Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Анализ лимфоцитов экстравазации спользование Published: April 5, 2017 doi: 10.3791/55390
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster
* These authors contributed equally

Abstract

Лимфоцит экстравазация в центральную нервную систему (ЦНС) имеет решающее значение для иммунного надзора. Болезни, связанные с изменениями в лимфоцитах кровоподтек может привести к патофизиологических изменений в ЦНС. Таким образом, исследование миграции лимфоцитов в ЦНС важно понимать, воспалительные заболевания ЦНС и для разработки новых подходов терапии. Здесь мы представляем модель в пробирке человеческого гематоэнцефалического барьера для изучения лимфоцитов кровоизлияния. микрососудистый мозг человеческого эндотелиальные клетки (HBMEC) являются confluently, выращенные на пористом полиэтилентерефталате Transwell вставки, чтобы имитировать эндотелий из гематоэнцефалического барьера. Функция Барьера подтверждено блокатора малой зоны иммуногистохимии, трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) измерения, а также анализ Evans Blue проникания. Эта модель позволяет исследование диапедеза редких субпопуляций лимфоцитов , такие как CD56 CD16 ярко тусклые / - клетки NK. Furthermруды, влияние других клеток, цитокинов и хемокинов, связанных с болезнью изменений, а также различных схем лечения на миграционный способности лимфоцитов могут быть изучены. И, наконец, воздействие воспалительных стимулов, а также различные режимы лечения на эндотелиальном барьере может быть проанализированы.

Introduction

Лимфоцит миграция из крови в ткань имеет решающее значение для иммунного надзора. Последовательность конкретных молекулярных взаимодействий обеспечивает сайт - специфическое экстравазации в тонком кишечнике, кожи, лимфатических узлов, центральной нервной системы (ЦНС), и других тканей 1. Изменения в миграции лимфоцитов участвуют в патофизиологии ряда широких распространенных заболеваний 2. Миграция в иммунной привилегированном ЦНС жестко регулируется и , соответственно , изменения этого процесса вовлечены в ЦНС заболеваний , связанных как энцефаломиелита 3, оптиконевромиелит, инсульт и рассеянный склероз (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Поэтому важно изучить лимфоциты кровоизлияния, чтобы лучше понять патофизиологию болезни и разработать инструменты для агромелиорация болезни бремени 8, 9, 10, 11, 12.

Лимфоциты мигрируют в ЦНС с помощью различных маршрутов. Экстравазационный через посткапиллярные венули в субарахноидальное пространство через кровь цереброспинальной жидкости барьера в пределах сосудистого сплетения и через гематоэнцефалический барьера, были описаны 1, 13, 14, 15. Миграция через гематоэнцефалический барьер проводится при взаимодействии лимфоцитов с эндотелиальными клетками 14. В отличие от эндотелиальных клеток на периферии, эндотелиальные клетки ЦНС экспрессируют высокие количества плотных молекул перехода, таким образом, строго ограничивая количество клеток и белков, способных пересекать гематоэнцефалический барьердеваха = "Xref"> 16. Результаты Воспаления в разрыхлении плотных контактов и индуцируют экспрессию молекул адгезии; Таким образом, усиление миграции лимфоцитов в ЦНС 1, 17, 18.

Экстравазационный через гематоэнцефалический барьер является многоступенчатым процессом. Лимфоциты привязь к клеткам эндотелия , а затем катиться по эндотелию в процессе , главным образом , опосредованного селектинов 1, 15. Впоследствии, взаимодействия между хемокинов , секретируемых эндотелием и соответствующих рецепторов хемокинов , выраженные на лимфоциты индуцируют конформационные изменения интегринами, тем самым способствуя твердую адгезию к клеткам эндотелия 1. И, наконец, лимфоциты либо ползать по эндотелиальному барьеру против кровотока, прежде чем переселяется в периваскулярное пространстве, или срыв немедленно и непосредственно радиопередающиеigrate на сайте фирмы адгезии 1, 19, 20. Все эти этапы экстравазации лимфоцитов могут быть проанализированы в пробирке с использованием различных методик 21. Покадровое видео микроскопия используется для изучения начальных привязывать и прокатки 15. Адгезионные анализы предоставляют подробную информацию о твердом аресте в эндотелиальные барьеры 22. Трансмиграция анализы , как продемонстрировано здесь , позволяют анализ иммунной клетки трансмиграции 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

Использование человека в пробирке крови барьер мозга модель, недавно мы могли бы показать , что выше MIGRAtory емкость CD56 CD16 ярко тусклая / - клетки NK по сравнению с их CD56 DIM CD16 + аналоги отражались преобладанием этой субпопуляции NK в интратекальной камере 21. Таким образом, наша экспериментальная установка , кажется, подходит для имитации ситуации в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культура клеток головного мозга человека микрососудистой эндотелиальных клеток (HBMEC)

  1. Окраска клеточной культуры колб
    1. Для приготовления раствора фибронектина, добавляют 10 мл PBS в 15 мл центрифужной пробирки. Добавьте 150 мкл фибронектин и хорошо перемешать.
    2. Для того, чтобы покрыть дно Т-25 клеточной культуры колбу добавляют 2 мл раствора фибронектина. Инкубируйте колбы для культивирования клеток в течение по крайней мере 3 ч при 37 ° С в инкубаторе. Фибронектина покрытием колбы может храниться в течение 2 недель при 37 ° С / 5% CO 2.
  2. Посевная и культуры клеток из HBMEC
    1. Аспирируйте раствор фибронектина со дна колбы для культивирования клеток. Добавить 7,2 × 10 4 HBMEC / см² суспендируют в 6 мл ЕСМ-б среды (= ЕСМ-Ь с добавлением 5% сыворотки плода коровы, 1% пенициллина / стрептомицина и 1% добавки для роста клеток эндотелия). Инкубируют при 37 ° C / 5% CO 2. Проверьте рост клеток ежедневно с помощью микроскопа.
    2. Изменение среды каждые 3 дня.Урожай или разделить клетки, когда HBMEC достигают примерно 80% сплошности. HBMEC следует использовать между прохождением 1 и 15, чтобы избежать потери физиологических свойств.
  3. Урожай HBMEC.
    1. Подготовка Accutase раствора путем смешивания Accutase (1x) с PBS в соотношении 1: 1. Хранить Accutase раствора при 37 ° С в водяной бане до дальнейшего использования.
    2. Передача ЕСМА-B среды из колбы для культивирования клеток в 15 мл центрифужной пробирки. Промыть HBMEC путем добавления 5 мл PBS на дно колбы для культивирования клеток. Аспирируйте PBS, и повторить стадии промывки еще два раза.
    3. Добавить 2 мл подогретого Accutase раствора. Инкубируют при 37 ° С в течение 2 мин. После этого, HBMEC ресуспендировали, твердо нажав клеточную культуру колбы несколько раз. Открепления клеток контролируется с помощью микроскопа
    4. ЕСМ-б-среда ранее сохраненная в трубке 15 мл добавляют обратно в колбу для культивирования клеток, как только HBMEC начинают отделяться. Промыть дно колбы несколько раз, пока большинство HBMEC нересуспендировали.
    5. Передача клеточной суспензии в 15 мл центрифужной пробирки. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант и вновь приостановить клеток в 1 мл ЕСМ-б среды. Граф клеток и разбавленной клеточной суспензии , чтобы достичь конечной концентрации 3 × 10 5 HBMEC на мл ЕСМ-б среды.

2. Получение клеточной культуры вкладышами

  1. Покрытие клеточных культур вставок
    Важное замечание: Не прикасайтесь к мембране вставок клеточных культур.
    1. Добавьте 100 мкл раствора фибронектина (см 1.1.1) для каждой клеточной культуры вставки (рисунок 1А) и одну лунку 96-луночного плоским дном пластины (а оптического контроля). Инкубировать в течение по крайней мере 3 ч при 37 ° С. После инкубации аспирата фибронектина раствора.
    2. Добавьте 100 мкл суспензии HBMEC к вставкам культуры клеток и оптический контроль скважины. Добавьте 600 мкл ЕСМ-б среды в нижнее отделение ячейкикультуры вставки. Инкубируют в течение 3 - 4 дней при 37 ° C / 5% CO 2 до целостности барьера (фиг.1В) достигается, проверить рост клеток путем микроскопического оценки HBMEC в оптическом контроле хорошо. Примечание: рост клеток за четыре дня не рекомендуется.
    3. Необязательно: Для имитации воспалительных состояний аспираты среды из нижнего отсека и заменить его ЕСМ-б среды с добавлением 500 ед / мл IFN-gamma / TNF-alpha 24 ч предварительного анализа миграции.

3. Контроль качества Evans Blue, на день анализа Трансмиграции

  1. Приготовление раствора синего Эванса
    1. Для приготовления PBS / B27 смеси 10 мл раствора PBS 200 мклы B27 добавки с использованием 15 мл центрифужной пробирки. Развести Evans Blue маточного раствора (20 мг / мл PBS), 1: 1 000 с PBS / B27.
  2. Эванс синего анализа проницаемости
    1. Аспирируйте среды из нижнего отсека, затем верхний отсекиз одной клеточной культуры, содержащей вставку сливающийся HBMEC монослой. Добавьте 100 мкл синего Эванса решение вставки клеточной культуры.
    2. Добавьте 600 мкл PBS / B27 в нижний отсек и инкубируют в течение 60 мин при 37 ° C / 5% CO 2. Осторожно удалите вставку для культивирования клеток с помощью щипцов.
  3. Эванс синий измерение
    1. Удалить PBS / B27 из нижнего отсека и передачи 100 мкл каждого к двум лунки черного полистирола 96-луночного плоской нижней плите. Вставьте пластину в считывающем Tecan Бесконечного M200 Pro пластины и определить оптимальную Z-позицию.
    2. Мера возбуждения синего Эванса с использованием соответствующих настроек (например: возбуждение: 620 нм, излучение 680 нм, ширина полосы частот возбуждения: 9 нм, ширина полосы излучения: 20 нм, повышение 175x, 25 мигает, время интегрирования: 20 мкс).
    3. Для того, чтобы определить, барьерные функции HBMEC сравнить данные приобрели со стандартным кривым, изображающей Evans Blue проникания через HBMEC в различные моменты времени после семениING клетки (рис 1В, справа).

4. Анализ миграции

  1. Получение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС).
    1. Добавляют 10 мл RPMI в 15 мл центрифужные пробирки и добавляют 200 мкл B27 дополнения. Граф РВМС и центрифужные клетки при 300 мкг в течение 5 мин. Повторное приостановить РВМС до конечной концентрации 5 × 10 6 клеток / мл RPMI / B27.
  2. Настройка из анализа миграции
    1. Аспирируйте среда из нижнего отсека , затем верхний отсеком для культивирования клеток , содержащих вставки сливающегося HBMEC монослоев (Фигура 1А). За донора добавляют 100 мкл суспензии РВМС каждый к вставкам клеточных культур , а также одну лунку 24-луночного планшета на (в пробирке) управления.
    2. Добавьте 600 мкл RPMI / B27 в нижний отсек вставки для культивирования клеток и 500 мкл в РВМС контроля в пробирке и инкубируют в течение 6 ч при 37 ° C / 5% CO 2.
    3. Заготовка мигрированного РВМСА
      1. Выньте вставку для культивирования клеток с помощью щипцов и тщательно промыть дно с 400 мкл PBS, не касаясь мембраны. Выбросьте вставку для культивирования клеток.
      2. Добавьте 20 мкл подсчета потока флуоросферы (около 1000 бусин / мкл) в нижнем отсеке клеточной культуры вставки, а также к контролю в пробирке и хорошо перемешать. Передача 1 мл суспензии РВМСА в результате проточной цитометрии трубок.

    5. Проточная цитометрия

    1. Базовые приготовления
      1. Центрифуга РВМС при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
      2. Готовят раствор антител путем добавления Флуорохром-конъюгированные антитела к 100 мкл буфера проточной цитометрии (PBS / 1% БСА / 2 мМ ЭДТА) на образец. Для получения результатов, представленных ниже 1 мкл CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 мкл CD56-PC7, 1 мкл CD8-A700, и 1 мкл CD16-A750 были использованы на образец.
      3. Re-приостановить PBМС в 100 мкл раствора антител и инкубируют в течение 30 мин при 4 ° С.
      4. Добавьте 250 мкл буфера для проточной цитометрии и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин.
    2. приобретение образца
      1. Повторное приостановить РВМС в требуемом количестве (варьируется в зависимости от используемого проточного цитометра) проточной цитометрии буфера.
      2. Acquire окрашенную РВМС с использованием проточного цитометра с активным детектором между 525 и 700 нм для обнаружения потока подсчета флуоросферы (возбуждение 488 нм, излучение 525 - 700 нм).
        (Следующие шаги являются примером, если используется поток Gallios цитометр работает с программным обеспечением Калуца ​​G:. (1) Запустить компьютер (2) Когда операционная система полностью загружена, начинается поток цитометра, нажав кнопку «цитометра на» кнопке . (3) Загрузите соответствующий протокол сбора, нажав кнопку «открытого протокола». (4) выберите нужный протокол и выберите «открыть». (5) Дублирование протокола для каждого образца, щелкнув справакнопка мыши на протоколе видимого в виртуальной карусели и левой кнопкой мыши на поле «Дубликата». (6) Добавьте каждый образец в списке выборки. (7) Передача образцов в указанных положениях карусели и начать приобретение.)
    3. анализ проб
      1. Открыть в результате проточной цитометрии данных с помощью соответствующего программного обеспечения. Определение количества субпопуляций , представляющих интерес для переселилась РВМС, а также из клеток в пробирке контрольных лунок , и поток подсчета флуоросферы с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа.
        (Пример стратегии стробирования приведен в части результатов (рисунок 1 C: Для анализа трансмиграцию НК-клеток подмножеств, сначала выбрать лимфоциты в вбок рассеяния канала (SSC) в сравнении вперед разброс канала (FSC) участка Лимфоциты. затем отображается в CD3 против CD56 и CD56 сюжета + CD3 -. выбраны клетки NK Чтобы различать NK-клеток подмножеств, клетки NK отображаются вCD56 против CD16 и CD56 сюжет яркий CD16 тусклый / - а также CD56 тусклый CD16 + NK - клетки выбраны. Кроме того, граф потока флуоросфера выбираются из FSC против SSC участка, а затем отображаются на участке канала с испусканием в диапазоне от 525 до 700 нм в зависимости от времени, чтобы определить их число.)
      2. Для того, чтобы вычислить общее количество клеток каждой пробы, нормализует обнаруженное число клеток с помощью подсчета потока флуоросферы:
        Уравнение
      3. Определить процент мигрировавших клеток , как соотношение между общими мигрировавших клеток и общего числа клеток в контроле в пробирке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Типичные результаты , показывающие трансмиграцию NK-клеток и подмножеств Т-клеток с использованием человеческой гематоэнцефалического барьера модели (рисунок 1А) показаны. Целостность монослоя HBMEC была подтверждена окрашиванием плотных соединений молекулы ZO-1, трансэндотелиальное измерение электрического сопротивления (Тир), и Evans Blue инфильтрация (Фигура 1В). После 3 - 4 дней культуры HBMEC выразил плотную соединительную молекулу ZO-1 (Фигура 1В, слева). Кроме того, HBMEC росли в монослоях , проявляющих трансэндотелиальное электрическое сопротивление (Фигура 1В среднего), а также снижение проницаемости для синего Эванса (Фигура 1В, справа). HBMEC монослои были использованы для изучения трансмиграции клеток NK в том числе CD56 яркие CD16 тусклых / - и CD56 + CD16 тусклым подмножество NK-клетки и Т - клетки , в том числе CD4 + и CD8 + Т - клетки в виде два бывшихamples (рис 1D + E, соответственно). Процент мигрировавших клеток рассчитывали на основе числа клеток , полученное с помощью проточной цитометрии и нормализованных с помощью подсчета потока флуоросфер в качестве внутреннего контроля (рис 1C). Моноаяся HBMEC стимулировали IFN-gamma и TNF-alpha 24 ч до анализа для имитации воспалительных состояний. Цитокина стимуляция приводит к увеличению миграции всех анализируемых популяций лимфоцитов. Это может быть связано с повышенной экспрессией молекул адгезии, включая ICAM-1 (данные не показаны). CD56 CD16 яркий тусклым / - NK - клетки показали более высокую миграционную способность по сравнению с их тусклым CD56 CD16 + NK на обоих нестимулированных (10,88% против 0,86%) и ИФН-Гг / TNF-alpha стимулированного (18,22% против 2,94%) HBMEC (рис 1D). Тем не менее, относительное увеличение трансмиграции в результате воспаления было выше для CD56 + CD16 тусклых сравнению с + 167% для CD56 CD16 ярко тусклым / -). Эти результаты имитировать наблюдения в естественных условиях , что CD56 яркие CD16 DIM / - клетки NK обогащены в интратекальном отсеке. Таким образом, барьер модель гематоэнцефалической кажется, пригодны для анализа основных принципов иммунно-клеточного диапедеза редких популяций лимфоцитов в ЦНС 21. И, наконец, transmigratory способность CD4 и подмножеств Т-клеток CD8 показано (рис 1E).

Рисунок 1
Рисунок 1: Дифференциальный Миграция подмножествах NK-клеток через Uninflamed и воспаленной HBMEC монослоев. A. Изображение Transwell вставок (слева) и иллюстрации экспериментальной установки (справа). В. Проверка барьерных функций HBMEC. Слева: иммуногистохимическое окрашивание плотных соединений мольecule ZO-1 с использованием кроличьего анти-человеческий ZO-1 (Abcam, 1: 200) и коз против кроличьего IgG-Су3 (1: 300) на HBMEC культивируемой в течение 3 дней. Центр: трансэндотелиальной электрическое сопротивление (TEER) из HBMEC между 2-й день и 4-й день культивирования. Справа: стандартная кривая для синего Эванса проницаемости для HBMEC с ( «воспаленной», красный) или без него ( «uninflamed», черный) стимуляции с 500 Ед / мл ИФН-γ и TNF-α-в течение 24 часов. Трансмиграция анализы проводят 72 - 96 часов после посева HBMEC (черная стрелка). CE. РВМС, полученный из 16 здоровых индивидуумов были подвергнуты миграции анализов, как описано в разделе протокола. 24 ч до анализа, половина из вставок клеточных культур стимулировали 500 МЕ / мл ИФН-γ и TNF-α-. Переселенные клетки собирали и анализировали с помощью проточной цитометрии. С. Типичные результаты для PBMC , полученный от контроля в пробирке скважины (вверху) и после миграции через uninflamed HBMEC (внизу). NK чел Ls были закрытые типом от общих числа лимфоцитов как CD3 - CD56 + клеток и дополнительно подразделены на CD56 CD16 ярко тусклые / - ( "CD56 ярких ") и CD56 + CD16 тусклых (" CD56 тусклые") NK-клетки подмножеств. кол-Flow флуоросферы ( «шарики») были закрытого типа на основе FSC / SSC характеристик и их количество было определено в FL3 от времени сюжета. Примерные расчеты , чтобы определить процент перенесенных CD56 и CD56 ярких тусклый NK клеток, показаны справа. D. Процент мигрировавших клеток NK, а также CD56 и CD56 ярких тусклые подмножества NK-клетки, и E. процент перенесенных Т - клетки , в том числе CD4 + и CD8 + подмножеств Т-клеток после трансмиграции через uninflamed (черный) или воспаленные (красный) HBMEC изображается в виде среднего значения ± SEM. P-значения были вычислены с помощью парного студенческого т-теста; ** р <0,01, *** р <0,001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы представляем технику для исследования перевоплощения лимфоцитов через человек гематоэнцефалического барьера. В пробирке анализа лимфоцитов миграции в ЦНС важно изучить основные процессы лимфоцитарного кровоподтека, потенциальных изменений , связанные с болезнью, и новых терапевтических подходов.

Несколько модификаций барьерной модели гематоэнцефалической возможны. Например, клетки из верхнего отсека могут быть проанализированы, чтобы исследовать состав населения неперемещенных клеток. Кроме того, лечение монослоя HBMEC с IFN-gamma и TNF-alpha 24 часа до анализа может быть использовано для имитации воспаленного гематоэнцефалического барьера с целью изучения влияния воспалительных заболеваний ЦНСА 21, 25. Аналогичным образом , обработка HBMEC или лимфоцитов с другими веществами позволяет исследовать их влияние на экстравазации лимфоцитов (например , ихвоздействие на молекулах адгезии) 30, 31. Участие некоторых молекул адгезии могут быть изучены с помощью блокирующих антител для интегринов или их лигандов 32. Кроме того, экспериментальная установка , представленная здесь позволяет анализировать хемотаксис эффектов от хемокин или супернатантов , полученных из астроцитов или других клеток 33, 34. Замена HBMEC с первичными человеческим мозгом , полученные эпителиальными клетками расширяет спектр этой экспериментальной установки для исследования барьера 15 жидкости крови-спинномозговой. HBMEC не должен быть заменен иммортализованными эндотелиальными клетками или клетками, полученных от других органов для поддержания ЦНСА специфичности модели. Тем не менее, полученные из мозга эндотелиальные клетки из других видов могут быть использованы для анализа трансмиграции в соответствующих животных 35. Кроме того, ретиноевая кислота или гидрыocortisone были описаны для увеличения барьерных функций и , возможно , таким образом , можно использовать 36, 37. В случае ограниченного числа клеток количество клеток , подвергнутых анализа может быть уменьшено, потому что наша модель обеспечивает линейные скорости восстановления от 2 × 10 5 и 1 × 10 6 РВМС (данные не показаны). Для анализа редких клеточных популяций следующих перерождений может быть необходимо объединять ячейки из нескольких скважин с целью получения достаточного количества клеток, необходимые для проточной цитометрии. Наконец, наша экспериментальная установка также может быть использована для изучения доставки лекарственного средства в ЦНС 38. Размер пор 3 мкм , как правило , используются , чтобы позволить лимфоцит трансмиграции, в то время как размер пор 0,4 мкм предотвращает трансмиграцию лимфоцитов, но позволяет изучать доставки лекарственных средства 39, 40, 41, 42.

43. Центрифугирование HBMEC при низких г сил и использовании ранних пассажей (т.е.

Хотя присоединение к протоколу, описанному здесь обеспечивает значимые и воспроизводимые результаты, этот метод имеет некоторые ограничения. Прежде всего, в естественных условиях гематоэнцефалический барьер мозга формируется количеством клеток, которые взаимодействуют различными способами и укрепить барьерную функцию, влияя на образование плотных соединений 1. Поэтому, хотя этот барьер модель гематоэнцефалический является хорошим приближением ситуации в естественных условиях, важные аспекты отсутствуют. Кроме того, экстравазации лимфоцитов в ЦНС через гематоэнцефалический барьер является многоступенчатым процессом. В то время как каждый отдельный шаг может быть исследован отдельно, метод, представленный здесь не предоставляет информации о ктоле процесс транссудации под действием сил сдвига 2, 44, 45, 46. Наконец, анализ мигрировавших клеток из МНПК может быть сложным в зависимости от частоты клеток, представляющих интерес, потому что, как правило, только одноразрядные частоты клеток переселяться. Таким образом, разделение популяций интереса до анализа или пула клеток мигрировали через несколько вставок клеточных культур может быть необходимо. Другие модели для анализа миграции лейкоцитов в ЦНС охватывают некоторые аспекты отсутствует в нашей модели. Совместное культивирование с астроциты, перицитов и / или нейронов, используются , чтобы имитировать сложность гематоэнцефалического барьера лучше 47. Модели включая сдвиговые силы , такие как DIV-В отражают более физиологические условия, таким образом, позволяя более сложный анализ лимфоцитов диапедеза 48. Таким образом, мы приводим легко доступную технику, подходящую для исследования качественного и количественного диапедеза лимфоцитов через человек гематоэнцефалического барьера.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24 (2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).

Tags

Иммунологии выпуск 122 экстравазации лимфоцитов лимфоцитов миграции ЦНС самонаведения гематоэнцефалический барьер HBMEC эндотелий
Анализ лимфоцитов экстравазации спользование<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель человеческого гематоэнцефалический барьер
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., … More

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter