Summary
Meiosen är den utvecklingsprocess som könsceller bildas genom en enda omgång DNA-replikation och två på varandra följande rundorna av kromosomsegregering. Däggdjur meios kan undersökas genom att använda en teknik för att förbereda meiotisk kromosomanalys sprider. Här visar vi en metod för att förbereda ytan-spread kärnor från mus spermatocyter.
Abstract
Däggdjur meios är en dynamisk utvecklingsprocess som sker i könsceller och kan studeras och karakteriseras. Med en metod för att sprida kärnor på ytan av diabilder (snarare än att släppa dem från höjd), visar vi en optimerad teknik på mus spermatocyter som beskrevs första gången 1997. Denna metod används ofta i laboratorier för att studera däggdjur meios eftersom det ger en uppsjö av hög kvalitet atomkärnor som genomgår substages av profas I. seminifera tubuli placeras först i en hypoton lösning att svälla spermatocyter. Sedan spermatocyter släpps ut i en sackaroslösning skapa en cellsuspension, och kärnor sprids på fixativ-indränkt glasskivor. Efter immunfärgning, en mångfald av proteiner som är nära förbunden med meiotiska processer kan undersökas. Till exempel kan proteiner i synaptonemal komplexet, en tredelad struktur som ansluter kromosom axlar/kärnar ur av homologs tillsammans visualiseras enkelt. Meiotisk rekombination proteiner som är involverade i reparation av DNA dubbel-strand raster av homolog rekombination, kan också vara immunostained att utvärdera utvecklingen av profas jag. Här vi beskriva och Visa i detalj en teknik som ofta används för att studera däggdjur meios i spermatocyter från unga eller vuxna manliga möss.
Introduction
Möss används i stor utsträckning som modellorganism för att studera meios hos däggdjur. Både normala utvecklingsprocesser och defekter som uppstår under meios kan utvärderas. Tidslinjen och progression av framträdande dragen som inträffar under profas jag och substages, samt en mängd specifika proteiner inblandade i processer som är avgörande för reglering av meios kan karakteriseras i både vildtyp och muterade möss. Flera specialiserade processer som inträffar under meios jag kan studeras i detalj (ses i Händel och Schimenti1). Dessa inkluderar DNA dubbel-strand paus (DSB) bildandet och reparation, rekombination, synaptonemal komplex bildandet och kromosomsegregering.
En viktig aspekt av att studera meiotiska processer är förmågan att undersöka atomkärnor innehållande homologa kromosomer som löses visuellt och optiskt bättre särskilja och identifiera substages av profas I. profas jag består av 5 substages som kännetecknas av särskilda funktioner inklusive bildandet av komplexet synaptonemal (SC). SC är en tredelad protein byggnadsställning som möjliggör ihopkoppling och DNA dubbel-strand paus reparation av homologs. Under leptonema justera homologs som axiella delar av SC fastställs. Sedan underlättar fastsättning av centrala element till synaptonemal komplexet under zygonema hopkoppling och fysisk anslutning (mås) mellan par av homologs. Under pachynema, synapsis av homologs blir komplett och DNA delningsfilter bildas från reparation av DNA dubbel-strand raster via homolog rekombination Välj invånare. SC Disassemblerar under diplonema, så att homologs till desynapse men sitta kvar på sin centromerer och platser av DNA delningsfilter. Slutligen under diakinesis, homologs recondense och övergång till metafas sker1.
Historiskt, surface-fördelande av meiotiska kromatin gav några kärnor, särskilt de från början av profas jag2. Som ett resultat, modifierades dessa metoder för att förbättra avskiljningen av celler från vävnader (testiklar eller äggstockar), tekniken att sprida meiotiska kromatin och avkastningen av hög kvalitet meiotiska kärnor för utvärdering2,3, 4. Dessutom denna metod visat sig vara användbart i att bevara kärnkraft och kromatin bundna proteiner i meiotiska kärnor vilket framgår av publicerade immunolocalization tekniker5,6,7. Därför metoden initialt beskrevs av Peters2 och visat här skördar många separata brast spermatocyte atomkärnor som innehåller homologs som genomgår de leptotene, zygotene, pachytene, diplotene och diakinesis substages av profas jag.
Tekniken att förbereda ytan-spread atomkärnor (även kallad kromatin spridning analys) används ofta för att studera meios i fälten för reproduktiv och cellbiologi. Bilder som innehåller yta-spread atomkärnor kan vara därefter immunostained med antikroppar mot proteiner av intresse eller underkastas silverfärgning, och sedan analyseras med mikroskopi. Metoden är liknande för såväl kvinnliga som manliga möss, även om modifieringar har beskrivits för honmöss2. Det är viktigt att inte overmince seminifera tubuli. Atomkärnor måste också spridas väl så att efter immunfärgning homologs och associerade proteiner ses tydligt med mikroskopi. Yta-spread atomkärnor kan tillagas i bara några timmar och antingen immunostained omedelbart eller förvaras vid-80 ° C i högst 3 veckor innan upptining och immunfärgning. Optimalt resultat erhålls dock bäst för vissa proteiner om immunfärgning utförs omedelbart eller inom 2 veckor för att förbereda ytan-spread atomkärnor. Bilderna kan vara immunostained med ett standardprotokoll som använder antikroppar mot proteiner av intresse, följt av inkubation med sekundära antikroppar konjugerad till fluorescerande proteiner eller färgämnen, sedan avbildas med fluorescence mikroskopi8. Vid postnatal dag 15-21 finns det tillräcklig vävnad per par av vildtyp testiklarna att ge 6-10 bilder och äldre möss (även vuxna) kommer att ge fler bilder. Men vildtyp möss 6 veckor och äldre kommer också att ge mer efter meiotiska celler (dvs. spermatids) på bilderna efter immunfärgning. Dessutom alla substages av profas jag kan observeras hos juvenila och vuxna möss. Testiklarna från män på postnatal dagar 10 till 15 kommer att ge många fler leptotene och zygotene celler. Möss som är äldre än postnatal dag 14 och 15 kommer att ge mer pachytene och diplotene kärnor.
Här vi beskriva och visa en allmänt använd metod för att förbereda ytan-spread kärnor från mus spermatocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som involverar möss utnyttjas hög etisk och djurskyddsnormer, och godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén vid Drexel University College of Medicine.
1. beredning av lösningar och instrument som behövs
- Förbereda hypoton utvinning buffert (HEB) i 50 mL ultrarena laboratorium grade vatten, pH 8,2-8.4 (tabell 1). Gör lösningen färska varje gång, hålla på is, och Använd inom 2 h för att förbereda spreads; Detta är nödvändigt att optimera minska och proteashämmare hämmar verksamhet DTT och PMSF, respektive. Använd 10 mL HEB för varje par av mus testiklarna.
- Bered en 100 mM sackaros (färska varje gång) genom att lägga till 0.342 g sackaros 10 ml av ultrarena laboratorium grade vatten. Justera pH till 8,2
- Förbereda fixativ lösning (1% PARAFORMALDEHYD (PFA), 0,15% Triton x-100, pH justeras till 9,2 med 1 N HCl eller 1 N NaOH) färska månatliga och lagra det i rumstemperatur skyddas från ljus. Späd en 16% kommersiellt tillgängliga PFA start lager 4% i 1 X PBS för användning som en fungerande lager, och sedan lagra 4% alikvoter vid-20 ° C.
- För att förbereda fixativ lösningen, tillsätt 10 mL 4% PFA lösning och 600 µL 10% Triton x-100 30 ml 1 X PBS, blanda väl och justera pH till 9,2 med 1 N HCl eller 1 N NaOH. Lagra fixativ lösningen i en 50 mL konisk slang inlindad i aluminiumfolie i rumstemperatur (för mer än 4 veckor).
- Förbereda tvätta lösningar (medan diabilder torkar de sista 30 min) med Photo-Flo 200: 0.4% Photo-Flo 200/PBS (320 µL av Photo-Flo 200 i 80 mL 1 X PBS) och 0,4% Photo-Flo 200/dH2O (160 µL av Photo-Flo 200 i 40 mL ultrarena laboratorium grade vatten). Använda en 50 mL Coplin burk fylld med 40 mL lösningar för att tvätta 10 eller färre bilder i taget.
- Förbered följande instrument: 1 par kirurgisk sax (till incisionsfilm huden), 1 par fina spetsen kirurgisk sax (till incisionsfilm bukhinnan), 2 par raka fina tip pincett (att dissekera ut varje testiklarna), 1 rak kant rakblad (till incisionsfilm varje testiklarna), 2 par böjd spets pincett (att immobilisera varje testikel och pressa ut sädeskanalerna), 50 mL Coplin burkar, Teflon tryckt 3 ring bilder, 1 skalpell med storlek 11 blad, befuktade kammare, 100 x 15 mm petriskålar, fin spets permanenta märkpenna eller penna, och en plattformen roterande skakapparat.
- Rum premium oladdade precleaned frostat slutet glasskivor upprätt i en 50 mL Coplin burk fylld med fixativ lösning fram till användning.
Obs: Penna är att föredra om bilderna kommer att användas senare i förfaranden som kräver etanol, såsom fluorescens i situ hybridisering.
- Rum premium oladdade precleaned frostat slutet glasskivor upprätt i en 50 mL Coplin burk fylld med fixativ lösning fram till användning.
2. spermatocyte kärnor spridning
- Avliva en manlig mus enligt institutionella riktlinjer (t.ex. cervikal dislokation med eller utan CO2 kvävning).
- Använda P10 - P20 hanar att utvärdera meiotiska celler i den första vågen av spermatogenesen; Vi använder rutinmässigt P15 - P17 hanar få celler från alla substages av profas I. vuxna testiklarna kommer att ge celler från profas jag också, men de kommer också att ge mer postmeiotic celler, såsom spermatids.
- Skörda och väga testiklarna (spela in ihopkopplade vikter); placera dem sedan i en petriskål som innehåller några droppar kallt HEB att hålla dem fuktiga.
- Håll testiklarna mot botten av skålen med böjd spets pincett och använda en rak kant rakblad för att göra en liten vertikala mittlinjen snitt genom kapseln av testiklarna. Medan du fortfarande håller testiklarna mot botten av skålen med en pincett, använda en andra uppsättning böjd spets pincett eller rak kant rakblad att försiktigt pressa sädeskanalerna från testiklarna.
- Placera tubuli i en 15 mL koniska rör innehållande 10 mL kall HEB, för att undvika att sätta bitar av kapseln i röret. Upprepa dessa steg med andra testiklarna.
- Inkubera decapsulated sädeskanalerna i koniska röret som innehåller HEB på is för 30-60 min, beroende på storleken på testiklarna. Inkubera sädeskanalerna från ett par testiklar väger 30 mg eller mindre för 30 min, tubuli från ett par testiklar väger 31 till 50 mg för 30-45 minuter och större testiklar i 60 minuter. Ändra inte tider för en enda testiklarna.
Obs: Optimal inkubationstiden kan variera beroende på erfarenheterna av experimenter, de använda reagenserna och mössen som analyseras. - Medan seminifera tubuli inkubation i HEB, använda en markör eller penna för att namnge frostat ändarna av precleaned bilder med mus nummer, nummer och datum. Sedan placera förväg rengjorda glasen i en Coplin burk innehållande fixativ lösningen.
- Efter inkubation, häll tubuli och HEB i en ren petriskål och separat tubuli till cirka 3 mm diameter klumpar. Varje klump ger 2 rutschkanor och antalet bilder som gav beror på storleken på testiklarna.
Obs: Vi få 8 bilder från vildtyp och 6 bilder från subfertile Chtf18-null P16 testiklarna (som är mindre på grund av minskat antal meiotiska och mitotiska bakterieceller8). En vuxen testiklarna väger 100 mg eller mer skulle förväntas ge 16 bilder. - Plats 23 µL av 100 mM sackaroslösning i en ring av en Teflon tryckt, 3 ring bild och lägga till en dunge av sädeskanalerna i ringen. Sedan använda böjd spets pincett att hålla dunge, försiktigt finhacka tubuli med en storlek 11 rakblad tills lösningen blir grumlig.
Obs: Inte overmince eftersom detta kommer att resultera i fragmenterade kromosomer. Observera att fragmenterade kromosomer kan också vara tecken på en mutant fenotyp. - Ta bort skräp, lägga till en annan 23 µL av sackaroslösning och Använd en mikropipett för att Pipettera försiktigt blandningen upp och ner några gånger att hjälpa skilja cellerna i suspensionen.
- Ta bort en bild som blötläggning i Coplin burken som innehåller fixativ lösning och luta bilden över burken så att en generös droplet samlar på nedre hörnet av bilden.
- Pipettera 20 µL cellsuspension sackaros från ringen av Teflon tryckt 3 ring bilden i fixativ droplet-programmet på en premie frostad glasskiva och Pipettera suspensionen upp och ner 2 - 3 gånger.
Obs: Fixativ droplet-programmet bör vara tillräckligt stor i volym så att tillägg av 20 μL av sackaros cellsuspensionen till det tillåter täckning över hela bilden när blandningen fördelas (se 2.11 nedan).
- Pipettera 20 µL cellsuspension sackaros från ringen av Teflon tryckt 3 ring bilden i fixativ droplet-programmet på en premie frostad glasskiva och Pipettera suspensionen upp och ner 2 - 3 gånger.
- Långsamt luta bilden till motsatta droplet-programmet att sprida cellsuspensionen längs längden av bilden sidan. Sedan långsamt luta bilden tillbaka till sprida cellsuspensionen längs bredden på bilden för att täcka den helt. Undvik att sprida suspensionen över samma område av bilden mer än en gång annars cellerna kommer att överlappa varandra.
- Omedelbart placera bilden platt i en fuktig kammare och upprepa steg 2,8 till 2.11 tills alla klumpar av sädeskanalerna har använts att göra bilder. Det är viktigt att inte flytta den befuktade kammaren under torkningen undvika Riva och överlappande celler.
- Låt bilderna ska Inkubera i en täckt befuktade kammare vid rumstemperatur för 2,5 h så att de torkar långsamt och inte helt. Hög luftfuktighet och långsam torkning i detta steg är viktigt att säkerställa tillräcklig spridning av kromatinet. Sedan bort omslaget till kammaren och tillåta bilder lufttorka helt en ytterligare 30 min.
- Placera bilder (rygg mot rygg eller i ett sicksackmönster) i en Coplin burk innehållande 0,4% Photo-Flo 200/1 X PBS lösning och tvätta bilderna två gånger, 5 min varje, av försiktigt agitera Coplin burk på en plattform som roterande skakapparat. Använd färsk lösning för varje tvätt och hålla diabilder från olika möss i separata burkar för var och en av tvättarna.
- Tvätta objektglasen i en Coplin burk som innehåller 0,4% Photo-Flo 200/dH2O lösning för 5 min gång medan agitera.
- Ta bort bilder från Coplin jar (sista tvättningen), försiktigt torka av kanterna och bottnar i bilderna ska ta bort överflödig vätska och placerar diabilder på en vinklad, nästan-upprätt position att torka. En försöksledare som är väl förtrogen med denna teknik kan bearbeta och förbereda surface-spread kärnor från 4 eller 5 möss i en dag.
- När torra (15-20 min), bearbeta bilder omedelbart för immunofluorescens färgning eller förvaras vid-80 ° C i en tillsluten bild box skyddas från ljus under högst 3 veckor (beroende på de målproteiner som utvärderas; optimalt resultat kan erhållas om färgas samma dag eller inom 2 veckor).
- Om lagras vid-80 ° C, då Tillåt bilder att komma till rumstemperatur och tvätta i en Coplin burk innehållande 1 X PBS eller blockera för 5 min före färgning.
Obs: Många olika immunofluorescens färgprotokollen kommer ge bra resultat; hänvisa till Berkowitz et al. för en immunfärgning protokoll8.
- Om lagras vid-80 ° C, då Tillåt bilder att komma till rumstemperatur och tvätta i en Coplin burk innehållande 1 X PBS eller blockera för 5 min före färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod förmåga att tillhandahålla ett stort antal ytan sprida atomkärnor som innehåller intakt homologs beror på tre faktorer: 1) lämplig inkubationstid av sädeskanalerna i hypoton buffert (dvs HEB) att erhålla adekvat svällde spermatocyte atomkärnor som sprack men inte sönderfaller från långvarigt inkubation i HEB, 2) micropipetting sackaros droppar av celler för att erhålla en separerade suspension av kärnor som inte är klumpgranulat tillsammans, och 3) luta varje fixativ belagda bild i en riktning i taget och inte fram och tillbaka. När förberett, ytbehandla spridning atomkärnor kan vara immunostained med fluorescently märkta antikroppar mot proteiner av intresse och sedan avbildas med mikroskopi (representativa exempel visas i figur 1 och figur 2. Figur 1 visar exempel på vildtyp pachytene kärnor som är väl spridda A-kärnor som innehåller ojämnt immunostained, trasiga visasende homologs på grund av inkubation i HEB för lång (B), sprida dåligt överlappande atomkärnor (C) och atomkärnor som innehåller fragmenterade homologs på grund av ”overmincing” av sädeskanalerna (D). När tekniken utförs väl, en uppsjö av atomkärnor som representerar de viktigaste 5 substages av profas jag kan erhållas. Figur 2 visar de leptotene, zygotene, pachytene, diplotene och diakinesis stadierna av profas I kärnor av vildtyp spermatocyter från juvenila hanar.
Figur 1: Ytan sprida kärnor av vildtyp spermatocyter från juvenil möss.
Pachytene spermatocyte kärnor var fläckad med anti-SYCP3 (grön), som fläckar axial/laterala delar av komplexet synaptonemal (A) väl spritt atomkärnor. (B) kärnor från sädeskanalerna inkuberas i HEB för lång. (C) dåligt sprida överlappande atomkärnor. (D) fragmenterade homologs på grund av ”overmincing” av sädeskanalerna (pilspetsar ange två små homolog fragment). Skalstapeln är 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exempel på kärnor från substages av profas jag.
Vildtyp spermatocyter från juvenila hanar var fläckade CREST serum (röd), som fläckar centromerer, och anti-SYCP3 (grön), som fläckar axial/laterala delar av komplexet synaptonemal. De leptotene, zygotene, pachytene, diplotene och diakinesis stadierna av profas I, respektive visas. Skalstapeln är 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Kvantitet | Slutlig koncentration |
| 1 M Tris-Cl (pH 8,2) | 1,5 mL | 30 mM |
| Sackaros | 0.85575 g | 50 mM |
| Trinatrium citrat dihydrat | 0,25 g | 17 mM |
| 0,5 M EDTA | 500 ΜL | 5 mM |
| Ditiotreitol (DTT) | 0.00385 g | 0,5 mM |
| 0,2 M Phenymethylsulfonyl fluor (PMSF) | 25 ΜL | 0,1 mM |
Tabell 1: Recept för hypoton utvinning buffert (HEB).
Lägg till reagenser till 50 mL ultrarena laboratorium grade vatten och justera till pH 8,2-8.4 (om nödvändigt använder 1 N NaOH-lösning eller 1 N HCl). Förbereda färska HEB varje gång, hålla på is och använda inom 2 timmar efter beredning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att få kicken numrerar av väl spridda, bra kvalitet spermatocyte kärnor, inkludera de viktigaste stegen i detta protokoll lämplig inkubationstid av sädeskanalerna i HEB, lämpliga malning av sädeskanalerna, och tekniken används för att spritt den fixativ belagda diabild(er) sackaros cellsuspension. Vi Inkubera sädeskanalerna från testiklarna av vildtyp hanar alltifrån postnatal dag 15 till vuxen i HEB för 45 min, medan testiklarna från comparably år Chtf18-null möss inkuberas i endast 30 min eftersom testiklarna är hälften så stor och innehåller betydligt färre könsceller8. Vår erfarenhet, inkubation av Chtf18-null testiklarna för längre än 30 min äventyrar integriteten i cellerna, vilket resulterar i dåligt löst homologs. Seminifera tubuli är malet endast för att erhålla en grumlig sackaros cellsuspension, och varje bild måste innehålla en generös droppe av fixativ före spridning (se 2.10). Diabilder är lutad i en riktning i taget och inte fram och tillbaka. Metoden är idealisk att studera meios jag, men det är till stor del begränsat till substages av profas jag. Kärnor i premeiotic S fas, metafas I och II kan observeras och varit rapporterade dock7,9.
Detta är en enkel metod som kräver lite övning för att få kompetens och bästa resultat. Suboptimala resultat kan uppstå av flera olika skäl. Atomkärnor kan inte väl spridas, vilket resulterar i klustrade eller överlappande celler. Detta kan inträffa om sackaros cellsuspensionen inte är tillräckligt pipetteras eller finns det inte tillräckligt fixativ i bilden att sprida atomkärnor väl. Om bilderna inte är belagda med tillräckligt kvarstående fixativ eller cellsuspensionen inte är spridda över bilden i en smidig riktning eller spridas upprepade gånger fram och tillbaka, kommer sedan celler överlappar varandra och klumpar ihop. Om seminifera tubuli är ”overminced” sedan homologs kan fragmenteras eller visas något strimlad. Eftersom mutant testiklar kan vara mindre, innehåller färre spermatocyter och vara mer mottagliga för ”overmincing” eller fragmentering av sädeskanalerna, rekommenderar vi att öva några gånger på kontroll (t.ex. vildtyp) testiklarna först för att optimera tekniken i den händerna på en nybörjare.
Förbereda surface spridning kärnor är en grundläggande teknik som används för att undersöka viktiga reglerande steg och progression av meios, samt för att karakterisera meiotiska fenotyper hos möss. Därför vi använder denna metod omfattande och lära alla nya lab medlemmar att utföra den. När denna teknik behärskas, kan en myriad av andra tekniker användas senare och i samband med den. Till exempel flera typer av immunfärgning och/eller mikroskopi inklusive widefield eller confocal med epifluorescence eller elektron mikroskopi kan utföras. Förutom att studera meios-specifika proteiner såsom komponenter av synaptonemal komplex, kan de interagerar med SC, såsom cohesins, multiprotein komplex som medla sammanhållning, utvärderas (över 10,11 12). Reglering av DNA crossover bildandet, bearbetning och mognad kan vara och har också undersökts med denna teknik13. Utbildningsanstalter, denna teknik har utförts efter användning av metoder för att erhålla specifika populationer av mus spermatocyter: 1) efter kultur av spermatocyter i okadasyra inducera progression till G2/MI övergången, vilket ger ökade antalet diplotene, diakinesis och metafas jag sprider14,15 och 2) efter metoder att isolera en berikad befolkning pachytene spermatocyter14.
Tekniken för att förbereda ytan-spread kärnor från mus spermatocyter beskrivs och visat här är en extremt användbar och enkel teknik. Det är kvintessensen till varje labb som studier meios med möss som modellorganism, men kräver en del träning och finess att uppnå bästa resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner tekniskt bistånd av Abigail Harris. De erkänner också Paula Cohen och Kim Holloway för att hjälpa till att optimera protokollet för att förbereda ytan-spread kärnor från mus spermatocyter. Författarna uppskattar också kritisk läsning av manuskriptet av Karen Schindler.
Detta arbete stöds av NIH R01 GM106262 till K.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
References
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R.
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
