Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.
Lymfocyt ekstravasation i centralnervesystemet (CNS) er afgørende for immun overvågning. Sygdomsrelaterede ændringer af lymfocyt ekstravasation kan resultere i patofysiologiske forandringer i CNS. Således undersøgelse af lymfocytmigration i CNS er vigtigt at forstå inflammatoriske CNS-sygdomme og udvikle nye terapi tilgange. Vi præsenterer her en in vitro model af den menneskelige blod-hjerne-barrieren for at studere lymfocyt ekstravasation. Human hjerne mikrovaskulære endotelceller (HBMEC) er confluently dyrkes på et porøst polyethylenterephthalat Transwell indsætte at efterligne endotel af blod-hjerne-barrieren. Barrierefunktion er valideret af zonula occludens immunhistokemi, transendotele elektrisk modstand (TEER) målinger samt analyse af Evans blue permeation. Denne model giver mulighed for undersøgelse af diapedesis af sjældne lymfocytundergrupper såsom CD56 lyse CD16 dim / – NK-celler. Furthermmalm, virkningerne af andre celler, cytokiner og chemokiner, sygdomsrelaterede ændringer og distinkte behandlingsregimer på vandrende kapacitet af lymfocytter kan undersøges. Endelig kan analyseres virkningen af inflammatoriske stimuli samt forskellige behandlingsregimer på endotelbarrieren.
Lymfocytmigration fra blodet ind i væv er afgørende for immun overvågning. En sekvens af specifikke molekylære vekselvirkninger sikrer stedspecifik ekstravasation i tyndtarmen, hud, lymfeknuder, centralnervesystemet (CNS), og andre væv 1. Ændringer i lymfocytmigration er involveret i patofysiologien af en række bred spredning sygdomme 2. Migration i immun-priviligerede CNS reguleres stramt og følgelig ændringer af denne proces er involveret i CNS-relaterede sygdomme som encephalomyelitis 3, neuromyelitis optica, slagtilfælde og dissemineret sklerose (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Derfor er det vigtigt at studere lymfocyt ekstravasation til bedre at forstå sygdommen patofysiologi og udvikle værktøjer til en melioration af sygdomstilfælde 8, 9, 10, 11, 12.
Lymfocytter migrerer i CNS via distinkte veje. Ekstravasation gennem postkapillære venuler i det subarachnoide rum via blod-cerebrospinalvæske barriere inden choroid plexus og over blod-hjerne-barrieren er blevet beskrevet 1, 13, 14, 15. Migration over blod-hjerne-barrieren udføres ved interaktionen af lymfocytter med endothelceller 14. I modsætning til endotelceller i periferien, endotelceller i CNS udtrykker høje mængder af tight junction-molekyler, hvorved strengt at begrænse mængden af celler og proteiner i stand til at krydse blod-hjerne-barrierenlass = "xref"> 16. Inflammation resulterer i løsning af tight junctions og inducerer ekspressionen af adhæsionsmolekyler; således, øge lymfocytmigrering i CNS 1, 17, 18.
Ekstravasation via blod-hjerne-barrieren er en flertrinsproces. Lymfocytter tøjr til endotelcellerne og derefter rulle langs endotel i en proces hovedsagelig medieret af selectiner 1, 15. Efterfølgende interaktioner mellem kemokiner udskilt af endothelet og de respektive chemokinreceptorer udtrykt på lymfocytter inducerer konformationelle ændringer af integriner og dermed fremme fast adhæsion til endotelcellerne 1. Endelig lymfocytter enten kravle langs endotel barriere mod blodstrømmen inden transmigrating ind i det perivaskulære rum eller stall umiddelbart og direkte transmigrate på stedet for fast adhæsion 1, 19, 20. Alle disse trin af lymfocyt ekstravasation kan analyseres in vitro ved anvendelse distinkte teknikker 21. Time-lapse video mikroskopi bruges til at studere den indledende tethering og rullende 15. Adhæsionsanalyser give detaljerede oplysninger om fast anholdelse at endotelbarrierer 22. Transmigration assays som påvist her tillader analyse af immun-celle transmigration 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.
Anvendelse af det humane in vitro blodhjernebarrieren model, kunne vi for nylig viser, at en højere migrDELSE kapacitet CD56 lyse CD16 dim / – NK-celler i forhold til deres CD56 dim CD16 + modparter blev afspejlet ved en overvægt af dette NK-undergruppe i det intratekale rum 21. Således er vores forsøgsopstilling synes at være egnet til at efterligne in vivo situationen.
Her præsenterer vi en teknik til at undersøge transmigration af lymfocytter på tværs af humant blod-hjerne-barrieren. In vitro analyse af lymfocyt migration til CNS er vigtigt at studere grundlæggende processer af lymfocyt ekstravasation, potentielle sygdomsrelaterede ændringer, og nye terapeutiske fremgangsmåder.
Adskillige modifikationer af blod-hjerne-barrieren model er mulige. For eksempel kunne celler fra det øvre rum analyseres for at undersøge sammensætningen af …
The authors have nothing to disclose.
This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 “Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease” (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).
PBS | Gibco | 14190-094 | without CaCl2 or MgCl2 |
Fibronectin 1mg/mL | Sigma | F1141-5MG | from bovine plasma |
T-25 cell culture flask | Greiner BioOne | 690160 | |
HBMEC | ScienCell | 1000 | |
Pelobiotech | PB-H-6023 | ||
Accutase | Sigma | A6964-100ML | |
ECM-b | ScienCell | 1001-b | |
FBS | ScienCell | 1001-b | |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 1001-b | |
Endothelial cell growth supplement | ScienCell | 1001-b | |
Transwell | Corning | 3472 | clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size |
96-well flat bottom plate | Corning | 3596 | |
Evans blue | Sigma | E2129-10G | stock solution: 1 g/50 mL PBS |
B27 | Gibco | 17504-044 | 50x concentrated |
Infinite M200Pro | Tecan | ||
96-well black flat bottom plate | Greiner BioOne | 675086 | |
48-well plate | Corning | 3526 | |
RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
Flow Count Fluorospheres | Beckman Coulter | 7547053 | |
Na-EDTA | Sigma | E5134 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
Gallios 10-color flow cytometer | Beckman Coulter | ||
Kaluza 1.5a | Beckman Coulter | ||
TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
CD3-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 300430 | clone UCHT1 |
CD56-PC7 | Beckman Coulter | A21692 | clone N901 |
CD16-A750 | Beckman Coulter | A66330 | clone 3G8 |
CD4-FITC | Biolegend | 300506 | clone RPA-T4 |
CD8-A700 | Beckman Coulter | A66332 | clone B9.11 |