Summary
Meiose is het ontwikkelings proces waaraan gameten worden gevormd door een ronde van DNA-replicatie en twee opeenvolgende ronden van chromosoom segregatie. Zoogdieren meiose kan worden onderzocht met behulp van een techniek ter voorbereiding Meiotische chromosoom spreads. Hier tonen we een methode voor te bereiden oppervlak-spread kernen van muis spermatocyten.
Abstract
Zoogdieren meiose is een dynamische developmental proces dat voorkomt in de geslachtscellen en kan worden bestudeerd en gekenmerkt. Met behulp van een methode te verspreiden kernen op het oppervlak van de dia's (in plaats van neer te zetten vanaf een hoogte), tonen we een geoptimaliseerde techniek op muis spermatocyten die voor het eerst in 1997 beschreven werd. Deze methode wordt veel gebruikt in laboratoria te onderzoeken zoogdieren meiose omdat het resulteert in een overvloed van hoge kwaliteit kernen ondergaan substages van profase I. Seminiferous tubuli voor het eerst in een hypotone oplossing gebracht te zwellen spermatocyten worden geplaatst. Vervolgens een sacharoseoplossing maken een celsuspensie spermatocyten vrijkomen en kernen zijn verspreid in glas fixeerspray doordrenkte dia's. Naar aanleiding van immunokleuring, een verscheidenheid van eiwitten germane Meiotische processen kan worden onderzocht. Bijvoorbeeld, de eiwitten van het synaptonemal-complex, een tripartiete structuur die de chromosoom assen/kernen van homologen samen verbindt kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd. Meiotische recombinatie eiwitten, die bij de reparatie van DNA dubbele-strand einden door homologe recombinatie betrokken zijn, kunnen ook worden immunostained om te evalueren van de voortgang van de profase ik. Hier wij beschrijven en demonstreren in detail een techniek om te studeren van zoogdieren meiose in spermatocyten van jonge of volwassen mannelijke muizen op grote schaal gebruikt.
Introduction
Muizen worden veel gebruikt als een modelorganisme voor het bestuderen van de meiose bij zoogdieren. Zowel de normale ontwikkelings processen en de gebreken die zich tijdens de meiose voordoen kunnen worden geëvalueerd. De tijdlijn en de progressie van de meest opvallende kenmerken die zich voordoen tijdens de profase I en substages, evenals een scala aan specifieke proteïnen die betrokken zijn bij processen van cruciaal belang voor de regulering van de meiose kan gekarakteriseerd worden bij zowel wild type en mutant muizen. Verschillende gespecialiseerde processen die zich tijdens de meiose die ik kunnen bestudeerd worden in detail voordoen (herzien in Handel en Schimenti-1). Het gaat hierbij om DNA dubbele-strand break (DSB) vorming en reparatie, recombinatie synaptonemal complex vorming en chromosoom segregatie.
Een belangrijk aspect van het bestuderen van Meiotische processen is de mogelijkheid te onderzoeken van de kernen met homologe chromosomen die visueel en optisch beter worden opgelost onderscheiden en identificeren van de substages van de profase I. profase ik bestaat uit 5 substages die worden gekenmerkt door specifieke eigenschappen met inbegrip van de vorming van het synaptonemal complex (SC). De SC is een tripartiete eiwit steiger waarmee het in paren rangschikken en DNA dubbele-strand break reparatie van homologen. Tijdens leptonema uitlijnen homologen neergelegde axiale elementen voor de SC zijn. Vervolgens vergemakkelijkt gehechtheid van centrale elementen aan het synaptonemal-complex tijdens zygonema pairing en fysieke verbinding (synapsis) tussen paren van homologen. Tijdens pachynema, synapsis van homologen wordt compleet en DNA cross-overs zijn gevormd uit reparatie van een select aantal DNA dubbele-strand einden via homologe recombinatie. De SC worden ontleed tijdens diplonema, waardoor homologen te desynapse, maar blijven hun centromeren en plaatsen van de crossovers DNA. Tot slot tijdens diakinese, homologen recondense en de overgang naar de metafase treedt op1.
Historisch, oppervlakte-verspreiding van Meiotische chromatine leverde enkele kernen, vooral die uit de vroege stadia van de profase ik2. Dientengevolge, zijn deze methoden gewijzigd ter verbetering van de scheiding van de cellen van weefsels (d.w.z. testis of eierstok), de techniek van de verspreiding Meiotische chromatine, en de opbrengst van hoge kwaliteit Meiotische kernen voor evaluatie2,3, 4. Bovendien, deze methode bleek te zijn nuttig bij het behoud van nucleaire en chromatine gebonden eiwitten in Meiotische kernen, zoals blijkt uit de gepubliceerde immunolocalization technieken5,6,7. Dus de methode in eerste instantie beschreven door Peters2 en hier gedemonstreerd rendementen veel aparte burst spermatocyte kernen met homologen ondergaan van de leptotene, zygotene, pachytene, diplotene en diakinese substages van profase ik.
De techniek van de voorbereiding van de oppervlak-spread kernen (ook wel chromatine verspreiding analyse) wordt veel gebruikt om te studeren van meiose op het gebied van reproductieve en celbiologie. Dia's met oppervlak-spread kernen kunnen vervolgens immunostained met antilichamen tegen proteïnen van belang of onderworpen aan zilveren kleuring en vervolgens geanalyseerd met microscopie. De methode is vergelijkbaar voor zowel vrouwelijke als mannelijke muizen, hoewel wijzigingen voor vrouwelijke muizen2zijn beschreven. Het is belangrijk niet te overmince van seminiferous buisjes. Kernen ook goed moeten worden gespreid zodat na immunokleuring homologen en geassocieerde eiwitten zijn duidelijk gezien met microscopie. Oppervlakte-spread kernen kunnen worden in slechts een paar uur en beide immunostained onmiddellijk bereid of opgeslagen bij-80 ° C voor een maximum van 3 weken voor ontdooien en immunokleuring. Optimale resultaten worden echter best verkregen voor sommige eiwitten als immunokleuring wordt uitgevoerd onmiddellijk of binnen 2 weken na de voorbereiding van de oppervlak-spread kernen. Dia's kunnen immunostained met een standaard protocol met behulp van antilichamen tegen proteïnen van belang, gevolgd door incubatie met secundaire antilichamen geconjugeerd aan fluorescente proteïnen of kleurstoffen, dan beeld met fluorescentie microscopie8. Op postnatale dag 15-21 is er voldoende weefsel per paar van wild type teelballen opleveren van 6-10 dia's en oudere muizen (met inbegrip van volwassenen) meer dia's zal opleveren. Echter zal wild type muizen 6 weken en ouder ook meer post Meiotische cellen (d.w.z. spermatids) op de dia's na immunokleuring opleveren. Bovendien, alle substages van profase ik kan worden waargenomen in de jeugd- en volwassen muizen. De testikels van de mannetjes op postnatale dagen 10 t/m 15 levert veel meer leptotene en zygotene cellen. Muizen ouder dan postnatale dag 14 tot 15 zal het opleveren van meer pachytene en diplotene kernen.
Hier wij beschrijven en demonstreren van een veel gebruikte methode voor te bereiden oppervlak-spread kernen van muis spermatocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden waarbij muizen gebruikt hoge ethische en sociale normen, en goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité aan Drexel University College of Medicine.
1. bereiding van de oplossingen en instrumenten die nodig zijn
- Bereiden hypotone extractie Buffer (HEB) in 50 mL ultrazuiver laboratorium rang water, pH 8.2-8.4 (tabel 1). Maak de oplossing vers telkens Houd op ijs, en gebruik binnen 2 uur van de voorbereiding van de spreads; Dit is nodig om de vermindering en protease remming van activiteiten van DTT en PMSF, respectievelijk te optimaliseren. Gebruik 10 mL HEB voor elk paar van muis teelballen.
- Bereiden een sacharoseoplossing 100 mM (vers telkens) door toevoeging van 0.342 g van sacharose tot 10 mL van ultrazuiver laboratorium rang water. Breng de pH op 8.2
- Bereid kleefpoeders oplossing (1% paraformaldehyde (PFA), 0,15% Triton X-100, pH aangepast aan 9.2 met 1 N HCl of 1 N NaOH) verse maandelijks en winkel het bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Verdun een 16% commercieel beschikbare PFA begin voorraad tot 4% in 1 X PBS voor gebruik als een werkende voorraad en sla 4% aliquots bij-20 ° C.
- Ter voorbereiding van de kleefpoeders oplossing, voeg 10 mL van 4% PFA-oplossing en 600 µL van 10% Triton X-100 aan 30 mL 1 X PBS, meng goed, en breng de pH op 9.2 met 1 N HCl of 1 N NaOH. Bewaar de kleefpoeders oplossing in een 50 mL conische buis gewikkeld in aluminiumfolie bij kamertemperatuur (voor niet meer dan 4 weken).
- Bereiden van wassen oplossingen (terwijl dia's de laatste 30 minuten drogen zijn) met Photo-Flo 200: 0.4% Photo-Flo 200/PBS (320 µL van Photo-Flo 200 in 80 mL 1 X PBS) en 0,4% Photo-Flo 200/dH2O (160 µL van Photo-Flo 200 in 40 mL ultrazuiver laboratorium rang water). Gebruik een pot 50 mL Coplin gevuld met 40 mL van de oplossingen om te wassen van 10 of minder dia's tegelijk.
- Voorbereiding van de volgende instrumenten: 1 paar chirurgische schaar (aan de incise van de huid), 1 paar fijne punt chirurgische schaar (aan de incise van het buikvlies), 2 paar rechtstreeks fijne punt pincet (om te ontleden uit elke testis), 1 rechte rand scheermesje (te incise elke testis), 2 paar gebogen uiteinde pincet (te immobiliseren elke testis uitstotings de seminiferous buisjes), 50 mL Coplin potten, Teflon afgedrukt 3 ring glijbanen, 1 scalpel met maat 11 blade, bevochtigde kamer, 100 x 15 mm petrischalen, fijne punt permanente marker of potlood, en een platform roterende shaker.
- Plaats premium ongeladen precleaned berijpte einde glas dia's rechtop in een 50 mL Coplin pot gevuld met kleefpoeders oplossing tot gebruik.
Opmerking: Potlood heeft de voorkeur als dia's worden vervolgens gebruikt in procedures waarbij ethanol, zoals fluorescentie in situ hybridisatie.
- Plaats premium ongeladen precleaned berijpte einde glas dia's rechtop in een 50 mL Coplin pot gevuld met kleefpoeders oplossing tot gebruik.
2. spermatocyte kernen verspreiden
- Een mannelijke muis volgens institutionele richtsnoeren (bv cervicale dislocatie met of zonder CO2 verstikking) euthanaseren.
- Gebruik P10 - P20 mannetjes te evalueren Meiotische cellen in de eerste golf van de spermatogenese; We gebruiken routinematig P15 - P17 mannetjes te verkrijgen van de cellen van alle substages van profase I. volwassen teelballen zorgt voor cellen van profase ik ook, maar zij zal ook het opleveren van meer postmeiotic cellen, zoals spermatids.
- Oogst en wegen van de teelballen (opnemen de gepaarde gewichten); plaats ze in een petrischaal met een paar druppels van koud HEB hen om vochtig te houden.
- Houd de testis tegen de onderkant van de schotel met een gebogen uiteinde Tang en een richtliniaal scheermesje gebruiken om een kleine verticale middellijn incisie door de capsule van de testis. Terwijl nog het houden de testis tegen de onderkant van de schotel met een pincet, gebruik een tweede reeks van gebogen uiteinde pincet of richtliniaal scheermesje te zachtjes knijpen de seminiferous tubuli van de testis.
- Plaats de tubuli in een conische tube van 15 mL, met 10 mL koud HEB, verzorgen om te voorkomen dat het aanbrengen van de stukken van de capsule in de buis. Herhaal deze stappen met de tweede testis.
- Incubeer de gepelde seminiferous buisjes in de conische buis met HEB op ijs gedurende 30-60 minuten, afhankelijk van de grootte van de teelballen. Incubeer seminiferous buisjes van een paar van teelballen met een gewicht van 30 mg of minder voor 30 min, tubuli van een paar van teelballen met een gewicht van 31 tot en met 50 mg voor 30-45 minuten, en grotere teelballen gedurende 60 minuten. Wijzig niet de tijden voor een één testis.
Opmerking: De optimale incubatietijd kan variëren afhankelijk van de ervaring van de experimentator, de gebruikte reagentia en de muizen wordt geanalyseerd. - Terwijl seminiferous buisjes zijn broeden in HEB, een markering of potlood wilt gebruiken de berijpte uiteinden van precleaned dia's met muis label nummer, datum en dianummer. Plaats dan de vooraf gereinigd dia's in een pot van de Coplin met de kleefpoeders oplossing.
- Na incubatie, giet u de tubuli en HEB in een schone petrischaal en aparte tubuli in ongeveer 3 mm diameter klontjes. Elke klomp levert 2 dia's en het aantal dia's leverde hangt af van de grootte van de teelballen.
Opmerking: Wij verkrijgen 8 dia's wild type en 6 glijbanen van basale Chtf18-null P16 teelballen (die kleiner zijn als gevolg van verminderde aantallen Meiotische en mitotische kiemcellen8). Een volwassen testis met een gewicht van 100 mg of meer zou opbrengst 16 dia's worden verwacht. - Plaats 23 µL van 100 mM sacharoseoplossing in een ring van een Teflon gedrukt, 3 ring van dia en voeg een klomp van seminiferous buisjes aan de ring. Vervolgens met behulp van gebogen uiteinde pincet om te houden van de klomp, zachtjes mince de tubuli met een scheermesje uit de grootte-11 tot de oplossing troebel wordt.
Opmerking: Niet overmince aangezien dit in gefragmenteerde chromosomen resulteren zal. Er rekening mee dat gefragmenteerde chromosomen kunnen ook indicatieve van een mutant fenotype. - Verwijderen van puin, voegt een ander 23 µL van sacharoseoplossing, en gebruikt een micropipet te zachtjes Pipetteer het mengsel omhoog en omlaag een paar keer om te helpen de cellen in de suspensie te scheiden.
- Verwijder een dia onderdompelen in de pot van de Coplin met kleefpoeders oplossing en kantelen van de dia over de pot, zodat die een genereuze druppel op de bodem hoek van de dia verzamelt.
- Pipetteer 20 µL celsuspensie van sacharose uit de ring van de Teflon gedrukte 3 ring dia in de kleefpoeders druppel op een premie frosted glasplaatje en Pipetteer de schorsing op en neer 2 - 3 keer.
Opmerking: De kleefpoeders druppel moet groot genoeg zijn in volume zodat toevoeging van 20 μL van de celsuspensie sacharose ernaar dekking over de hele dia als het mengsel is verspreid (zie 2.11 hieronder).
- Pipetteer 20 µL celsuspensie van sacharose uit de ring van de Teflon gedrukte 3 ring dia in de kleefpoeders druppel op een premie frosted glasplaatje en Pipetteer de schorsing op en neer 2 - 3 keer.
- Langzaam het kantelen van de dia aan de zijde tegenover de druppel om te verspreiden van de celsuspensie langs de lengte van de dia. Vervolgens langzaam het kantelen van de dia terug naar het verspreiden van de celsuspensie langs de breedte van de dia te bedekken volledig. Vermijd de schorsing verspreiden over het zelfde gebied van de dia meer dan eens anders die de cellen met elkaar zullen overlappen.
- Onmiddellijk plaats van dia plat in een bevochtigde kamer en herhaal stappen 2.8 tot en met 2.11 tot alle klontjes van seminiferous buisjes zijn gebruikt voor het maken van dia's. Het is belangrijk niet te verhuizen van de bevochtigde kamer tijdens het droogproces scheuren en overlappende cellen te voorkomen.
- Laat de dia's in een overdekte bevochtigde ruimte bij kamertemperatuur gedurende 2,5 uur uit te broeden, zodat ze langzaam en niet volledig droog. Hoge luchtvochtigheid en langzaam drogen in deze stap zijn belangrijk om ervoor te zorgen dat voldoende verspreiding van de chromatine. Vervolgens Verwijder het klepje van de kamer en laat dia's volledig een extra 30 minuten drogen.
- Dia's (rug aan rug of in een zigzag patroon) plaats in een pot van de Coplin met 0,4% Photo-Flo 200/1 X PBS oplossing en wassen van dia's tweemaal, 5 minuten elk, jar door zachtjes schudden van de Coplin op een roterende shaker platform. Gebruik verse oplossing voor elke wassen en houd van dia's van verschillende muizen in aparte potten voor elk van de wast.
- Wassen van de dia's in een Coplin pot met 0,4% Photo-Flo 200/dH2O oplossing voor 5 min eens terwijl het schudden.
- Verwijderen dia's uit de Coplin jar (laatste wash), zorgvuldig veeg de randen en de bodem van de dia's te verwijderen van de overtollige vloeistof, en dia's te plaatsen op de positie van een hoekige, bijna-rechtop te drogen. Experimentator die bedreven in deze techniek is kan verwerken en bereiden van oppervlak-spread kernen van 4 of 5 muizen in één dag.
- Eenmaal droog (15-20 min), verwerken van dia's onmiddellijk voor immunofluorescentie kleuring of winkel bij-80 ° C in een strak gesloten dia doos beschermd tegen licht voor een maximum van 3 weken (afhankelijk van de eiwitten van de doelgroep wordt geëvalueerd; optimale resultaten kunnen worden verkregen als gekleurd dezelfde dag of binnen 2 weken).
- Als opgeslagen bij-80 ° C, vervolgens toestaan dia's om te komen tot kamertemperatuur en wassen in een pot van de Coplin met 1 X PBS of blok voor 5 min voordat de kleuring.
Opmerking: Vele verschillende immunofluorescentie kleuring protocollen zal bieden goede resultaten; verwijzen naar Berkowitz et al. voor een immunokleuring protocol8.
- Als opgeslagen bij-80 ° C, vervolgens toestaan dia's om te komen tot kamertemperatuur en wassen in een pot van de Coplin met 1 X PBS of blok voor 5 min voordat de kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het vermogen van deze methode om grote aantallen oppervlak verspreid kernen met intact homologen hangt af van drie belangrijke factoren: 1) passende incubatietijd van seminiferous buisjes in hypotone buffer (d.w.z. HEB) voldoende om gepofte spermatocyte kernen die barsten, maar doen niet desintegreren van langdurige incubatie in HEB, 2) micropipetting de sacharose druppels van cellen te verkrijgen van een gescheiden opschorting van kernen die niet worden samengeklonterd samen, en 3) dia in één richting tegelijk elke fixeerspray kantelen gecoat en niet heen en weer. Zodra voorbereid, oppervlak verspreiding kernen kunnen immunostained met fluorescently gelabelde antilichamen tegen proteïnen van belang en vervolgens beeld met microscopie (vertegenwoordiger van de voorbeelden worden weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2. Figuur 1 toont voorbeelden van wild type pachytene kernen die zijn goed verspreid (A), kernen met ongelijk immunostained, gescheurde verschijnen homologen als gevolg van incubatie in HEB te lang, onder b, slecht verspreid overlappende kernen (C), en kernen met gefragmenteerde homologen toe te schrijven aan de "overmincing" van seminiferous buisjes (D). Wanneer de techniek goed wordt uitgevoerd, een overvloed aan kernen die vertegenwoordigen de belangrijkste 5 substages van profase ik kan worden verkregen. Figuur 2 toont de stadia van het leptotene, zygotene, pachytene, diplotene en diakinese van de profase I kernen van wild type spermatocyten van de jonge mannetjes.
Figuur 1: Oppervlakte spreiden kernen van wild type spermatocyten van jonge muizen.
Pachytene spermatocyte kernen werden gekleurd met anti-SYCP3 (groen), die de kernen van de elementen van de axiale/laterale van het synaptonemal complex (A) goed verspreid vlekken. (B) kernen van seminiferous buisjes geïncubeerd in HEB te lang. (C) slecht verspreid overlappende kernen. (D) gefragmenteerde homologen toe te schrijven aan de "overmincing" van seminiferous buisjes (pijlpunten duiden op twee kleine homolog fragmenten). De bar van de schaal is 5 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Voorbeelden van kernen uit substages van profase ik.
Wild type spermatocyten van de jonge mannetjes zijn gekleurd met CREST serum (rood), die vlekken centromeren, en anti-SYCP3 (groen), die vlekken van de axiale/laterale elementen van het synaptonemal-complex. De fasen van het leptotene, zygotene, pachytene, diplotene en diakinese van profase I, respectievelijk, worden weergegeven. De bar van de schaal is 5 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Reagens | Hoeveelheid | Eindconcentratie |
| 1 M Tris-Cl (pH 8.2) | 1,5 mL | 30 mM |
| Sacharose | 0.85575 g | 50 mM |
| Trinatriumcitraat citraat (dihydraat) p.a. | 0,25 g | 17 mM |
| 0.5 EDTA M | 500 ΜL | 5 mM |
| Dithiothreitol (DTT) | 0.00385 g | 0.5 mM |
| 0,2 M Phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF) | 25 ΜL | 0.1 mM |
Tabel 1: Recept voor hypotone extractie Buffer (HEB).
Reagentia naar 50 mL ultrazuiver laboratorium rang van water en pas op een pH van 8,2-8.4 (indien nodig gebruik 1 N NaOH oplossing of 1 N HCl) toevoegen. Bereiden van verse HEB elk tijd, houd op ijs en gebruiken binnen 2 uur van bereiding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met het oog op een groot aantal goed verspreid, goede kwaliteit spermatocyte kernen, omvatten de belangrijkste stappen van dit protocol passende incubatietijd van seminiferous buisjes in HEB, passende hakken van seminiferous buisjes, en de techniek gebruikt om te de celsuspensie sacharose verspreid de kleefpoeders gecoate dia('s). We broeden seminiferous buisjes van testes van wild type mannetjes variërend van postnatale dag 15 naar volwassenheid in HEB voor 45 min, terwijl de teelballen van relatief leeftijd Chtf18-null muizen worden ge¨ uncubeerd slechts 30 min omdat teelballen helft van de grootte zijn en bevatten aanzienlijk minder kiemcellen8. In onze ervaring, incubatie van Chtf18-null teelballen voor langer dan 30 minuten in het gedrang de integriteit van de cellen brengt, wat resulteert in slecht opgelost homologen. Seminiferous buisjes zijn gehakt alleen met het oog op een celsuspensie bewolkt sacharose, en elke dia moet bevatten een gulle droplet van fixeerspray vóór verspreiding (zie 2.10). Dia's zijn in één richting tegelijk en niet heen en weer bewogen. De methode is ideaal om te studeren van meiose ik, maar het is grotendeels beperkt tot substages van profase ik. Echter gerapporteerd kernen in premeiotic S-fase, de metafase I en II kunnen worden waargenomen en zijn7,9.
Dit is een eenvoudige methode die vergt wat oefening om bevoegdheid en de beste resultaten te krijgen. Suboptimaal resultaten kunnen optreden om een aantal verschillende redenen. Kernen kunnen niet goed verspreid worden, wat resulteert in gegroepeerde of overlappende cellen. Dit kan gebeuren als de celsuspensie sacharose is niet adequaat afgepipetteerde of er niet genoeg fixeerspray op de dia is te verspreiden van de kernen goed. Als dia's zijn niet bekleed met genoeg resterende fixeer of de celsuspensie is niet verspreid over de dia in één vlotte richting of herhaaldelijk spread heen en weer, zal dan cellen overlappen en klomp samen. Als seminiferous buisjes zijn "overminced" dan homologen worden gefragmenteerd of enigszins geraspte verschijnen. Aangezien mutant teelballen kunnen kleiner zijn, minder spermatocyten bevatten en meer vatbaar voor "overmincing" of fragmentatie van seminiferous buisjes, is het aan te raden het beoefenen van een paar keer op controle (b.v. wild type) teelballen eerst voor het optimaliseren van de techniek in de de handen van een beginner.
Voorbereiden van oppervlak verspreiding kernen is een fundamentele techniek die wordt gebruikt om belangrijke regelgevende stappen en progressie van meiose te onderzoeken, alsmede te karakteriseren Meiotische fenotypes bij muizen. Dus, wij gebruiken deze methode uitgebreid en alle nieuwe leden van de lab leren uit te voeren. Zodra deze techniek is de knie, kan een groot aantal andere technieken worden gebruikt later en in combinatie met het. Bijvoorbeeld verschillende soorten immunokleuring en/of microscopie inclusief widefield of met epifluorescence of elektron confocal microscopie kan worden uitgevoerd. Naast het bestuderen van meiose-specifieke eiwitten zoals componenten van synaptonemal complex, kunnen die interactie met de SC, zoals cohesins, multiprotein complexen die samenhang bemiddelen, worden geëvalueerd (herzien in 10,11 12). Regulering van de DNA vorming van de crossover, verwerking en rijping kan en zijn ook bestudeerd met deze techniek13. In addition, deze techniek is verricht na het gebruik van methoden voor het verkrijgen van specifieke populaties van muis spermatocyten: 1) opbrengst na cultuur van spermatocyten in "okadaic acid" voor het opwekken van de progressie naar de overgang van G2/MI, verhoogde aantallen diplotene, diakinese en metafase ik verspreidt14,,15 en 2) na de methoden voor het isoleren van een verrijkte bevolking van pachytene spermatocyten14.
De techniek van de voorbereiding van de oppervlak-spread kernen van muis spermatocyten beschreven en gedemonstreerd dat hier is een zeer nuttig en eenvoudige techniek. Het is ultieme naar elke lab dat studies meiose muizen gebruikt als een modelorganisme, maar vereist enige praktijk en finesse om de beste resultaten te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de technische bijstand van Abigail Harris. Zij erkennen ook Paula Cohen en Kim Holloway voor zijn bijdrage aan het optimaliseren van het protocol van de voorbereiding van de oppervlak-spread kernen van muis spermatocyten. De auteurs waarderen ook kritische lezing van het manuscript door Karen Schindler.
Dit werk werd gesteund door de NIH R01 GM106262 te K.M.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 °C |
| Teflon printed 3 ring slides | Electron Microscopy Sciences | 63418-11 | |
| Premium uncharged frosted end glass slides | Several commercial brands | Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides | |
| Surgical scissors (sharp and blunt tips) | Fine Science Tools | 14001-12 | Different brand of a similar type will work |
| Fine tip surgical scissors (sharp tips) | Fine Science Tools | 14058-11 | Different brand of a similar type will work |
| Straight fine tip forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Different brand of a similar type will work |
| Curved medium tip forceps | Fisher | 16100110 | Different brand of a similar type will work |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Different brand of a similar type will work |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use at 1:300 |
| Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum) | Antibodies Incorporated | 15-234-0001 | Use at 1:50 |
| Humidified chamber | We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels | ||
| Widefield microscope with epifluorescence | Leica microsystems | Any standard model | |
| Coplin jars | Several commercial brands | 50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back) | |
| Petri dishes | Several commercial brands | 100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated |
References
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R.
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
