Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש Published: April 5, 2017 doi: 10.3791/55390
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, *1, *1
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster
* These authors contributed equally

Abstract

extravasation לימפוציטים לתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא קריטי עבור מעקב חיסוני. מחלות הקשורות שינויים של extravasation הלימפוציטים עלול לגרום לשינויים פתופיזיולוגיים של מערכת העצבים המרכזית. לפיכך, החקירה של הגירה לימפוציטים לתוך CNS חשוב להבין מחלות דלקתיות של מערכת העצבים המרכזית ועל מנת לפתח גישות טיפול חדשות. כאן אנו מציגים מודל במבחנה של מחסום דם-מוח האדם ללמוד extravasation הלימפוציטים. המוח כלי הדם אנוש תאי אנדותל (HBMEC) גדלים confluently על terephthalate פוליאתילן נקבובי Transwell להכניס לחקות האנדותל של מחסום הדם-מוח. תפקוד המחסום אומת על ידי אימונוהיסטוכימיה occludens zonula, ההתנגדות החשמלית Transendothelial (TEER) מדידות כמו גם ניתוח של חלחול כחול אוונס. מודל זה מאפשר חקירה של diapedesis של תת הלימפוציטים נדירים כגון CD16 בהיר CD56 לעמעם / - תאי NK. Furthermעפרות, את ההשפעות של תאים אחרים, ציטוקינים chemokines, שינויים הקשורים למחלות, ועל משטרי טיפול מובחנים על יכולת הנדידה של לימפוציטים ניתן ללמוד. לבסוף, את ההשפעה של גירויים דלקתיים כמו גם משטרי טיפול שונים על מחסום אנדותל ניתן לנתח.

Introduction

הגירה לימפוציטים מהדם אל רקמות היא קריטית עבור מעקב חיסוני. רצף של אינטראקציות מולקולריות ספציפיות מבטיח extravasation באתר מסוים לתוך מעי דק, עור, בלוטות לימפה, מערכת העצבים המרכזית (CNS), ורקמות אחרות 1. שינויים הגירה לימפוציטים מעורבים בפתופיזיולוגיה של מספר מחלות פרושות לרווחה 2. הגירה אל החיסונית-חסוי CNS מוסדר בחוזקה ושינויים בהתאם התהליך הזה מעורבים במחלות הקשורות למערכת העצבים המרכזית כמו encephalomyelitis 3, neuromyelitis אופטיקה, שבץ, טרשת נפוצה (MS) 2, 4, 5, 6, 7. לכן, חשוב ללמוד extravasation הלימפוציטים להבין טוב יותר פתופיזיולוגיה המחלה ולפתח כלים עבור צמחים וטיוב של מחלה 8 ניטל, 9, 10, 11, 12.

לימפוציטים להגר לתוך CNS באמצעות מסלולים נפרדים. Extravasation דרך venules postcapillary לחלל תת-עכבישי דרך מחסום נוזל המוח והשדרה-דם בתוך מקלעת דמית ולרוחב את מחסום הדם-מוח תוארו 1, 13, 14, 15. הגירה דרך מחסום הדם-מוח מתבצעת על ידי האינטראקציה של לימפוציטים עם תאי אנדותל 14. בניגוד לתאי אנדותל בפריפריה, תאי אנדותל של CNS לבטא כמויות גבוהות של מולקולות צומת חזק, ובכך בהחלט להגביל את כמות התאים והחלבונים מסוגל לחצות את מחסום הדם-מוחנַעֲרָה = "Xref"> 16. תוצאות דלקת התרופפות של צמתים הדוקים ומשרה את הביטוי של מולקולות הדבקה; ובכך, שיפור הגירה לימפוציטים לתוך CNS 1, 17, 18.

Extravasation דרך מחסום הדם-מוח הוא תהליך רב שלבי. לימפוציטים לקשור את תאי האנדותל ואז לגלגל לאורך האנדותל בתהליך בתיווך בעיקר על ידי selectins 1, 15. לאחר מכן, אינטראקציות בין וכמוקינים מופרשים על ידי האנדותל ואת קולטני chemokine בהתאמה הביעו על לימפוציטים לגרום לשינויים קונפורמציה של integrins, ובכך לקדם הדבקת חברת אל תאי אנדותל 1. לבסוף, לימפוציטים או זחילה לאורך המכשול אנדותל נגד זרימת הדם לפני transmigrating לחלל perivascular, או לעכב באופן מיידי וישיר Transmigrate באתר של הדבקת חברת 1, 19, 20. כל הצעדים הללו של extravasation הלימפוציטים ניתן לנתח במבחנה באמצעות טכניקות ברורות 21. זמן לשגות מיקרוסקופ וידאו משמש ללמוד את הקשירה הראשונית מתגלגל 15. מבחני הדבקה לספק מידע מפורט על מעצרו משרד אנדותל מחסומים 22. מבחני גלגול נשמות, כפי שהודגם כאן מאפשרים ניתוח של גלגול חיסוני תאים 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

שימוש האנושי במודל מחסום דם המוח במבחנה, אנו לאחרונה יכולים להראות כי migr גבוהקיבולת atory של CD16 הבהיר CD56 לעמעם / - תאי NK לעומת CD56 שלהם עמום CD16 + עמיתיהם שהתבטאו דומיננטיות של תת תא זה NK בתא intrathecal 21. לפיכך, הגדרת הניסוי שלנו נראה מתאים לחקות את המצב vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell תרבות לתאי אנדותל כלי הדם המוח האנושי (HBMEC)

  1. ציפוי של צלוחיות תרבית תאים
    1. כדי להכין את הפתרון פיברונקטין, להוסיף 10 מ"ל PBS כדי צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. הוספת 150 μL פיברונקטין ומערבבים היטב.
    2. כדי לכסות את תחתית בקבוק תרבות תא T-25 להוסיף 2 מ"ל של פתרון פיברונקטין. דגירת בקבוק תרבות תאים עבור 3 שעות לפחות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה. ניתן לאחסן צלוחיות מצופות פיברונקטין עבור 2 שבועות ב 37 ° C / 5% CO 2.
  2. זריעת תרבית תאים של HBMEC
    1. פתרון פיברונקטין לשאוב מן החלק התחתון של בקבוק תרבית תאים. להוסיף 7.2 x 10 4 HBMEC / cm² מושעה 6 בינוני מ"ל ECM-B (= ECM-B בתוספת 5% בסרום שור העובר, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ואת תוספת צמיחת תאים 1% אנדותל). לדגור על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2. בדוק צמיחת תאים יומי באמצעות מיקרוסקופ.
    2. שינוי המדיום כל 3 ימים.קציר או פיצול תאים, כאשר HBMEC להגיע לכ 80% המפגש. HBMEC אמור לשמש בין קטע 1 ו 15 כדי למנוע אובדן של מאפיינים פיסיולוגיים.
  3. קציר HBMEC.
    1. כן Accutase פתרון על ידי ערבוב Accutase (1x) עם PBS ביחס של 1: 1. שמור Accutase פתרון ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עד לשימוש נוסף.
    2. העבר בינוני ECM-b מבקבוק תרבות תא צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. לשטוף HBMEC על ידי הוספת 5 מ"ל PBS לתחתית הבקבוק תרבית תאים. לשאוב PBS וחוזר על שלב הכביסה פעמים נוספות.
    3. להוסיף מ"ל 2 מחומם מראש Accutase פתרון. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. לאחר מכן, HBMEC מחדש תלוי בחוזקה על ידי קשה על בקבוק תרבית תאים מספר פעמים. ניתוק תא נשלט באמצעות מיקרוסקופ
    4. ECM-ב-בינוני נשמרו קודם צינור 15 מ"ל מתווסף בחזרה את הבקבוק תרבית תאים בהקדם HBMEC להתחיל לנתק. יש לשטוף את החלק התחתון של הבקבוק שוב ושוב עד ביותר HBMEC הםמושעה מחדש.
    5. מעבירים את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגה 15 מ"ל. צנטריפוגה XG 300 10 דקות בטמפרטורת החדר. בטל supernatant מחדש להשעות תאים 1 מ"ל בינוני ECM-B. ספירת תאים לדלל את ההשעיה התא כדי להשיג ריכוז סופי של 3 x 10 5 HBMEC לכל מדיום ECM-b מ"ל.

2. הכנת התא מוסיף תרבות

  1. ציפוי של מוסיף תרבית תאים
    הערה חשובה: אל תיגע הממברנה של מוסיף תרבית תאים.
    1. הוספת 100 μL פתרון פיברונקטין (ראה 1.1.1) לכל כנס תרבית תאים (איור 1 א) ו אחד טובה של צלחת 96-היטב שטוחה תחתונה (שליטה אופטית היטב). דגירה של 3 שעות לפחות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר פתרון פיברונקטין הדגירה לשאוב.
    2. הוספת 100 μL HBMEC השעיה לבית מוסיף תרבית תאי השליטה האופטית היטב. להוסיף 600 μl בינוני ECM-B לתא התחתון של התאמוסיף תרבות. הדגירה של 3 - 4 ימים 37 ° C / 5% CO 2 עד שלמות מחסום (1B איור) הוא הגיע, לבדוק צמיחת תאים על ידי הערכה מיקרוסקופית של HBMEC בבקרה האופטית היטב. הערה: צמיחת תאים מעבר ארבעה ימים אינה מומלצת.
    3. אופציונלי: כדי לחקות את התנאים דלקתיות לשאוב את המדיום מן המגירה התחתונה ולהחליפו בינוני ECM-B בתוספת 500 U / mL IFN-γ / TNF-α 24 שעות לפני assay את ההגירה.

3. בקרת איכות עם כחול אוונס ביום של Assay גלגול נשמות

  1. הכנת פתרון כחול אוונס
    1. כדי להכין PBS / B27 פתרון תערובת 10 מ"ל PBS עם 200 μl תוסף B27 באמצעות צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. לדלל פתרון מניות כחול אוונס (20 מ"ג / מ"ל ​​PBS) 1: 1000 עם PBS / B27.
  2. assay חדירות הכחולה אוונס
    1. לשאוב את המדיום מן המגירה התחתונה ואחריו התא העליוןשל כנס תרבות תא אחד המכיל בשכבת HBMEC ומחוברת. להוסיף 100 פתרון כחול μL אוונס אל הכנס תרבית תאים.
    2. הוספת 600 μL PBS / B27 לתא התחתון דגירה במשך 60 דקות ב 37 ° C / 5% CO 2. מוציאים בזהירות את הכנס תרבית תאים באמצעות מלקחיים.
  3. מדידה כחולה אוונס
    1. הסר PBS / B27 מן המגירה התחתונה ולהעביר 100 μL בכל לשתי בארות של polystyrol שחור 96-גם צלחת תחתית שטוחה. הכנס צלחת בקורא צלחת פרו טקאן Infinite M200 ולקבוע z-מיקום אופטימלי.
    2. עירור מדוד של הגדרות בהתאמה באמצעות כחול אוונס (למשל: עירור: 620 ננומטר, פליטת: 680 ננומטר, רוחב פס עירור: 9 ננומטר, רוחב פס הפליטה: 20 ננומטר, שיפור 175x, 25 הבזקים, זמן של אינטגרציה: 20 מיקרו-שניות).
    3. כדי לקבוע פונקציות מחסום HBMEC להשוות רכשה נתונים כדי עקומת סטנדרט המתאר חלחול כחול אוונס ברחבי HBMEC בנקודות זמן שונות לאחר זרעתאי ing (1B איור, מימין).

4. Assay הגירה

  1. הכנת תאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC).
    1. להוסיף 10 מ"ל RPMI לתוך צינור 15 מ"ל צנטריפוגה ולהוסיף 200 תוספת μL B27. ספירת תאי PBMC צנטריפוגות ב XG 300 5 דק '. Re- להשעות PBMC לריכוז סופי של 5 x 10 6 תאים / מ"ל RPMI / B27.
  2. הגדרה של assay ההגירה
    1. לשאוב בינוני מהתא הנמוך ואחריו התא העליון של מוסיף תרבית תאים המכילים monolayers HBMEC ומחוברות (איור 1 א). לפי התורם להוסיף 100 ההשעיה μL PBMC כל אל מוסיף תרבית תאים וגם אחד טוב של צלחת 24-היטב לכל (בשליטה במבחנה).
    2. הוספת 600 μL RPMI / B27 לתא התחתון של מוסיף תרבית תאים 500 μL אל PBMC הבקרה במבחנה דגירה 6 שעות ב 37 ° C / 5% CO 2.
    3. קציר שהועבר PBMC
      1. קח את כנס תרבית תאים באמצעות מלקחיים ובזהירות לשטוף תחתון עם 400 μL PBS בלי לגעת הממברנה. מחק את כנס תרבית תאים.
      2. להוסיף 20 μL זרימת ספירת fluorospheres (כ 1000 חרוזים / μL) אל המגירה התחתונה של תרבית תאים להכניס כמו גם לשליטה במבחנה ומערבבים היטב. העברת 1 מ"ל של וכתוצאה ההשעיה PBMC לזרום cytometry צינורות.

    5. Cytometry זרימה

    1. הכנת דוגמאות
      1. צנטריפוגה PBMC XG 300 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. כן פתרון נוגדן ידי הוספת נוגדני מצומדות fluorochrome כדי 100 μL cytometry זרימת החיץ (PBS / 1% BSA / 2 מ"מ EDTA) לדגימה. לקבלת התוצאות המוצגות להלן 1 μL CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 μL CD56-PC7, 1 μL CD8-A700, ו 1 μL CD16-A750 שימשו לדגימה.
      3. Re-להשעות PBMC ב 100 μL של פתרון נוגדן דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C.
      4. הוספת 250 μL cytometry זרימה חיץ צנטריפוגות XG 300 5 דק '.
    2. רכישת המדגם
      1. Re- להשעות PBMC בכמות הנדרשת (משתנה בהתאם cytometer זרימה בשימוש) של זרימת cytometry חיץ.
      2. רוכשת PBMC צבעונית באמצעות cytometer זרימה עם גלאי אקטיבי בין 525 ו 700 ננומטר אורך גל לזהות fluorospheres זרימת הספירה (עירור 488 ננומטר, פליטת 525 - 700 ננומטר).
        (השלבים הבאים הם דוגמא אם זרימת Gallios cytometer המופעל באמצעות תוכנת Kaluza G משמשת:. (1) הפעל את המחשב (2) כאשר מערכת ההפעלה נטענת במלואו, להתחיל cytometer הזרים על ידי לחיצה על "cytometer על" כפתור . (3) טען את פרוטוקול רכישת בהתאמה ידי לחיצה על כפתור "פרוטוקול פתוח". (4) בחר את הפרוטוקול נדרש ובחר "לפתוח". (5) שכפל את הפרוטוקול עבור כל דגימה על ידי לחיצה עם ימיןעכבר כפתור על הפרוטוקול גלוי הקרוסלה הווירטואלית בלחיצה שמאלה על המגרש "כפול". (6) סמן כל דגימה ברשימה המדגמת. (7) העביר דגימות העמדות המצוינות של הקרוסלה ולהתחיל הרכישה.)
    3. ניתוח מדגם
      1. זרם פתוח וכתוצאה cytometry נתונים באמצעות התוכנה המתאימה. קביעת מספר תת-האוכלוסיות של ריבית transmigrated PBMC כמו גם תאי מבארות מלאות במבחנה ב וזרימת fluorospheres לספור באמצעות תוכנת ניתוח בהתאמה.
        (דוגמה לאסטרטגיה gating ניתנת בחלק התוצאות (איור 1 C: כדי לנתח גלגול תת NK תאים, בחר תחילה הלימפוציטים ערוץ פיזור ולצדדים (SSC) מול העלילה ערוץ פיזור קדימה (FSC) לימפוציטים הם. אז מוצג CD3 לעומת העלילה CD56 ו CD56 + CD3 -. תאי NK נבחרים כדי להבחין בין תת-תאי NK, תאי NK מוצגיםעלילה לעומת CD16 CD56 ו CD16 בהיר CD56 לעמעם / - כמו גם CD16 עמום CD56 + תאי NK נבחרים. בנוסף, fluorospheres ספירת זרימה נבחרו מתוך חלקת FSC מול SSC ובהמשך יוצג חלקת ערוץ עם פליטה בין 525 ו 700 ננומטר לעומת הזמן כדי לקבוע את מספרם.)
      2. כדי לחשב את מספר התאים הכולל של כל דגימה, לנרמל למספר המזוהה של תאים באמצעות fluorospheres ספירת זרימה:
        משוואה
      3. קביעת אחוז התאים נדדו כמו יחס בין תאים הכולל יועברו, תאים הכוללים בבקרה חוץ הגופייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות נציג מראה גלגול NK-התא תת T תאים בעזרת מודל מחסום הדם-מוח אנושי (איור 1 א) מוצגים. היושרה של monolayer HBMEC תוקף של הכתמה של המולקולה בצומת דוק ZO-1, התנגדות חשמלית Transendothelial (TEER) מדידות, וכן חלחול הכחול אוונס (איור 1B). בעקבות 3 - 4 ימי התרבות HBMEC הביע מולקולת הצומת ההדוקה ZO-1 (איור 1B, משמאל). יתר על כן, HBMEC גדל ב monolayers מפגין התנגדות חשמלית Transendothelial (באמצע 1B איור) וכן חלחול מופחת עבור אוונס כחול (איור 1B, מימין). Monolayers HBMEC שימשו ללמוד בגלגול תאי NK כולל CD16 בהיר CD56 לעמעם / - ו CD56 לעמעם תת CD16 + NK תאים ותאי T כולל CD4 + ו- CD8 + T תאים כשתי לשעברamples (איור 1D + E, בהתאמה). אחוז התאים נדדו חושבה בהתבסס על ספירת תאי מתקבל על ידי cytometry זרימה fluorospheres ספירת זרימה מנורמל באמצעות בקרה פנימית (איור 1C). בשכבה HBMEC היה מגורה עם IFN-γ ו 24h TNF-α לפני את assay לחקות מצבים דלקתיים. גירוי ציטוקינים הביא הגירה מוגברת של כל אוכלוסיות לימפוציטים ניתחו. זה עשוי להיות בשל ביטוי מוגבר של מולקולות הדבקות כולל ICAM-1 (מידע לא מוצג). CD16 הבהיר CD56 לעמעם / - תאי NK הציג יכולת נדידה גבוהה בהשוואת CD56 שלהם לעמעם CD16 + NK פני שני unstimulated (10.88% לעומת 0.86%) ו- IFN-γγ / TNF-α המגורה (18.22% לעומת 2.94%) HBMEC (איור 1D). עם זאת, הגידול היחסי של גלגול כתוצאה דלקת היה גבוה עבור CD56 לעמעם CD16 + לעומת + 167% עבור CD16 בהיר CD56 לעמעם / -). תוצאות אלו לחקות את התצפיות in vivo כי CD16 בהיר CD56 לעמעם / - תאי NK מועשרים בתא intrathecal. לפיכך, מודל מחסום דם-המוח שנראה מתאים לנתח עקרונות בסיסיים של diapedesis תאים החיסוניים של אוכלוסיות לימפוציטים נדירות אל CNS 21. לבסוף, את קיבולת transmigratory של CD4 ו- CD8 T-cell תת מוצג (איור 1E).

איור 1
איור 1: הגירה דיפרנציאל של קבוצות משנה NK תאים ברחבי Uninflamed ודלקתי HBMEC monolayers. א תמונה של מוסיף Transwell (משמאל) המחשה של הגדרת הניסוי (מימין). אימות B. של פונקציות מחסום HBMEC. שמאל: מכתים immunohistochemical של mol צומת ההדוקהecule ZO-1 באמצעות אנטי-אנושי ZO-1 (Abcam, 1: 200) ארנב עז נגד ארנב IgG-Cy3 (1: 300) על HBMEC טיפח במשך 3 ימים. מרכז: ההתנגדות החשמלית Transendothelial (TEER) של HBMEC בין יום 2 ויום 4 הטיפוח. מימין: עקומת תקן חלחול אוונס כחול עבור HBMEC עם ( "דלקת", אדום) או בלי ( "uninflamed", שחור) גירוי עם 500 U / mL IFN-γ ו- TNF-α עבור 24 שעות. מבחני גלגול מבוצעות 72 - 96 שעות לאחר זריעה של HBMEC (חץ שחור). לִספִירַת הַנוֹצרִים. PBMC נגזר 16 אנשים בריאים נחשף מבחני הגירה כמתואר בסעיף בפרוטוקול. 24 שעות לפני assay, מחצית מוסיף תרבית תאים היו מגורה עם 500 IU / mL IFN-γ ו-α TNF. תאי transmigrated נבצרו ונותחו על ידי cytometry זרימה. תוצאות נציג C. עבור PBMC נגזרת משליטתה במבחנה היטב (למעלה) ואחרי ההגירה ברחבי uninflamed HBMEC (התחתונה). cel NK ls היה מגודר מן לימפוציטים ליום CD3 - CD56 + תאים נוספים מכובדים לתוך CD16 הבהיר CD56 לעמעם / - ( "CD56 בהיר ") ו CD56 העמום CD16 + (" CD56 לעמעם") תת NK-תא. fluorospheres ספירת Flow ( "חרוזים") היה מגודר מבוסס על FSC / מאפייני SSC ומספרם נקבע בתוך FL3 לעומת עלילת זמן. חישובים למופת כדי לקבוע את אחוז בהיר CD56 שהועברו ואת CD56 עמום תאי NK מוצגים בצד ימין. ד אחוז תאי NK היגרו כמו גם CD56 בהיר CD56 עמום תת NK-תא, וא באחוז התאים נדדו T כולל CD4 + ו- CD8 + תת T-cell הבאים גלגול ברחבי uninflamed (שחור) או דלקת (אדום) HBMEC מתואר כממוצע ± SEM. P-ערכים חושבו על ידי מבחן t-תלמיד זיווג; ** p <0.01, *** p <0.001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מציגים טכניקה לחקור גלגול לימפוציטים פני מחסום דם-המוח האנושי. בניתוח חוץ גופית של הגירה לימפוציטים אל CNS חשוב ללמוד תהליכים בסיסיים של extravasation הלימפוציטים, שינויים מחלות הקשורות פוטנציאל, גישות טיפוליות חדשות.

שינויים אחדים של המודל מחסום הדם-מוח אפשריים. לדוגמא, תאים מהתא העליון יכולים להיות מנותחים לחקור את ההרכב של אוכלוסיית התאים שאינם שהועברה. יתר על כן, הטיפול בשכבה HBMEC עם IFN-γ ו- TNF-α 24 שעות לפני assay יכול לשמש כדי לחקות מחסום הדם-מוח מוסת על מנת לחקור את ההשפעה של הפרעות במערכת העצבים המרכזית דלקתית 21, 25. בדומה לכך, הטיפול של HBMEC או לימפוציטים עם חומרים אחרים מאפשר לחקור את השפעתם על extravasation הלימפוציטים (למשל שלהםהשפעה על מולקולות דבקות) 30, 31. המעורבות של מולקולות הדבקה מסוימות ניתן ללמוד באמצעות נוגדנים חוסמים עבור integrins או הליגנדים שלהם 32. יתר על כן, הגדרת הניסוי המוצג כאן מאפשר ניתוח של ההשפעות chemotactic מן וכמוקינים או supernatants נגזר האסטרוציטים או תאים אחרים 33, 34. החלפת HBMEC עם תאי האפיתל שמופק מהמוח האנושי העיקרי מתרחב הספקטרום של סביבת הניסוי לצורך הבדיקה של המכשול נוזל המוח והשדרה-דם 15. HBMEC לא צריך להיות מוחלף עם תאי אנדותל הונצחו או תאים שמקורם איברים אחרים כדי לשמור על-סגולי CNS של המודל. עם זאת, תאי האנדותל שמופק מהמוח ממינים אחרים עשויים לשמש כדי לנתח גלגול של חיות בהתאמה 35. בנוסף, חומצה רטינואית או hydr ocortisone תואר להגדיל פונקציות מחסום ועלול ובכך להיות מועסק 36, 37. במקרה של מספרים סלולריים מוגבלים בסכום של תאים נתונים assay עשוי להיות מופחת, כי המודל שלנו מספק שיעורי החלמה ליניארי בין 2 x 10 5 ו 1 x 10 6 PBMC (מידע לא מוצג). כדי לנתח אוכלוסיות תאים נדירות הבאים בגלגול זה עשוי להיות נחוץ לתאי ברכה מכמה בארות כדי להשיג מספיק תאי דרושי cytometry זרימה. לבסוף, ההתקנה הניסיונית שלנו יכולה לשמש גם כדי לחקור מתן התרופה לתוך CNS 38. גודל נקבובי של 3 מיקרומטר משמש בדרך כלל כדי לאפשר גלגול הלימפוציטים, ואילו גודל נקבובי של 0.4 מיקרומטר מונע גלגול לימפוציטים, אך מאפשר ללמוד משלוח סמים 39, 40, 41, 42.

s = "jove_content"> למרות הבקשות השונות של הגדרת הניסוי המתוארת כאן, כמה נקודות צריכות לזכור כדי להבטיח תוצאות משמעותיות. היושרה של הקרום הנקבובי כמו גם בשכבת HBMEC היא קריטית. לכן, זה חובה כדי למנוע נזק פיזי של הממברנה, למשל עם טיפים pipet. תוספת של נוזלים או השעית תא אל החלק העליון של כנס תרבית תאים צריכה להתבצע ללא מגע ישיר. טיפות עלולות להימחק מעל בגבול של כנס תרבית תאים. מיקום אופקי של קצה pipet מבטיח הגנה של הממברנה, כאשר הממברנה abluminal היא שטפה בסוף של assay הגירה. האיכות בשכבת HBMEC יכולה להיות מנותחת על ידי הערכה מיקרוסקופית של מפגש וכן חלחול הכחול אוונס כפי שמודגמת להערכת שלמות מחסום דם-מוח בניסויים מכרסם 43. צנטריפוגה של HBMEC לעבר כוחות ושימוש g נמוכים של מעברים מוקדם (כלומר

למרות הקפדה על הפרוטוקול המתואר כאן מבטיחה תוצאות משמעותיות ודיר, טכניקה זו יש מספר מגבלות. קודם כל, in vivo את מחסום הדם-מוח נוצר על ידי מספר תאים, אשר הדדי באופנים שונים ולחזק את תפקוד המחסום ידי המשפיעים על היווצרות של צמתים הדוקים 1. לכן, למרות מודל מחסום דם-מוח זה הוא קירוב טוב של מצב in vivo, היבטים חשובים חסרים. בנוסף, extravasation לימפוציטים לתוך CNS דרך מחסום הדם-מוח הוא תהליך רב שלבי. בעוד כל צעד יחיד יכול להיחקר בנפרד, הטכניקה המוצגת כאן אינה מספקת מידע על מיתהליך של extravasation le תחת השפעת כוחות גזירה 2, 44, 45, 46. לבסוף, ניתוח של תאים הגרו PBMC עלול להיות מאתגר, לפי התדירות של התאים של עניין, כי בדרך כלל תדרים חד ספרתית בלבד של תאים מתגלגלים. לכן, הפרדה בין האוכלוסיות של הריבית הקודם assay או pooling של תאים היגרו ברחבי מוסיף תרבית תאים מרובים עשוי להיות נחוץ. מודלים אחרים לניתוח הגירה לויקוציטים לתוך CNS לכסות כמה מן ההיבטים חסרים במודל שלנו. Co-תרבות עם האסטרוציטים, pericytes, ו / או נוירונים משמשים לחקות את המורכבות של מחסום הדם-מוח טוב יותר 47. מודלים לרבות כוחות הגזירה כגון DIV-BBB לשקף יותר את התנאים הפיסיולוגיים, ובכך, לאפשר ניתוח מתוחכם יותר של הלימפוציטים diapedesis 48. לסיכום, אנו מציגים טכניקה נגישה מתאים החקירה של diapedesis הלימפוציטים איכותיים וכמותיים פני מחסום דם-מוח אנושי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 14190-094 without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL Sigma F1141-5MG from bovine plasma
T-25 cell culture flask Greiner BioOne 690160
HBMEC ScienCell 1000
Pelobiotech PB-H-6023
Accutase Sigma A6964-100ML
ECM-b ScienCell 1001-b
FBS ScienCell 1001-b
Penicillin/Streptomycin ScienCell 1001-b
Endothelial cell growth supplement ScienCell 1001-b
Transwell Corning 3472 clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate Corning 3596
Evans blue Sigma E2129-10G stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27 Gibco 17504-044 50x concentrated
Infinite M200Pro Tecan
96-well black flat bottom plate Greiner BioOne 675086
48-well plate Corning 3526
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Flow Count Fluorospheres Beckman Coulter 7547053
Na-EDTA Sigma E5134
BSA Sigma A2153
Gallios 10-color flow cytometer Beckman Coulter
Kaluza 1.5a Beckman Coulter
TNF-α Peprotech 300-01A
IFN-γ Peprotech 300-02
CD3-PerCP/Cy5.5 Biolegend 300430 clone UCHT1
CD56-PC7 Beckman Coulter A21692 clone N901
CD16-A750 Beckman Coulter A66330 clone 3G8
CD4-FITC Biolegend 300506 clone RPA-T4
CD8-A700 Beckman Coulter A66332 clone B9.11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24 (2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).

Tags

אימונולוגיה גיליון 122 extravasation הלימפוציטים הגירה לימפוציטים ביות CNS מחסום דם-מוח HBMEC האנדותל
ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., … More

Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter