inkubasjon tid av seminiferous tubules i HEB, passende hakking av seminiferous tubules, og teknikken ansatt å spredt sukrose celle suspensjon over etappe, den stabiliserende belagt lysbildene. Vi ruge seminiferous tubules fra prøvene av vill type menn fra postnatal dag 15 til voksen i HEB i 45 minutter, mens testiklene fra sammenlignbare alderen Chtf18-null mus er ruges i bare 30 min fordi testiklene er halve størrelsen og inneholder betydelig færre bakterie celler8. I vår erfaring, inkubasjonstiden for Chtf18-null prøvene for lengre enn 30 min kompromisser integriteten av celler, som resulterer i dårlig løst homologs. Seminiferous tubules er hakket bare for å få en skyet sukrose celle suspensjon, og hvert lysbilde må inneholde en sjenerøs dråpe bindemiddel før spre (se 2.10). Lysbilder er tilted i én retning om gangen og ikke frem og tilbake. Metoden er ideelt å studere meiose jeg, men det er begrenset til substages av prophase jeg. Men rapportert kjerner i premeiotic S fase, metaphase I og II kan observeres og har vært7,9.
Dette er en enkel metode som nødvendiggjør litt øvelse for å få kompetanse og best resultat. Suboptimal resultater kan oppstå for flere forskjellige grunner. Kjerner kan ikke bli godt spredt, resulterer i gruppert eller overlappende cellene. Dette kan skje hvis sukrose celle suspensjon ikke er tilstrekkelig pipetted eller det er ikke nok bindemiddel i lysbildet for å spre kjerner godt. Hvis lysbildene ikke er belagt med nok gjenværende bindemiddel eller cellen suspensjon ikke spredt over lysbildet i en jevn retning eller gjentatte ganger spre frem og tilbake, vil deretter celler overlappe og clump sammen. Hvis seminiferous tubules er "overminced" så homologs may be fragmentert eller vises noe makulert. Fordi mutant testiklene kan være mindre, inneholder færre spermatocytes og være mer utsatt for "overmincing" eller fragmentering av seminiferous tubules, anbefaler vi øve et par ganger på kontroll (f.eks wild type) testiklene først å optimalisere teknikken i den hendene på en nybegynner.
Forbereder overflaten spredning kjerner er en grunnleggende teknikk som brukes til å undersøke viktige forskrifter trinn og progresjon av meiose, samt å karakterisere meiotic fenotyper i mus. Derfor vi bruk denne metoden omfattende og lære alle nye lab medlemmer å utføre den. Når denne teknikken er mestret, kan en rekke andre teknikker brukes senere og i forbindelse med den. For eksempel flere typer immunostai-og/eller mikroskopi inkludert widefield eller AC confocal med epifluorescence eller electron mikroskopi kan utføres. I tillegg til å studere meiose-spesifikke proteiner som komponenter i synaptonemal komplekset, kan de samhandler med SC, som cohesins, multiprotein komplekser som megle samhold, bli evaluert (omtalt i 10,11 12). Regulering av DNA crossover formasjon, behandling og kjønnsmodning kan og har også studert med denne teknikken13. In addition, denne teknikken er utført ved å bruke metoder for å få spesifikke populasjoner av musen spermatocytes: 1) etter kultur av spermatocytes i okadaic syre å indusere progresjon til G2/MI overgangen, gir økt antall diplotene, diakinesis og metaphase jeg sprer14,15 og 2) etter metoder brukes til å isolere en beriket befolkning pachytene spermatocytes14.
Teknikken med å utarbeide overflaten oppslag kjerner fra mus spermatocytes beskrevet og demonstrert her er en svært nyttig og enkel teknikk. Det er typiske til hver lab som studerer meiose bruke mus som en modell organisme, men krever litt praksis og behendighet å oppnå de beste resultatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter teknisk assistanse av Abigail Harris. De erkjenner også Paula Cohen og Kim Holloway for å optimalisere protokollen med å utarbeide overflaten oppslag kjerner fra mus spermatocytes. Forfatterne også pris på kritisk lesning av manuskriptet av Karen Schindler.
Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 GM106262 til K.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
References
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R.
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
