Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em> In Vitro</em> Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Summary

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Abstract

Lymfocyt extravasering in i det centrala nervsystemet (CNS) är kritisk för immunövervakning. Sjukdomsrelaterade förändringar av lymfocyter extravasering kan resultera i patofysiologiska förändringar i CNS. Sålunda, är undersökning av lymfocyt migration in CNS viktigt att förstå inflammatoriska CNS-sjukdomar och att utveckla nya terapi tillvägagångssätt. Här presenterar vi en modell in vitro av blod-hjärnbarriären för att studera lymfocyter extravasering. Mänskliga hjärnan mikrovaskulära endotelceller (HBMEC) är confluently odlas på en porös polyetylentereftalat Transwell infoga att härma endotelet av blod-hjärnbarriären. Barriärfunktionen är validerat av zonula occludens immunohistokemi, transendotelial elektrisk resistans (TEER) mätningar samt analys av Evans Blue permeation. Denna modell möjliggör undersökning av diapedes av sällsynta lymfocytundergrupper såsom CD56 ^ljusa CD16 ^{dim / –} NK-celler. Furthermmalm, effekterna av andra celler, cytokiner och kemokiner, sjukdomsrelaterade ändringar och distinkta behandlingsregimer på migrationskapacitet av lymfocyter kan studeras. Slutligen kan effekten av inflammatoriska stimuli samt olika behandlingsregimer på endothelial barriären analyseras.

Introduction

Lymfocyter migration från blodet till vävnader är avgörande för immunövervakning. En sekvens av specifika molekylära interaktioner säkerställer lägesspecifik extravasering in i tunntarmen, hud, lymfkörtlar, det centrala nervsystemet (CNS), och andra vävnader ^1. Förändringar i lymfocyter migration är inblandade i patofysiologin av ett antal breda sprida sjukdomar ^2. Migrering in immun-privilegierade CNS är hårt reglerad och följaktligen förändringar av denna process är involverade i CNS-relaterade sjukdomar som encefalomyelit ^3, neuromyelitis optica, stroke och multipel skleros (MS) ^{2, 4, 5, 6, 7.} Därför är det viktigt att studera lymfocyter extravasering att bättre förstå sjukdomen patofysiologi och att utveckla verktyg för en melioration sjukdomsbörda ^{8, 9, 10, 11, 12.}

Lymfocyter vandrar in i CNS via olika vägar. Extravasation genom postkapillära venoler i det subaraknoidala utrymmet via blod-cerebrospinalvätska barriär inom de choroid plexus och över blod-hjärnbarriären har beskrivits ^{1, 13, 14, 15.} Migrering genom blod-hjärnbarriären utföres genom interaktion av lymfocyter med endotelceller ^14. I motsats till endotelceller i periferin, endotelceller i CNS uttrycker höga mängder av Täta fogar molekyler, vari strikt begränsa mängden av celler och proteiner som kan korsa blod-hjärnbarriärenlass = "xref"> 16. Inflammation resulterar i uppluckring av täta förbindelser och inducerar expression av adhesionsmolekyler; sålunda, förbättra lymfocyt migration in CNS ^{1, 17, 18.}

Extravasering via blod-hjärnbarriären är en flerstegsprocess. Lymfocyter tjuder till endotelcellerna och sedan rulla längs endotelet i en process huvudsakligen förmedlas av selektiner ^{1, 15.} Därefter, interaktioner mellan kemokiner som utsöndras av endotelet och respektive kemokinreceptorer som uttrycks på lymfocyter inducerar konformationsförändringar av integriner, därigenom främja fast adhesion till endotelcellerna ^1. Slutligen, lymfocyter antingen krypa längs den endoteliala barriären mot blodflödet innan transmigrating in i perivaskulära utrymmet, eller stall omedelbart och direkt transmigrate vid stället för fast adhesion ^{1, 19, 20.} Alla dessa steg av lymfocyt extravasering kan analyseras in vitro med användning distinkta tekniker ^21. Time-lapse video mikroskopi används för att studera den initiala tjudra och rullande ^15. Adhesionsanalyser ger detaljerad information om fast gripande att endotelceller hinder ^22. Transmigration analyser som visat här möjliggör analys av immuncellstrans ^{21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.}

Använda människa in vitro blodhjärnbarriären modell kunde vi nyligen visar att en högre MIGRAtory kapacitet på CD56 ^ljusa CD16 ^{dim / –} NK-celler jämfört med deras CD56 ^dim CD16 ⁺ motsvarigheter återspeglades av en dominans av denna NK-cellunderuppsättning i det intratekala utrymmet ^21. Således verkar vår experimentuppställning för att vara lämplig att efterlikna in vivo situationen.

Protocol

1. Cell Culture of Human Brain mikrovaskulära endotelceller (HBMEC) Beläggning av cellodlingsflaskor Att förbereda fibronektin lösningen, tillsätt 10 ml PBS till en 15 ml centrifugrör. Tillsätt 150 mikroliter fibronektin och blanda väl. För att täcka botten en T-25 cellkultur kolv tillsätt 2 ml av fibronektinlösningen. Inkubera cellkulturflaska i minst 3 timmar vid 37 ° C i inkubatorn. Fibronektinbelagda kolvar kan lagras under 2 veckor vid 37 ° C / 5% CO2. </o…

Representative Results

Representativa resultat som visar transmigration av NK-cell och T-cell-underuppsättningar med användning av humant blod-hjärnbarriären modell (Figur 1A) visas. Integriteten hos HBMEC monoskiktet validerades genom färgning av den täta förbindningen molekylen ZO-1, transendotelial elektrisk resistans (TEER) mätningar, och Evans Blue trängning (Figur 1B). Följande 3 – 4 dagar kultur HBMEC uttryckte den täta förbindningen molekylen ZO-1 (…

Discussion

Här presenterar vi en teknik för att undersöka trans av lymfocyter över blod-hjärnbarriären. In vitro analys av lymfocyter migration till CNS är viktigt att studera grundläggande processer av lymfocyter extravasering potentiella sjukdomsrelaterade förändringar och nya behandlingsmetoder.

Flera modifieringar av blod-hjärnbarriären modell är möjliga. Till exempel, kan celler från det övre rummet analyseras för att undersöka sammansättningen av den icke-migrerade cel…

Materials

PBS	Gibco	14190-094	without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1mg/mL	Sigma	F1141-5MG	from bovine plasma
T-25 cell culture flask	Greiner BioOne	690160
HBMEC	ScienCell	1000
	Pelobiotech	PB-H-6023
Accutase	Sigma	A6964-100ML
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Penicillin/Streptomycin	ScienCell	1001-b
Endothelial cell growth supplement	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size
96-well flat bottom plate	Corning	3596
Evans blue	Sigma	E2129-10G	stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27	Gibco	17504-044	50x concentrated
Infinite M200Pro	Tecan
96-well black flat bottom plate	Greiner BioOne	675086
48-well plate	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Flow Count Fluorospheres	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
Gallios 10-color flow cytometer	Beckman Coulter
Kaluza 1.5a	Beckman Coulter
TNF-α	Peprotech	300-01A
IFN-γ	Peprotech	300-02
CD3-PerCP/Cy5.5	Biolegend	300430	clone UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	clone N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	clone 3G8
CD4-FITC	Biolegend	300506	clone RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	clone B9.11