Abstract
Linfócitos extravasão para o sistema nervoso central (SNC) é crítica para a vigilância imunitária. alterações relacionadas com a doença de extravasamento de linfócitos pode resultar em alterações fisiopatológicas no SNC. Assim, investigação sobre a migração de linfócitos para o SNC é importante para entender as doenças inflamatórias do sistema nervoso central e o desenvolvimento de novas abordagens de terapia. Aqui apresenta-se um modelo in vitro da barreira sangue-cérebro humano para estudar o extravasamento de linfitos. células endoteliais humanas microvasculares cerebrais (HBMEC) são cultivadas em confluently um tereftalato de polietileno poroso Transwell Insert para imitar o endotélio da barreira sangue-cérebro. a função de barreira é validado por zonula occludens imuno-histoquímica, a resistência eléctrica transendotelial (TEER) medidas bem como a análise de Evans permeação azul. Este modelo permite a investigação da diapedese de subconjuntos de linfócitos raras, tais como CD56 CD16 brilhante dim / - células NK. Furthermminério, os efeitos de outras células, citocinas e quimiocinas, alterações relacionadas com a doença, e regimes de tratamento diferentes na capacidade migratória de linfócitos podem ser estudados. Finalmente, o impacto de estímulos inflamatórios, bem como diferentes regimes de tratamento sobre a barreira endotelial pode ser analisado.
Introduction
migração de linfócitos a partir do sangue para os tecidos é crucial para a vigilância imunitária. Uma sequência de interacções moleculares específicos assegura extravasamento local específico para o intestino delgado, de pele, nódulos linfáticos, o sistema nervoso central (CNS), e outros tecidos 1. Alterações na migração de linfócitos estão envolvidos na patofisiologia de uma série de doenças ampla disseminação 2. Migração para o SNC imuno-privilegiado é fortemente regulada e, consequentemente, alterações deste processo estão envolvidos em doenças relacionadas com o SNC, como encefalomielite 3, neuromielite óptica, acidente vascular cerebral, e esclerose múltipla (MS), 2, 4, 5, 6, 7. Portanto, é importante estudar o extravasamento de linfócitos para melhor compreender a fisiopatologia da doença e desenvolver ferramentas para uma melhoramento da doença de carga 8, 9, 10, 11, 12.
Os linfócitos migra para o SNC através de rotas distintas. Extravasamento através de vénulas pós-capilares para o espaço subaracnóide através da barreira sangue-fluido cerebrospinal dentro do plexo coróide e através da barreira sangue-cérebro ter sido descrito um, 13, 14, 15. Migração através da barreira sangue-cérebro é conduzida pela interacção de linfócitos com células endoteliais 14. Em contraste com as células endoteliais na periferia, as células endoteliais do SNC expressar quantidades elevadas de moléculas de juno apertadas, assim limitar rigorosamente a quantidade de células e proteínas capazes de atravessar a barreira sangue-cérebrolass = "xref"> 16. Inflamação resulta em afrouxamento de junções apertadas e induz a expressão de moléculas de adesão; assim, aumentando a migração de linfócitos para o SNC 1, 17, 18.
Extravasamento através da barreira sangue-cérebro é um processo de múltiplos passos. Linfócitos do tirante para as células endoteliais e, em seguida, rolar ao longo do endotélio em um processo mediado principalmente por selectinas 1, 15. Posteriormente, as interacções entre as quimioquinas segregadas pelo endotélio e os respectivos receptores de quimiocinas expressas em linfócitos induzir mudanças conformacionais de integrinas, promovendo assim a adesão firme para as células endoteliais 1. Finalmente, quer linfócitos de rastreamento ao longo da barreira endotelial contra o fluxo de sangue antes transmigrando para o espaço perivascular, ou parar imediatamente e directamente transmigrate no local da empresa de aderência 1, 19, 20. Todos estes passos de extravasamento de linfitos pode ser analisada in vitro utilizando técnicas distintas 21. Microscopia de lapso de tempo vídeo é usado para estudar o tethering inicial e rolando 15. Os ensaios de adesão fornecem informações detalhadas sobre a prisão firme endoteliais barreiras 22. Os ensaios de transmigração como demonstrado aqui permitem a análise de transmigração de células imunes 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.
Usando o modelo humano in vitro barreira hematoencefálica, que recentemente poderia mostrar que uma maior migrAtory capacidade de CD56 CD16 brilhante dim / - células NK em comparação com o seu CD56 dim CD16 + homólogos foi reflectida por uma predominância deste subconjunto de células NK no compartimento 21 intratecal. Assim, a instalação experimental parece ser adequado para mimetizar a situação in vivo.
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Protocol
1. Cultura de células de cérebro humano Células Endoteliais Microvasculares (HBMEC)
- Revestimento de frascos de cultura de células
- Para preparar a solução de fibronectina, adicionar 10 mL de PBS para um tubo de centrífuga de 15 mL. Adicionar 150 mL de fibronectina e misture bem.
- Para cobrir o fundo de um frasco de cultura de células T-25, adicionar 2 ml de solução de fibronectina. Incubar o balão de cultura de células durante pelo menos 3 h a 37 ° C na incubadora. Revestidas com fibronectina frascos podem ser armazenados durante 2 semanas a 37 ° C / 5% de CO 2.
- Sementeira e cultura de células de HBMEC
- Aspirar solução de fibronectina a partir do fundo do frasco de cultura de célula. Adicionar 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² suspenso em 6 ml de meio de ECM-b (= ECM-b suplementado com 5% de soro fetal bovino, 1% de penicilina / estreptomicina e 1% de suplemento de crescimento de células endoteliais). Incubar a 37 ° C / 5% de CO 2. Verifique o crescimento de células diariamente usando um microscópio.
- Mudar o meio cada 3 dias.Colheita ou células divididas, quando HBMEC atingir aproximadamente 80% de confluência. HBMEC deve ser usado entre a passagem 1 e 15 para evitar a perda de propriedades fisiológicas.
- Colheita HBMEC.
- Prepare Accutase solução por mistura de Accutase (1x) com PBS numa proporção de 1: 1. Manter Accutase solução a 37 ° C em um banho de água até à sua utilização.
- Transferência médio ECM-b a partir do balão de cultura de células para um tubo de centrífuga de 15 mL. Lavar HBMEC por adição de 5 mL de PBS para o fundo do frasco de cultura de células. Aspirar PBS e repetir o passo de lavagem mais duas vezes.
- Adicionar a solução de 2 ml pré-aquecido Accutase. Incubar a 37 ° C durante 2 min. Posteriormente, HBMEC são re-suspensos batendo firmemente o frasco de cultura de células várias vezes. destacamento das células é controlada usando um microscópio
- O ECM-b-forma previamente armazenado num tubo de 15 ml é adicionado de volta ao frasco de cultura de células, logo que HBMEC começar a separar. Lavar o fundo do frasco repetidamente até que a maioria são HBMECre-suspensa.
- Transferir a suspens celular para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Elimine o sobrenadante e as células em 1 mL de meio de ECM-b re-suspender. Contar as células e dilui-se a suspensão de células para se conseguir uma concentração final de 3 x 10 5 mL HBMEC por meio de ECM-b.
2. Preparação do celular Cultura Insere
- Revestimento de inserções de cultura de células
Nota importante: Evite tocar a membrana das inserções de cultura de células.- Adicionar 100 de soluo de fibronectina (ver 1.1.1) de cada inserção de cultura de células (Figura 1A) e uma cavidade de uma placa de 96 poços de fundo plano (controlo óptico bem). Incuba-se durante pelo menos 3 h a 37 ° C. Depois da solução de incubação aspirado fibronectina.
- Adicionar 100 mL HBMEC suspensão para as inserções de cultura de células e o controlo óptico bem. Adicionar 600 ul de ECM-b meio para o compartimento inferior da célulainserções cultura. Incubar durante 3 - 4 dias a 37 ° C / 5% de CO2 até que a integridade da barreira (Figura 1B) é atingido, verificar o crescimento celular por avaliação microscópica do HBMEC no controlo óptico bem. Nota: O crescimento celular para além de quatro dias não é recomendado.
- Opcional: Para imitar as condições inflamatórias aspirar o meio a partir do compartimento inferior e substituí-la por ECM-b meio suplementado com 500 U / mL de IFN-γ / TNF-α 24 h antes do ensaio de migração.
3. Controle de Qualidade com azul Evans no dia do ensaio Transmigração
- Preparação de solução de azul de Evans
- Para preparar PBS / B27 solução mistura de 10 mL de PBS com suplemento B27 200 ul utilizando um tubo de 15 ml de centrífuga. Diluir solução mãe de azul de Evans (20 mg / mL PBS) 1: 1000 com PBS / B27.
- ensaio de permeabilidade de azul de Evans
- Aspirar o meio do compartimento inferior seguido pelo compartimento superiorde uma inserção de cultura de célula contendo uma monocamada confluente HBMEC. Adicionar 100 mL Evans solução azul para a inserção de cultura de célula.
- Adicionar 600 de PBS / B27 para o compartimento inferior e incubar durante 60 min a 37 ° C / 5% de CO 2. Cuidadosamente remover a inserção de cultura de célula usando uma pinça.
- medição de azul de Evans
- Remover PBS / B27 a partir do compartimento inferior e transferir 100 ul cada um de dois pos de uma polistirol preto placa de 96 poços de fundo plano. Inserir a placa num leitor de placas Tecan Pro Infinito M200 e determinar-z posição óptima.
- excitação medida de azul de Evans, utilizando respectivas configurações (por exemplo: de excitação: 620 nm, emissão: 680 nm, largura de banda de excitação: 9 nm, largura de banda de emissão: 20 nm, realce 175x, 25 flashes, tempo de integração: 20 mS).
- Para determinar as funções de barreira HBMEC comparar os dados adquiridos para uma curva padrão representando Evans permeação azul através HBMEC em diferentes pontos de tempo após a sementeing células (Figura 1B, à direita).
4. Migração Assay
- Preparação de células mononucleares de sangue periférico (PBMC).
- Adicionar 10 mL de meio RPMI para um tubo de centrífuga de 15 ml e adiciona-se 200 uL suplemento B27. Contagem de células PBMC e de centrifugação a 300 xg durante 5 min. Re-suspender as PBMC a uma concentração final de 5 x 10 6 culas / mL de RPMI / B27.
- Defina-se o ensaio de migração
- Meio aspirado a partir do compartimento inferior seguido pelo compartimento superior de inserções de cultura de células contendo monocamadas confluentes HBMEC (Figura 1A). Por doador, adiciona-se 100 uL de suspensão de PBMC de cada para as inserções de cultura de células e também a um poço de uma placa de 24 poços por (in vitro de controlo).
- Adicionar 600? L de RPMI / B27 para o compartimento inferior das inserções de cultura de células e 500 ul para o PBMC do controlo in vitro e incubar 6 h a 37 ° C / 5% de CO 2.
- Colheita de PBMC migrado
- Retire a inserção de cultura de célula usando uma pinça e lavar cuidadosamente a parte inferior com 400 uL de PBS sem tocar na membrana. Descartar a inserção de cultura de célula.
- Adicionar 20 ul fluorosferas contagem de fluxo (cerca de 1000 esferas / uL) para o compartimento inferior da cultura celular inserir, bem como para o controlo in vitro e misturar bem. Transferir 1 ml da resultante suspensão de PBMC para tubos de citometria de fluxo.
5. Citometria de Fluxo
- Preparação de amostra
- Centrífuga PBMC a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Preparar a soluo de anticorpo através da adição de anticorpos fluorocromo-conjugados com 100 uL de tampão de citometria de fluxo (PBS / BSA a 1% / EDTA a 2 mM) por amostra. Para os resultados apresentados abaixo 1 uL de CD4-FITC, um μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 uL de CD56-PC7, 1 uL CD8-A700, e 1 uL de CD16-A750 foram usadas por amostra.
- Re-suspender PBMC em 100 mL da solução de anticorpo e incubar durante 30 min a 4 ° C.
- Adicionar 250 uL de tampão de citometria de fluxo e centrifugar a 300 xg durante 5 min.
- aquisição amostra
- Re-suspender as PBMC na quantidade necessária (varia de acordo com o citetro de fluxo utilizado) de tampão de citometria de fluxo.
- Adquirir manchado de PBMC utilizando um citómetro de fluxo com um detector activa entre 525 e 700 nm comprimento de onda para detectar fluorosferas contagem de fluxo (excitação 488 nm, emissão a 525-700 nm).
(Os passos seguintes são um exemplo, se um fluxo Gallios citómetro operado com o software Kaluza G é usada:. (1) Iniciar o computador (2) Quando o sistema de operação está completamente carregado, iniciar o citómetro de fluxo por prensagem a "citómetro no" botão . (3) Coloque o respectivo protocolo de aquisição, premindo o botão "protocolo aberto". (4) Escolha o protocolo necessário e selecione "abrir". (5) Duplicar o protocolo para cada amostra, clicando com o direitobotão do mouse sobre o protocolo visível no carrossel virtual e um clique esquerdo no campo "duplicado". (6) Rotular cada amostra na lista de amostra. (7) Transferir as amostras para as posições indicadas do carrossel e iniciar a aquisição.)
- análise de amostras
- Abrir fluxo resultante citometria de dados usando o respectivo software. Determinar o número de sub-populações de interesse para PBMC transmigradas, bem como células in vitro a partir de poços de controlo e fluir fluorosferas contagem usando o respectivo software de análise.
(Um exemplo da estratégia de intermitcia é dada na parte resultados (Figura 1 C: Para analisar a transmigração de subconjuntos de culas NK, seleccionar primeiro os linfócitos em um canal de dispersão para um lado (SSC) em relação ao canal de dispersão FSC) trama (linfócitos são. então exibidos num CD3 contra CD56 trama e CD56 + CD3 -. As células NK são seleccionados para distinguir entre os subconjuntos de células NK, células NK são exibidas emum contra CD56 CD16 CD56 CD16 trama e brilhante dim / - células NK, bem como CD56 CD16 + são seleccionadas dim. Além disso, fluorosferas contagem de fluxo são seleccionados a partir de um FSC SSC contra trama e posteriormente apresentado numa trama de um canal com uma emissão entre 525 e 700 nm versus tempo para determinar o seu número.) - Para calcular o número total de células de cada amostra, normalizar o número de células detectadas usando fluorosferas contagem de fluxo:
- Determinar a percentagem de células que migraram como a razão entre células que migraram totais e de células totais no controlo in vitro.
- Abrir fluxo resultante citometria de dados usando o respectivo software. Determinar o número de sub-populações de interesse para PBMC transmigradas, bem como células in vitro a partir de poços de controlo e fluir fluorosferas contagem usando o respectivo software de análise.
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Representative Results
Os resultados representativos, mostrando a transmigração de células NK e subconjuntos de células T utilizando o modelo de barreira sangue-cérebro humano (Figura 1A) são mostrados. A integridade da monocamada HBMEC foi validado por coloração da molécula de junção estanque ZO-1, a resistência eléctrica medições transendotelial (TEER), e Evans permeação azul (Figura 1B). Seguindo 3 - 4 dias de cultura HBMEC expressa a molécula de junção estanque ZO-1 (Figura 1B, esquerda). Além disso, HBMEC cresceu em monocamadas que exibem resistência eléctrica transendotelial (Figura 1B meio), bem como de permeação reduzida para Evans Blue (Figura 1B, à direita). HBMEC monocamadas foram usadas para estudar a transmigração de células NK CD56, incluindo CD16 brilhante dim / - e CD56 dim + subconjuntos de culas NK CD16 e das células T, incluindo células como dois ex CD4 + e CD8 + Tamples (Figura 1D + E, respectivamente). A percentagem de células que migraram foi calculada com base nas contagens de células obtidos por citometria de fluxo e normalizados fluorosferas utilizando contagem de fluxo como um controlo interno (Figura 1C). A monocamada HBMEC foi estimulado com IFN-γ e TNF-α 24 h antes do ensaio para imitar as condições inflamatórias. estimulação citoquina resultou num aumento da migração de todas as populações de linfócitos analisados. Isto pode ser devido a um aumento da expressão de moléculas de adesão incluindo ICAM-1 (dados não mostrados). CD56 CD16 brilhante dim / - células NK apresentaram uma capacidade migratória mais elevada quando comparada com a sua CD56 dim CD16 + NK através de ambos não estimulada (10,88% versus 0,86%) e IFN-γγ / TNF-α estimulada (18,22% versus 2,94%) HBMEC (Figura 1D). No entanto, o aumento relativo da transmigração como um resultado de inflamação foi maior para o CD56 dim CD16 + vs. 167% + para CD56 CD16 brilhante dim / -). Estes resultados imitar as observações in vivo que CD56 CD16 brilhante dim / - células NK são enriquecidas no compartimento intratecal. Assim, o modelo de barreira sangue-cérebro parece ser adequado para analisar os princípios básicos de diapedese de células imunes de populações de linfócitos raras para o SNC 21. Finalmente, a capacidade transmigratória de CD4 e subconjuntos de células T CD8 é mostrado (Figura 1E).
Figura 1: Migração Diferencial de subconjuntos de culas NK em todo não inflamadas e inflamadas HBMEC monocamadas. A. Uma imagem de inserções transwell (esquerda) e ilustração da configuração experimental (direita). B. A validação das funções de barreira HBMEC. Esquerda: coloração imuno-histoquímica da junção mol apertadoecule ZO-1 utilizando anticorpo de coelho anti-humano ZO-1 (Abcam, 1: 200) e anticorpo de cabra anti-coelho IgG-Cy3 (1: 300) em HBMEC cultivada durante 3 dias. Centro: resistência eléctrica transendotelial (TEER) de HBMEC entre o dia 2 e dia 4 de cultura. Direita: curva padrão para a permeação Evans azul para HBMEC com estimulação ( "inflamação", vermelho) ou sem ( "não inflamado", preto) com 500 U / mL de IFN-γ e TNF-α durante 24 horas. Os ensaios são realizados de transmigração de 72 - 96 horas após a sementeira da HBMEC (seta preta). CE. PBMC derivadas a partir de 16 indivíduos saudáveis foram submetidos a ensaios de migração, conforme descrito na secção de protocolo. 24 h antes do ensaio, metade das inserções de cultura de células foram estimuladas com 500 UI / ml de IFN-γ e TNF-α. células transmigradas foram colhidas e analisadas por citometria de fluxo. C. Resultados representativos para PBMC derivadas a partir do controlo in vitro bem (em cima) e após a migração através HBMEC não inflamado (parte inferior). NK cel ls foram controladas a partir de linfócitos totais como CD3 - CD56 + células e ainda distinguida em CD56 CD16 brilhante dim / - ( "CD56 brilhante ") e CD56 + (" dim CD56") subconjuntos de células NK CD16 fraca. fluorosferas contagem de fluxo ( "beads") foram fechado baseado em FSC / SSC características e seu número foi determinada em um FL3 contra enredo tempo. Exemplos de cálculos para determinar a percentagem de células CD56 e CD56 brilhante dim NK migrados são mostradas à direita. D. Percentagem de células NK migraram bem como subconjuntos de células NK dim CD56 brilhante e CD56, e E. percentual de células T CD4 +, incluindo migraram e subconjuntos de células T CD8 + seguintes transmigração através não inflamado (preto) ou inflamada (vermelho) HBMEC representado como média ± SEM. Os valores P foram calculados pelo teste t emparelhado de estudante; ** p <0,01, *** p <0,001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg" target = '_ blank'> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui apresentamos uma técnica para investigar a transmigração de linfócitos através da barreira sangue-cérebro humano. A análise in vitro de migração de linfócitos para o SNC é importante para estudar processos básicos de extravasamento de linfitos, potenciais alterações relacionadas com a doença, e de novas abordagens terapêuticas.
Várias modificações do modelo de barreira sangue-cérebro são possíveis. Por exemplo, as células do compartimento superior poderia ser analisados para se investigar a composição da população de células não-migrado. Além disso, o tratamento da monocamada HBMEC com IFN-γ e TNF-α 24 horas antes do ensaio pode ser usado para imitar uma barreira sangue-cérebro inflamado, a fim de estudar o efeito de perturbações do SNC inflamatórios 21, 25. Da mesma forma, o tratamento de linfócitos HBMEC ou com outras substâncias permite investigar os seus efeitos sobre o extravasamento de linfitos (por exemplo, a suaefeito sobre moléculas de adesão) 30, 31. O envolvimento de certas moléculas de adesão pode ser estudada utilizando anticorpos que bloqueiam por integrinas ou os seus ligandos 32. Além disso, a instalação experimental aqui apresentada permite a análise de efeitos quimiotácticos de quimiocinas ou sobrenadantes derivados de astrócitos ou de outras células 33, 34. Substituição de HBMEC com células epiteliais derivadas de cérebro humano primárias alarga o espectro de esta instalação experimental para a investigação da barreira sangue-fluido cerebrospinal 15. HBMEC não deve ser substituído com células ou células endoteliais imortalizadas derivadas de outros órgãos para manter CNS-especificidade do modelo. No entanto, as células endoteliais derivado de cérebro de outras espécies pode ser usada para analisar a transmigração dos respectivos animais 35. Além disso, o ácido retinóico ou hidrocortisone foram descritos para aumentar as funções de barreira e, assim, pode ser empregue 36, 37. No caso do número de células limitadas a quantidade de células submetidas a ensaio pode ser reduzida, porque o nosso modelo fornece taxas de recuperação lineares entre 2 x 10 e 5 1 x 10 6 PBMC (dados não mostrados). Para analisar populações de células raras seguintes transmigração que poderia ser necessário para células de piscina de vários poços, de modo a obter células suficientes necessárias para citometria de fluxo. Finalmente, a instalação experimental também pode ser utilizado para estudar a entrega da droga para o sistema nervoso central 38. Um tamanho de poro de 3 um é normalmente utilizado para permitir a transmigração de linfócitos, enquanto que um tamanho de poro de 0,4 um impede a transmigração de linfócitos, mas permite estudar de entrega de droga 39, 40, 41, 42.
43. A centrifugação de HBMEC a baixas forças de g e o uso de passagens iniciais (isto é,
Embora a aderência com o protocolo descrito aqui assegura resultados significativos e reprodutíveis, esta técnica apresenta algumas limitações. Em primeiro lugar, in vivo a barreira hemato-encefálica é formado por um número de células, as quais interagem de várias maneiras e reforçar a função de barreira ao afectar a formação de junções apertadas 1. Portanto, embora este modelo barreira hemato-encefálica é uma boa aproximação da situação in vivo, aspectos importantes estão faltando. Além disso, o extravasamento de linfócitos no SNC através da barreira sangue-cérebro é um processo de múltiplos passos. Embora cada única etapa pode ser investigadas separadamente, a técnica apresentada aqui não fornece informações sobre o quele processo de extravasamento sob a influência de forças de corte 2, 44, 45, 46. Finalmente, a análise de células migraram de PBMC pode ser um desafio, dependendo da freqüência das células de interesse, porque geralmente apenas freqüências de um único dígito de células transmigram. Por conseguinte, a separação das populações de interesse antes do ensaio ou conjugação de células que migraram através de múltiplas inserções de cultura de células pode ser necessário. Outros modelos para a análise da migração de leucócitos para o CNS cobrir alguns dos aspectos que faltam em nosso modelo. A co-cultura com astritos, pericitos, e / ou os neurónios são utilizados para imitar a complexidade da barreira sangue-cérebro melhor 47. Modelos, incluindo forças de cisalhamento, como DIV-BBB refletem mais as condições fisiológicas, assim, permitindo uma análise mais sofisticada da diapedese de linfócitos 48. Em resumo, é apresentada uma técnica facilmente acessível apropriado para a investigação de diapedese de linfócitos qualitativa e quantitativa através da barreira sangue-cérebro humano.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Gibco | 14190-094 | without CaCl2 or MgCl2 |
| Fibronectin 1 mg/mL | Sigma | F1141-5MG | from bovine plasma |
| T-25 cell culture flask | Greiner BioOne | 690160 | |
| HBMEC | ScienCell | 1000 | |
| Pelobiotech | PB-H-6023 | ||
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | |
| ECM-b | ScienCell | 1001-b | |
| FBS | ScienCell | 1001-b | |
| Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 1001-b | |
| Endothelial cell growth supplement | ScienCell | 1001-b | |
| Transwell | Corning | 3472 | clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size |
| 96-well flat bottom plate | Corning | 3596 | |
| Evans blue | Sigma | E2129-10G | stock solution: 1 g/50 mL PBS |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x concentrated |
| Infinite M200Pro | Tecan | ||
| 96-well black flat bottom plate | Greiner BioOne | 675086 | |
| 48-well plate | Corning | 3526 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
| Flow Count Fluorospheres | Beckman Coulter | 7547053 | |
| Na-EDTA | Sigma | E5134 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Gallios 10-color flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Kaluza 1.5a | Beckman Coulter | ||
| TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
| CD3-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 300430 | clone UCHT1 |
| CD56-PC7 | Beckman Coulter | A21692 | clone N901 |
| CD16-A750 | Beckman Coulter | A66330 | clone 3G8 |
| CD4-FITC | Biolegend | 300506 | clone RPA-T4 |
| CD8-A700 | Beckman Coulter | A66332 | clone B9.11 |
References
- Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
- Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
- Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
- Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
- Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
- Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
- Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
- Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
- Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
- Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24 (2014).
- Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
- Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
- Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
- Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
- Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
- Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
- Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
- Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
- Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
- Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
- Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
- Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
- Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
- Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
- Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
- Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
- Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
- Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
- Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
- Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
- Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
- Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
- Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
- Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
- Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
- Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
- Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
- Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
- Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
- Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).
