Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.
Lymfocytt uttredelse inn i sentralnervesystemet (CNS) er kritisk for immunovervåkning. Sykdomsrelaterte endringer av lymfocytt ekstravasasjon kan resultere i patofysiologiske forandringer i CNS. Således er undersøkelse av lymfocyttmigrering til CNS viktig å forstå inflammatoriske CNS-sykdommer og å utvikle nye tilnærmingsmåter terapi. Her presenterer vi en in vitro modell av det menneskelig blod-hjernebarrieren for å studere lymfocytt ekstravasasjon. Hjernen mikrovaskulære endotelceller (HBMEC) er confluently dyrket på en porøs polyetylentereftalat transwell sette inn for å etterligne endotelet i blod-hjerne-barrieren. Barrierefunksjonen blir bekreftet ved zonula okkludens immunhistokjemi, transendotelial elektrisk motstand (teer) målinger samt analyse av Evans Blue gjennomtrengning. Denne modellen tillater undersøkelse av diapedese av sjeldne lymfocyttundergrupper slik som CD56 CD16 lys dempe / – NK-celler. Furthermmalm, effekten av andre celler, cytokiner og kjemokiner, sykdomsrelaterte endringer og forskjellige behandlingsregimer på trekk kapasiteten av lymfocytter kan studeres. Til slutt, kan virkningen av inflammatoriske stimuli, så vel som forskjellige behandlingsregimer på den endoteliske barrieren skal analyseres.
Lymfocyttmigrering fra blodet inn i vevet er avgjørende for immunologiske overvåkning. En sekvens av spesielle molekylære interaksjoner sørger for setespesifikk uttredelse inn i tynntarmen, hud, lymfeknuter, i sentralnervesystemet (CNS), og andre vev 1. Endringer i lymfocyttmigrering er involvert i patofysiologien av en rekke store spredningen sykdommer 2. Migrering inn i den immun-privilegerte CNS er strengt regulert og følgelig endringer av denne prosess er involvert i CNS-relaterte sykdommer som encefalomyelitt 3, neuromyelitis optica, slag, og multippel sklerose (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Derfor er det viktig å studere lymfocytt bloduttredelse å bedre forstå sykdom patofysiologi og å utvikle verktøy for en landgjenvinning av sykdomsbyrde 8, 9, 10, 11, 12.
Lymfocytter migrere inn i CNS via forskjellige ruter. Ekstravasering gjennom postkapillare venuler i det subarachnoide plass via blodet-cerebrospinalvæsken barrieren innenfor choroid plexus og over blod-hjernebarrieren er blitt beskrevet 1, 13, 14, 15. Migrasjon over blod-hjerne barrieren er utført av interaksjon av lymfocytter med endotelceller 14. I motsetning til endotelceller i periferien, endotelceller i CNS uttrykker store mengder av stramme koblingsmolekyler, for derved å strengt begrense mengden av celler og proteiner som er i stand til å krysse blod-hjerne-barrierenlass = "ekstern referanse"> 16. Inflammasjon resulterer i løsning av tette forbindelsene og induserer ekspresjon av adhesjonsmolekyler; således forsterke lymfocyttmigrering til CNS 1, 17, 18.
Ekstravasering gjennom blod-hjerne-barrieren er en flertrinnsprosess. Lymfocytter tjore til endotelcellene og deretter rulle langs den endotelet i en prosess som først og fremst formidlet av selektiner 1, 15. Deretter interaksjoner mellom chemokiner utskilt av endotelet og de respektive kjemokin reseptorer uttrykt på lymfocytter indusere konformasjonsendringer av integriner og dermed fremme fast adhesjon til endotelceller 1. Til slutt, lymfocytter enten gjennomsøking langs den endoteliske barrieren mot blodstrømmen før transmigrating inn i perivaskulære plass, eller stall umiddelbart og direkte Transmigrate på stedet av fast adhesjon 1, 19, 20. Alle disse trinnene å lymfocytt ekstravasasjon kan analyseres in vitro ved anvendelse av forskjellige teknikker 21. Time-lapse video mikroskopi brukes til å studere innledende tethering og rullende 15. Adhesjonsassayene gi detaljert informasjon om firmaet arrest til endotelbarrierer 22. Sjele assays som demonstrert her tillate analyse av immun-celle-transmigrasjon 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.
Ved å bruke den humane in vitro blod-hjerne barrieren modell, kunne vi nylig viser at en høyere MIGRAtory kapasitet av CD56 CD16 lys dempe / – NK-celler i forhold til deres CD56 dim CD16 + motstykker ble reflektert ved en overvekt av denne NK-celleundergruppen i det intratekale rommet 21. Dermed synes vår eksperimentelle oppsett for å være egnet til å etterligne in vivo situasjonen.
Her presenterer vi en teknikk for å undersøke sjele av lymfocytter over menneskelig blod-hjerne barrieren. In vitro-analyse av lymfocyttmigrering til CNS er viktig å undersøke grunnleggende prosesser for lymfocytt ekstravasasjon, potensielle sykdomsrelaterte endringer, og nye terapeutiske tilnærminger.
Flere modifikasjoner av blod-hjerne-barrieren modell er mulig. For eksempel kan celler fra det øvre kammeret bli analysert for å undersøke sammensetningen av den ikke-overfør…
The authors have nothing to disclose.
This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 “Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease” (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).
PBS | Gibco | 14190-094 | without CaCl2 or MgCl2 |
Fibronectin 1mg/mL | Sigma | F1141-5MG | from bovine plasma |
T-25 cell culture flask | Greiner BioOne | 690160 | |
HBMEC | ScienCell | 1000 | |
Pelobiotech | PB-H-6023 | ||
Accutase | Sigma | A6964-100ML | |
ECM-b | ScienCell | 1001-b | |
FBS | ScienCell | 1001-b | |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 1001-b | |
Endothelial cell growth supplement | ScienCell | 1001-b | |
Transwell | Corning | 3472 | clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size |
96-well flat bottom plate | Corning | 3596 | |
Evans blue | Sigma | E2129-10G | stock solution: 1 g/50 mL PBS |
B27 | Gibco | 17504-044 | 50x concentrated |
Infinite M200Pro | Tecan | ||
96-well black flat bottom plate | Greiner BioOne | 675086 | |
48-well plate | Corning | 3526 | |
RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
Flow Count Fluorospheres | Beckman Coulter | 7547053 | |
Na-EDTA | Sigma | E5134 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
Gallios 10-color flow cytometer | Beckman Coulter | ||
Kaluza 1.5a | Beckman Coulter | ||
TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
CD3-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 300430 | clone UCHT1 |
CD56-PC7 | Beckman Coulter | A21692 | clone N901 |
CD16-A750 | Beckman Coulter | A66330 | clone 3G8 |
CD4-FITC | Biolegend | 300506 | clone RPA-T4 |
CD8-A700 | Beckman Coulter | A66332 | clone B9.11 |