Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55397
Automatic Translation
1,2, 1
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

Summary

هنا، ونحن نقدم ل، منخفضة التكلفة سهلة، والوقت كفاءة بروتوكول لإصلاح أنسجة المخ كيميائيا الرئيسيات مع تثبيتي الأكرولين، مما يسمح للحفاظ على المدى الطويل والتي تتوافق مع ما قبل التضمين المناعية للانتقال المجهر الإلكتروني.

Abstract

على الرغم من كل التقدم التكنولوجي على مستوى المجهر الضوئي، لا يزال المجهر الإلكتروني الأداة الوحيدة في علم الأعصاب لدراسة وتوصيف تفاصيل التركيبية والشكلية من الخلايا العصبية، مثل الاتصالات متشابك. حفظ جيد للأنسجة المخ لالمجهر الإلكتروني يمكن الحصول عليها عن طريق أساليب البرد تثبيت صارمة، ولكن هذه التقنيات مكلفة نوعا ما، والحد من استخدام immunolabeling، وهو أمر حاسم لفهم التواصل بين الأنظمة العصبية التي تم تحديدها. وقد تم تطوير طرق تجميد استبدال السماح للمزيج من البرد التثبيت مع immunolabeling. ومع ذلك، فإن استنساخ هذه المقاربات المنهجية عادة ما تعتمد على الأجهزة تجميد مكلفة. وعلاوة على ذلك، وتحقيق نتائج موثوقة مع هذه التقنية هو جدا تستغرق وقتا طويلا وتحدي المهارات. وبالتالي، فإن الدماغ ثابتة كيميائيا التقليدية، لا سيما مع تثبيتي الأكرولين، يبقى طريقة فعالة وقت ومنخفضة التكلفة للجمع بين الإلكترونالمجهر مع المناعية. هنا، ونحن نقدم بروتوكول تجريبي موثوق باستخدام تثبيت الأكرولين الكيميائي الذي يؤدي إلى الحفاظ على أنسجة المخ الرئيسيات ومتوافق مع ما قبل التضمين المناعية ونقل الإلكترون الفحص المجهري.

Introduction

المجهر الضوئي، بما في ذلك متحد البؤر واثنين من الفوتون المجهري، وقد ثبت أن تكون أداة فعالة للدراسة في العمليات العصبية الجسم الحي، من بين أمور أخرى 1 و 2. على الرغم من أن القرار المكانية نموذجي على مستوى الضوء مجهرية (LM) ما يقرب من 200 نانومتر، والتقدم التكنولوجي الأخيرة باستخدام مصادر الضوء المختلفة، مثل الأشعة فوق البنفسجية المدقع وناعمة المجهر أشعة X، وأبرزها زيادة هذا القرار إلى ما يقرب من 10 القرار المكانية نانومتر 3 و 4 و 5. وتشمل التطورات التكنولوجية الأخرى في مجال التصوير الجمع بين التصوير بالرنين المغناطيسي مع الأنسجة وتوفر طريقة جديدة لقياس سمك غمد المايلين في الجسم الحي، والمعلمة التي كانت قابلة للقياس تقليديا فقط على مستوى الكترون مجهرية (EM) 6 و 7. Althouغ هذه التطورات على مستوى LM توفر أداة ممتازة لدراسة العمليات الحية، على عرض تفصيلي وتوصيف البنى، مثل الاتصالات متشابك، لا يمكن أن يتحقق إلا مع EM، الذي يقدم قرار يمكن أن تصل إلى 0.5 نانومتر. ومع ذلك، والمراقبة على مستوى EM تتطلب العينات أن القتلى وتغيير في بعض النواحي، مع المثبتات الكيميائية والعمليات الجفاف، من أجل الحفاظ على التهندس الخلوي. وهكذا، ودراسة العينات البيولوجية بدقة عالية يمكن أن يكون تحديا بسبب الأضرار الناجمة عن الإشعاع من شعاع الالكترون، وعلى النقيض منخفضة، والانحرافات الهيكلية من الأغشية، أو حتى وجود القطع الأثرية التي يمكن أن تحدث بعد الجفاف والايبوكسي تضمين 8 و 9 و 10.

الحفاظ على العينات في شكل الأصلي من أجل التحليل البنيوي لا يمكن أن يتحقق عن طريق استخدام "كرو EM الأقسام المزججة" أو CEMOVIS، نهج باجتزاء أنيشمل تجميد بسرعة وتضمينها العينة في الجليد الزجاجي، والنظر في أقسام تحت EM عند درجة حرارة المبردة 11 و 12. يسمح هذا الإجراء لفحص عينات حين أنها لا تزال صلبة والمائية بشكل كامل، وبالتالي القضاء على القطع الأثرية التي يسببها الجفاف العمليات 13. ومع ذلك، هذا الأسلوب ينطوي إضافية أجهزة لالبرد ultramicrotomy، وكذلك أجهزة إضافية على EM القياسية، وذلك للسماح هذه الملاحظة في درجات حرارة منخفضة جدا، والتي تولد تكاليف إضافية كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النهج CEMOVIS يحول دون استخدام تقنيات immunolabeling، منذ الأجسام المضادة وعادة ما يكون لتكون المحتضنة في RT. بدلا من ذلك، فمن الممكن الجمع بين تحليل التركيبية للإجراءات المناعى باستخدام نهج تجميد الاستبدال، يتم خلالها إذابة العينات الثابتة البرد ببطء بينما غمر في المواد الكيميائية البرد واقية وهي عشرأون جزءا لا يتجزأ من راتنجات المتخصصة، مثل Lowicryls. بعد تضمين immunolabeling يمكن بعد ذلك أجريت على هذه المواد (12). ومع ذلك، وتقنيات تجميد الإحلال والبرد تثبيت هي مضيعة للوقت. فهي تتطلب تركيب معدات إضافية ولا تزال تتطلب عينات أن تتعرض لالمذيبات العضوية وتثبيتي الكيميائية التي يمكن أن تغير التهندس الخلوي، على الرغم من استخدام درجة حرارة منخفضة 14 و 15. وبالتالي، على الرغم من كل التقدم التكنولوجي سواء على مستوى LM وEM، تثبيت الكيميائي للأنسجة المخ، وخاصة مع الأكرولين، لا تزال منخفضة التكلفة وفعالة وقت طريقة للجمع بين المناعية مع EM 16.

في العقود الماضية، كانت هناك العديد من المحاولات لإيجاد مزيج من الألدهيدات التي توفر أفضل الحفاظ على الأنسجة. قبل 1960s، وكان مثبت الكيميائية الوحيدة التي أعطت نتائج مقبولة للEM رباعي أكسيد الأوزميوم. ومع ذلك، رباعي أكسيد الأوزميوم عالية السمية ومكلفة، مما يحول دون استخدامه من خلال نظام الأوعية الدموية لإصلاح أجهزة مثل الدماغ. وقدم الأكرولين في أواخر 1950s باعتبارها وسيلة يمكن الاعتماد عليها للحيوان الحفاظ على النسيج مناسبة للمراقبة EM الهياكل الخلوية (17). انها تخترق الأنسجة أكثر عمقا ويتفاعل بسرعة أكثر من الألدهيدات أخرى عندما تستخدم لتثبيت عن طريق الغمر ويسمح الحفاظ جيد للمكونات حشوية، مع انكماش الحد الأدنى من الأنسجة (17). مثل هذه الميزة تعطي الأكرولين تثبيت ميزة واضحة على الألدهيدات أخرى عند استخدامها في أنسجة جديدة، من خلال السماح لتوطين أكثر دقة من الذين يعيشون مركبات جزيئية، مثل الإنزيمات والبروتينات الأخرى 18. في الواقع، تم التحقق من صحة ذلك من خلال سنوات وسيلة سهلة وفعالة ومنخفضة التكلفة لتثبيت التصور على مستوى EM في كثير من الأنواع، بما في ذلك البرمائيات والقوارض، كما stabili بكفاءةZES الببتيدات والبروتينات، تحتفظ استضداد ويوفر التركيب الدقيق سليمة نسبيا عندما تستخدم بالاقتران مع ألدهيد آخر تثبيتي 16 و 18 و 19 و 20 و 21. بروتوكولات لتثبيت الأكرولين في القوارض ومنذ ذلك الحين تم توحيدها واستخدامها على نطاق واسع، لا سيما من قبل مجموعة بيكيل، لتنفيذ immunolabeling المزدوج لEM 16، 22. وقد استخدمت مجموعات قليلة الأكرولين التثبيت في الأنسجة غير البشرية الرئيسيات الدماغ 23. ومع ذلك، على حد علمنا، هناك واحد فقط بروتوكول المنشورة التي تصف كفاءة التثبيت الكيميائية مع الأكرولين في الرئيسيات غير البشرية التي تتوافق مع EM immunolabeling 24.

في هذه المقالة، ونحن نقدم وسيلة سهلة وموثوق بها لإصلاح بكفاءة كيميائيا غير همهمة،على العقول الرئيسيات مع الأكرولين، والسماح لحفظ يحتمل أن تكون طويلة الأجل جنبا إلى جنب مع ما قبل التضمين immunolabeling وEM نقل الفحص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أخلاقيات الإعلان: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات من قبل COMITE دي حماية قصر Animaux DE L'جامعة لافال وقدمت وفقا للمجلس الكندي للرعاية الحيوان دليل لرعاية واستخدام حيوانات التجارب (إد 2). تم تحسين بروتوكول صفها هنا للحيوانات البالغة حوالي 800 غرام. ينبغي تعديل حجم تثبيتي وفقا لحجم الحيوان.

1. إعداد حلول لTranscardiac الإرواء

  1. إعداد 1 L من حل 50 ملي مخزنة فوسفات الصوديوم المالحة (PBS) وفقا للخطوات التالية. إعداد الحل في معظم 24 ساعة قبل التروية والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    1. قياس 800 مل من الماء المقطر في دورق 1 L. إضافة 5.87 غرام من ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم اللامائية (نا 2 هبو 4)، 1.20 غرام من أحادي فوسفات الصوديوم مونوهيدرات (ناه 2 PO 4 · H 2 O)، و 9 زمن كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم). يحرك المزيج حتى يذوب.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 بإضافة تدريجيا 5 N هيدروكسيد الصوديوم. إضافة الماء المقطر للوصول إلى الحجم الكلي لل1 L.
      تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم هو مركب كيميائي للتآكل. ارتداء المناسبة معدات الوقاية الشخصية (PPE؛ معطف المختبر، والقفازات، نظارات واقية، الخ).
  2. إعداد 2 لتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) وفقا للخطوات التالية. هذا الحل يجب أن يكون مستعدا 24 على الأكثر ساعة قبل الجراحة والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    1. قياس 1.5 لتر من الماء المقطر في دورق 2-L. إضافة 23.48 غرام من ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم اللامائية (نا 2 هبو 4) و4.80 غرام من أحادي فوسفات الصوديوم مونوهيدرات (ناه 2 PO 4 · H 2 O). يحرك المزيج حتى يذوب. إضافة الماء المقطر للوصول إلى الحجم الكلي لل2 L.
    2. الحرارة الحل تحت غطاء التنفيس حتى تصل درجة الحرارة الى ما يقرب من 45 - 55 درجة مئوية. لا تسخن إلى أكثر من 60 درجة مئوية.
    3. تدريجيا إضافة 80 غراما من PFA إلى حل ويحرك حتى يذوب تماما (حوالي 30-60 دقيقة). حافظ على مراقبة درجة الحرارة للحفاظ على أقل من 60 درجة مئوية.
      تنبيه: PFA متقلبة للغاية في شكل مسحوق لها. أنها شديدة السمية إذا كان في ملامسة العينين أو الجلد وغير الخطرة في حالة الاستنشاق أو الابتلاع. ارتداء معدات الوقاية الشخصية واستخدام بحذر تحت غطاء التنفيس.
    4. تبريد الحل وصولا الى 4 درجات مئوية والتصفية. تخزينها في 4 ° C.
  3. إعداد 1 L من 3٪ الأكرولين في 0.1 M الفوسفات العازلة (PB) وفقا للخطوات التالية. الحل PB ينبغي إعداد 24 على الأكثر ساعة قبل التروية.
    تنبيه: الأكرولين سامة للغاية إذا استنشق ويمكن ان تنتج الضرر المباشر. بل هو أيضا للتآكل وشديدة السمية إذا يمتص من خلال الجلد. ومن مسرطنة ومطفرة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة واستخدام تحت غطاء التنفيس.
    1. قياس 800 مل من الماء المقطر. إضافة 8.66 غرام من ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم اللامائية (نا 2 4) و5.38 غرام من أحادي فوسفات الصوديوم مونوهيدرات (ناه 2 PO 4 · H 2 O). يحرك حتى تذوب جميع الأملاح. إضافة الماء المقطر للوصول إلى الحجم الكلي لل1 L. الحفاظ على الحل في 4 درجات مئوية.
    2. قبل الجراحة، ونقل 900 مل من محلول PB إلى وعاء زجاجي 1 L وإضافة 30.94 مل من 97٪ محلول الأكرولين تحت غطاء التنفيس. إضافة حل PB للوصول إلى الحجم الكلي لل1 L ويقلب. تصفية حل والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية.

2. Transcardiac الإرواء وتشريح الدماغ

  1. حافظ على الحلول على الجليد أثناء إجراء العمليات الجراحية بأكمله. تحضير المضخة عن طريق وضع أنبوب في الحل الأول لاستخدامها (PBS و 50 ملم) وتحول المضخة حتى لا يبقى الهواء في خرطوم. لنضح transcardiac من قرد المكاك، واستخدام 21 G إبرة وتعيين تدفق في حوالي 80 مل / دقيقة.
  2. تخدير الحيوانات مع الحقن العضلي من مزيجتلح الكيتامين (20 ملغ / كلغ)، زيلازين (4 ملغ / كلغ)، وآسيبرومازين (0.5 ملغ / كلغ). الحفاظ على الحيوانات تحت الأيزوفلورين (3٪) التخدير.
  3. إرفاق أطرافه الحيوان إلى جدول التنفيس.
  4. مع مشرط، وإزالة الجلد حتى الإبطين. قطع عضلات البطن. استخدام مقص جراحي الثقيلة لقطع أضلاعه أفقيا عن طريق تجنب بعناية الأعضاء الحيوية.
  5. قطع الحجاب الحاجز مع مقص جراحي ورفع القفص الصدري لكشف القلب. مرة واحدة يتم قطع الحجاب الحاجز، والمضي قدما بسرعة، لأن القلب سيتوقف الضرب في غضون دقائق.
  6. إزالة التامور بشفرة مشرط وادخال الإبرة في البطين الأيسر. مع مشرط، وجعل بعناية الختان صغير إلى الأذين الأيمن. البدء سريعا في مضخة في 72 مل / دقيقة، وعقد الإبرة في المكان. إذا كان ذلك ممكنا، والميل الحيوان من أجل أن يكون رئيسها على مستوى أدنى من القلب.
    ملاحظة: يجب الحرص على عدم اختراق حاجز بين البطينين عند إدخال الإبرة.
    1. Rinsالبريد الدم مع ما يقرب من 300 مل من PBS حتى الرئتين هم من البيض ولا يخرج الدم من الأذين الأيمن.
  7. وقف ضخ، بسرعة نقل خرطوم / أنابيب إلى حل الأكرولين 3٪، والبدء في ضخ مرة أخرى. تدريجيا زيادة سرعة ضخ 80 مل / دقيقة مرة واحدة في القلب قد توقف عن الخفقان. يروي حوالي 500 مل من محلول الأكرولين.
  8. وقف ضخ، بسرعة نقل خرطوم في حل PFA 4٪، والبدء في ضخ مرة أخرى. هذه الخطوة تتطلب ما يقرب من 1 L من PFA.
    ملاحظة: إن تثبيت اكتمال عندما الأمامية هي جامدة والرقبة قاسية.
  9. قطع الرأس وتشريح بعناية الدماغ من الجمجمة. الحرص على عدم تلف الدماغ مع الأدوات الجراحية. نضح هو الأمثل عندما الدماغ هو شاحب (أي أثر الدم) وجامدة (الشكل 1A).
  10. تزج الدماغ سليمة في 4٪ PFA لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
  11. قطع متسلسل الدماغ مع تبريد vibratome (4 ° C)في الطائرة المطلوبة إلى 50 ميكرون أبواب سميكة وجمعها في برنامج تلفزيوني (0.1 M) (الشكل 1B).
    ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة في نواح كثيرة وفقا لبروتوكول المرجوة. نصفي الكرة الأرضية يمكن فصلها قبل vibratome القطع، أو كله أبقى. إذا كان الدماغ هو كبير جدا لمنصة vibratome، فإنه يمكن خفض إلى كتل أصغر. بعد هذه الخطوة، أقسام يمكن تخزينها لفترة طويلة من الزمن في -30 ° C في محلول مضاد مصنوعة من 40٪ PB (50 ملم)، و 30٪ الجلسرين، و 30٪ جلايكول الإثيلين.

3. قبل تضمين المناعية (الشكل 1C)

  1. إعداد 4 L حل سهم مخزنة تريس المالحة (TBS، 50 مم، ودرجة الحموضة 7.6) على النحو التالي.
    1. قياس 2L من الماء المقطر في الكأس 4 L، إضافة 24.23 غرام من aminomethane trihydroxymethyl (ثام، C 4 H 11 NO 3)، ويقلب إلى حل.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.6 مع ما يقرب من 148 مل من 1 N حمض الهيدروكلوريك. وينبغي أن يضاف حمض مع cautiعلى تجنب الوصول إلى درجة الحموضة أقل من 7.6. يجب أن يكون الحجم الكلي 4 L.
      تنبيه: حمض الهيدروكلوريك غير ضارة للغاية. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
  2. حدد الأجزاء (من الخطوة 2.11) تحتوي على منطقة الفائدة التي سيتم تجهيزها لEM المناعية.
  3. غسل أقسام التعويم الحر 3X في برنامج تلفزيوني (0.1 M، ودرجة الحموضة 7.4) لمدة 5 دقائق على RT لشطف حل التجمد.
  4. إعداد محلول 0.5٪ من NaBH 4 مخففة في برنامج تلفزيوني.
    1. تزن 0.05 غرام من NaBH 4 وتمييع في 10 مل من برنامج تلفزيوني. لا تغطي. يعد هذا الحل فقط قبل الاستخدام.
  5. احتضان المقاطع في حل الطازجة NaBH 4 لمدة 30 دقيقة في RT. صخرة بلطف. لا تغطي.
  6. غسل 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT، هزاز بقوة حتى أيا من الغاز رد فعل لا يزال قائما.
  7. يعد حل حظر ل EM مع 2٪ مصل طبيعي المناسب و 0.5٪ الجيلاتين الأسماك الباردة المخفف في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: شول كميةد تحسب من أجل الحصول على ما يكفي للخطوات الثلاث التالية. استخدام المصل مصنوعة من أنواع الحيوانات نفسها استضافة الأجسام المضادة الثانوية. تجنب استخدام أساليب استرجاع مستضد أو إضافة كميات صغيرة من تريتون (لزيادة اختراق الأجسام المضادة)، وهذه الأساليب بخرق كبير في نوعية الأنسجة.
  8. احتضان المقاطع في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة على RT. صخرة بلطف.
  9. يعد حل الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل.
    ملاحظة: إن تركيز الأجسام المضادة الأولية عادة ما يكون نفس لالمناعية LM، ولكن النظر في إجراء التجارب مع تركيز الأجسام المضادة المختلفة مسبقا، حيث أن بعض الأجسام المضادة الأولية قد لا تعمل مع الأكرولين. إذا كان الأمر كذلك، فمن الممكن استخدام مزيج من غلوتارالدهيد (0،1-2٪) و 4٪ PFA لنضح transcardiac والحصول على نتائج مماثلة. تحسين فترة حضانة ودرجة الحرارة أيضا.
  10. احتضان المقاطع في حل الأجسام المضادة الأوليةبين عشية وضحاها في RT مع هزاز لطيف. استخدام اختبار قبل فترة حضانة ودرجة الحرارة.
  11. غسل أقسام 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في RT مع هزاز لطيف.
  12. إعداد 1: الحل 1000 من الأجسام المضادة الثانوية المعقدة البيروكسيديز مخففة في عرقلة الحل.
    ملاحظة: يجب أن يتم رفع الأجسام المضادة الثانوية ضد الأنواع المضيفة استخدامها لتوليد الأجسام المضادة الأولية.
  13. احتضان المقاطع في حل الضد الثانوية لمدة 1.5 ساعة عند RT. صخرة بلطف.
  14. يعد حل أفيدين البيوتين-البيروكسيديز (ABC) 60 دقيقة على الأقل قبل نهاية الحضانة الأجسام المضادة الثانوية.
    1. استخدام ماصة معايرة لقياس 8.80 ميكرولتر / مل من الحلول A و B وتمييع لهم في برنامج تلفزيوني.
    2. صخرة أقل ما يقال لمدة 60 دقيقة على الأقل في RT للسماح لاستكمال الربط بين أفيدين والبيوتين الجزيئات.
  15. بعد الحضانة في حل الضد الثانوية، وغسل 3X في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT.
  16. احتضان المقاطع في ABC ذلكlution لمدة 1 ساعة على RT. صخرة بلطف.
  17. يغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني ومرتين في TBS لمدة 10 دقيقة في RT مع هزاز لطيف.
  18. يعد حل الطازجة 0.05٪ 3،3'-diaminobenzidine (DAB) مع 0.005٪ H 2 O 2 مخففة في TBS.
    1. تزن 12.5 ملغ من DAB وتمييع في 25 مل من TBS الباردة. احم من الضوء.
      تنبيه: مسحوق DAB متقلبة للغاية وضارة في حالة استنشاقه. ومن مسرطنة وماسخة. وبالتالي، يجب على النساء الحوامل أو المرضعات عدم التعامل مع هذا المنتج، حتى عندما تضعف. استخدام قناع N95 عند التعامل مع وارتداء معدات الوقاية الشخصية.
    2. تصفية حل وإضافة 4.5 ميكرولتر من 30٪ H 2 O 2 قبل الاستخدام.
  19. احتضان المقاطع في حل DAB ل3-7 دقيقة في RT. صخرة بلطف.
    ملاحظة: راسب بني لا ينبغي أن تكون مظلمة للغاية من أجل تجنب مستوى عال من تلوين الخلفية. ينبغي أن يكون الأمثل فترة حضانة وفقا لذلك.
  20. وقف رد فعل عن طريق الغسيل بسرعة مرتينفي TBS الباردة، ثم مرتين لمدة 10 دقيقة في TBS الباردة في RT، تليها مرتين لمدة 10 دقيقة في PB، مع هزاز معتدل.
    ملاحظة: استخدام PB (وليس PBS) أمر بالغ الأهمية من أجل القضاء على أي آثار لكلوريد الصوديوم، كما أن تتفاعل مع الأوسيميوم وشكل بلورات.

4. المعاملة بالأوزميك والتضمين للالكترون مجهرية المراقبة

  1. يعد حل من 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم (أوسو 4) المخفف في PB. احم من الضوء.
    تنبيه: الأزميوم هو شديد السمية، وينبغي أن لا تأتي في اتصال مع الجلد والعينين والفم أو وينبغي ألا استنشاقه. ويمكن أن يسبب الموت إذا تناولها. وينبغي أن تستخدم إلا تحت غطاء التنفيس ومع PPE المناسبة.
  2. احتضان المقاطع في أوسو 4 الحل لمدة 30 دقيقة في RT تحت غطاء محرك السيارة التنفيس (بدون التحريض) وتغطيتها بورق الألمنيوم لحمايتهم من الضوء. تماما تتسطح الأقسام قبل إضافة حل أوسو 4.
    ملاحظة: أقسام تصبح مظلمة جدا وريدائرة المخابرات العامة، وينبغي معالجته بعناية بعد هذه الخطوة.
  3. إعداد راتنجات الايبوكسي بالماء طارد خلال المعاملة بالأوزميك.
    1. إضافة كميات مناسبة من كل مكون من مزيج راتنجات الايبوكسي (20 غرام من راتنجات الايبوكسي، 20 غراما من تصليب، 0.6 غرام من مسرع و 0.4 غرام من الملدنات) إلى كوب كبير من البلاستيك. يحرك بعصا خشبية أو ماصة بلاستيكية حتى يتم الحصول على اللون البني متجانسة.
      ملاحظة: من المهم جدا استخدام النسبة الدقيقة لكل مكون.
    2. نقل كميات متساوية في أكواب الألومنيوم ذات الأحجام المناسبة، اعتمادا على عدد من المقاطع لتتم معالجتها. السماح لها للراحة.
  4. غسل أقسام osmificated 3X في PB لمدة 10 دقيقة في RT مع انخفاض السرعة هزاز.
  5. يذوى المقاطع في السلسلة التالية من الايثانول متدرج لمدة 2 دقيقة لكل منهما: 2 مرات في 35٪ من الإيثانول. 1 مرة في كل 50، 70، 80، 90، و 95٪ من الإيثانول. و3X في الإيثانول بنسبة 100٪.
  6. نقل المقاطع لقوارير الزجاج لاستكمال dehydratiعلى عملية التي يحتضنها الأقسام 3 مرات لمدة 2 دقيقة في أكسيد البروبيلين.
    تنبيه: أكسيد البروبيلين هو مذيب عضوي شديد التقلب والسامة. ويمكن أن يسبب أضرارا خطيرة في العينين أو الجلد في حالة ملامسة أو في حالة استنشاقه أو ابتلاعه. وقد تم تصنيفها على أنها مادة مسرطنة الصف 2. وينبغي أن تستخدم إلا تحت غطاء التنفيس ومع PPE. بل هو أيضا سريع الاشتعال ويجب أن تبقى بعيدا عن أي مصدر حراري.
    ملاحظة: قبل هذه الخطوة، يجب نقل أقسام بعناية في قوارير زجاجية، منذ أكسيد البروبيلين هو المذيبات العضوية وغير متوافق مع البلاستيك. عند هذه النقطة، أقسام هشة جدا ويجب معالجته بعناية. أقسام يمكن نقل بدلا من ذلك إلى قارورة زجاجية السابقة إلى الخطوة 4.5.
  7. نقل المقاطع بعناية، واحدا تلو الآخر، في أكواب الألمنيوم وتجنب ملامسة الهواء قدر الإمكان. شقة-تضمين المقاطع في مختلطة سابقا راتنجات الايبوكسي بالماء طارد واحتضان لهم بين عشية وضحاها تحت ventinز هود في RT.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، والمقاطع المجففة تماما وهشة للغاية، وينبغي التلاعب بها بعناية.
  8. استخدام الزيوت المعدنية، وإعداد الشرائح الزجاجية المغلفة الشحوم مع coverslips البلاستيك مدهون.
  9. تليين الراتنج التي يحتضنها أكواب الألومنيوم عند 60 درجة مئوية لمدة 12-15 دقيقة على الأكثر. بعناية تتسطح المقاطع على الجانب مدهون من شريحة زجاجية. ضع ساترة مدهون ودفع بعناية أي الهواء المتبقية.
  10. احتضان الشرائح في 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    ملاحظة: من المهم جدا أن لا تتجاوز 48 ساعة فترة حضانة، والراتنج سيصبح صعبا للغاية.
  11. إزالة ساترة البلاستيك.

5. إعداد نموذج لسامسونج باجتزاء والمراقبة باستخدام مجهر نقل الكترون

  1. استخدام مناظير للعثور على المنطقة من اهتمام وقطع قطعة صغيرة من رباعي الزوايا حوالي 1 ملم 2 مع مشرط.
  2. ملف غيض من كتلة الراتنج والصمغ تشوقطعة adrangular على ذلك (الشكل 1C). السماح للالغراء لتجف لمدة 1 ساعة على الأقل أو قبل ليلة وضحاها إلى باجتزاء.
  3. باستخدام مشراح مستدق، وقطع قطعة رباعي الزوايا إلى 80 أقسام ميكرون سميكة (1D الشكل).
    1. وضع كتلة الراتنج في سطح السفينة مشراح مستدق في الوضع الرأسي و، باستخدام شفرة حلاقة حادة، وقطع تدريجيا كل جانب من كتلة الراتنج لتشكيل شبه منحرف مع الجانبين على نحو سلس.
    2. وضع سطح السفينة في موقفها الأفقي وتدوير كتلة حتى الجانب الأطول من شبه منحرف يواجه الهبوط.
    3. استخدام أداة الماس تقليم أو سكين الزجاج لخفض سطح قطعة رباعي الزوايا. تعيين مشراح مستدق إلى قطع 300 ميكرون أبواب سميكة في 1 ملم / ثانية. ضبط السكين ليكون عموديا موازية لقطعة رباعي الزوايا ولعرض زاوية أفقية صغيرة جدا من ما يقرب من 1 درجة.
      ملاحظة: هذا زاوية تسمح للمستخدم الاقتراب من الأنسجة موازية تقريبا لسطح بقفل، حيث من المرجح أن تكون وجدت العناصر immunolabeled. عند استخدام هذه المعلمات مع أداة الماس تقليم، ويعرض الراتنج لون أبيض لامع. عندما يتم قطع الأنسجة، فإنه يتحول إلى اللون الأرجواني أو الأخضر.
    4. استخدام فائقة 45 درجة سكين الماس مجهزة قارب مملوء بالماء المقطر لخفض 80 ميكرون أبواب سميكة، تنعيم الأجزاء التي يمر عليها بقطعة من امتصاص الورق يميل في الزيلين، وجمع الأجزاء المتسلسلة على شبكات فتحة النيكل formvar المغلفة أو العارية 150 شبكات النحاس الشبكة (الشكل 1E).
  4. وضع شبكات في صندوق تخزين الشبكة.
  5. وصمة عار على شبكات من الرصاص سترات.
    1. استخدام 5 مل حقنة وحقنة 0.2 ميكرومتر مرشح لإعداد 1: حل 1 من محلول المخزون سترات الرصاص تصفيتها وتصفية الماء المقطر. حمايتها من الضوء.
      ملاحظة: حل سهم سترات الرصاص ينبغي بذل جديدة كل شهر لتجنب تشكيل depos الصلبةانها. انظر ورقة البيانات المادية لصفة الأسهم. وبالإضافة إلى ذلك، إذا لا بد من ملطخة سلسلة العديد من الشبكات، تغيير محلول مخفف عندما يصبح حليبي.
    2. ضع كل شبكة على قطرة من محلول مخفف، مع القسم في اتصال مع الحل. احتضان لمدة 3 دقائق.
    3. استخدام ملاقط صغيرة لعقد الشبكة، وشطف جيدا في اثنين من الأكواب التي تحتوي على الماء المقطر.
    4. إزالة الماء الزائد باستخدام بلطف ورقة امتصاص. تخزين الشبكات في مربع الشبكة. انتظر 30 دقيقة قبل فحص الأجزاء التي نقل الإلكترون المجهري (TEM، الشكل 1F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا القسم، نقدم نتائج ممثل التي تم الحصول عليها بعد الملاحظة، وعلى مستوى EM الإرسال، من immunostained أنسجة المخ الرئيسيات ثابتة كيميائيا مع خليط من 3٪ و 4٪ الأكرولين PFA. حققنا الحفاظ جيدا على التركيب الدقيق، كما يتضح من غمد المايلين سليمة نسبيا والتصور أنيق أغشية مزدوجة (الشكل 2A). يمكن بسهولة الاتصالات متشابك، جنبا إلى جنب مع العناصر العصبية من المكروية، الكشف عن هويته (الشكل 2B). يتم التعرف على العناصر العصبية المسمى مع diaminobenzidine (DAB) immunoprecipitate على مستوى EM من قبل السيتوبلازم على شغلها أو جبلة المحوار. كما اصطف غشاء البلازما والسطح الخارجي للعضيات عادة مع يعجل الإلكترونات كثيفة (الشكل 3).

في هذه التجربة بالذات، كنا الأجسام المضادة الآغاانست للنقل السيروتونين (سرت)، أسيتيل كولين (الدردشة)، أو هيدروكسيلاز التيروزين (TH) لتصور العناصر العصبية immunolabeled في الخارجية (إصدار Google Play) أو داخلية (مؤشر السلام العالمي) جزء من الشاحبة السنجاب قرد جلوبس (الشكل 3). من أجل القيام بذلك، كنا مجموعة من المواد الكيميائية التي تحافظ على تثبيتي استضداد فضلا عن التركيب الدقيق، والسماح لتحقيق الصرفي تفصيلا. على الرغم من أن العديد من الأجسام المضادة يمكن استخدامها مع بروتوكول transcardiac نضح المذكورة أعلاه، من المستحسن أن للمستخدمين إجراء اختبارات تركيز الأمثل مسبقا، حيث يتم المعروف أن بعض الأجسام المضادة الأولية لعدم توفر immunolabeling الأمثل مع تثبيت الأكرولين. بدلا من ذلك، عندما الأجسام المضادة لا توفر immunolabeling الأمثل مع تثبيت الأكرولين، والتخفيف من 0،1-2٪ غلوتارالدهيد في 4٪ PFA يمكن استخدامها لنضح transcardiac. ويوفر جودة النسيج تعادل نسبيا لأنسجة المخ ثابتة الأكرولين مع استضداد الحفاظ عليها بالنسبة للكثيرينالأجسام المضادة (الشكل 4).

وأخيرا، ونحن نقدم أمثلة نموذجية للphotomicrographs EM التي تم الحصول عليها بعد التلاعب غير لائقة. والنتائج السيئة التثبيت في الأغماد المايلين المعدلة (الشكل 5A، B) وصعوبات في التصور للأغشية مزدوجة من neurites التي (الشكل 5C، D)، منع تحديد وتحليل عناصر العصبية وصفت وغير المسماة موثوق بها. وفترة حضانة المفرط في حل DAB يخلق خلفية المفرطة وتلطيخ غير محددة التي يمكن ان تولد نتائج إيجابية كاذبة. يبدو الخلفية أو غير محددة تلطيخ أحيانا تلطيخ كما مكتمل العناصر العصبية (الشكل 6A، B)، ولكن في كثير من الأحيان كما عديدة ويقع عن كثب العناصر العصبية الملون (الشكل 6C، D). استخدام المنظفات في عرقلة الحل يغير بشكل كبير على نوعية الأنسجة. فإنه قد يؤدي إلى المفقودينالعضيات في عناصر المسمى (الشكل 7A) أو تدهور الأغماد المايلين (الشكل 7B) والأغشية الخلوية (الشكل 7C)، مما يجعل أي تفسير حاد في المكروية الصعبة. وأخيرا، وزلة في عملية المعاملة بالأوزميك، مثل استخدام الحل الشطف التي تحتوي على كلوريد الصوديوم، يؤدي إلى نتائج لا يمكن الاعتماد عليها حيث يصعب التمييز (الشكل 7D) الهياكل الخلوية.

شكل 1
الشكل 1: الخطط للخطوات الأساسية من البروتوكول. يتم قطع دماغ القرد (A) إلى أقسام المسلسل مع لvibratome التبريد (B). ثم يتم معالجتها لمرحلة ما قبل التضمين المناعية والمجهر الإلكتروني، وبعد ذلك يتم وضع المنطقة ذات الاهتمام على طرف كتلة الراتنج (C) ومقطعة إلى 80 secti سميكة نانومترالإضافات مع مشراح مستدق (D). ثم يتم جمع الأجزاء سامسونج على العارية 150 شبكات سلكية النحاس أو النيكل شبكات formvar المغلفة (E)، ملطخة سترات الرصاص وعلى استعداد لاحظ تحت المجهر انتقال الإلكترون (F). أشرطة النطاق: 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الحفاظ جيدا الرئيسيات أنسجة المخ بعد الأكرولين-PFA Transcardiac الإرواء. الميكروسكوب الالكتروني من قرد السنجاب (Saimiri sciureus) أنسجة المخ من مؤشر التكافؤ بين الجنسين (A) وإصدار Google Play (B) تظهر ممثل المواد جيدا المحافظة بعد أداء transcardiac نضح الأكرولين-PFA وتقنية المناعي ظهور-diaminobenzidine. معهمغمد يلين من المحاور (أ) سليمة نسبيا (انظر السهم في A)، والتركيب الدقيق عام يتم الاحتفاظ بشكل جيد في وملامح B. الجذعية (د)، محاور كمون الفعل صغيرة (أ)، ودوالي محور عصبي (AV) يمكن بسهولة الكشف عن هويته. ويرد مثال لدوالي محور عصبي إنشاء اتصال متشابك متناظرة (بين الأسهم) مع لمحة شجيري (د) في (ب). شريط الحجم: 1 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): أقسام من السنجاب قرد إصدار Google Play ومؤشر التكافؤ بين الجنسين Immunolabeled لالكولين أسيتيل (الدردشة)، السيروتونين الناقل (سرت)، وهيدروكسيلاز التيروزين (TH) باستخدام تقنية المناعي ظهور-diaminobenzidine. المناعيةيمكن بسهولة عناصر وصفت تحديدها من قبل السيتوبلازم أو جبلة المحوار مليئة الإلكترون الكثيفة DAB راسب. يتم التعرف على ملامح الجذعية وصفت من قبل خيوط دقيقة شغلها، كما رأينا في A، حيث التغصنات-immunostained دردشة في مؤشر التكافؤ بين الجنسين يتلقى اتصال متشابك (بين الأسهم) من دوالي محور عصبي الخالي من الملصقات (AV). صورة مجهرية الإلكترون في B يظهر محور عصبي مياليني في إصدار Google Play مع غمد المايلين سليمة نسبيا الذين immunolabeled لTH جبلة المحوار. على سبيل المثال في C ويظهر في دوالي محور عصبي في مؤشر التكافؤ بين الجنسين immunolabeled لسرت وينظر إلى إقامة اتصال متشابك متناظرة (بين الأسهم) مع التغصنات (د). في هذا المثال، DAB يعجل خطوط غشاء البلازما والسطح الخارجي للعضيات (الحبيبات الخيطية والحويصلات متشابك). وقد لوحظ دوالي محور عصبي هو مبين في D في إصدار Google Play وimmunolabeled لTH ويمثل مثالا DAB يعجل ملء تماما axopالاجتماعي اللاتيني، مع حويصلات متشابك كونها مرئية ولكن أكثر صعوبة لتحديد. يمكن بسهولة تحديد عناصر المكروية، كما يتضح من المحاور العصبي وكمون الفعل (أ) والتشعبات في بعض الأحيان (د) المحيطة دوالي محور عصبي المسمى. يتم تعديل الميكروسكوب الإلكتروني في الفترة من 25 و 26 و 27. شريط الحجم: 1 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: أمثلة من نسيج الدماغ الرئيسيات بعد غلوتارالدهيد-PFA Transcardiac الإرواء. الميكروسكوب الإلكتروني تمثيلية من المكاك قرد (المكاك fascicularis) أنسجة المخ من إصدار Google Play (A) ومؤشر التكافؤ بين الجنسين (BD) بعد performi نانوغرام transcardiac نضح مع 0.2٪ غلوتارالدهيد مختلطة مع 4٪ PFA وتقنية المناعي ظهور-diaminobenzidine مع الأجسام المضادة ضد نقل السيروتونين (سرت). كما في الشكل 2، immunolabeled عناصر يمكن تحديد السيتوبلازم وجبلة المحوار مليئة الإلكترون الكثيفة DAB راسب. التركيب الدقيق عامة سليمة نسبيا ويمكن بسهولة تحديد عناصر المكروية، كما يتضح من المحاور العصبي وكمون الفعل (أ) والتشعبات في بعض الأحيان (د) ودوالي محور عصبي (AV) المحيطة دوالي محور عصبي المسمى، كما هو موضح في الشكل (2). ومع ذلك، لاحظ التناقض في نوعية التركيب الدقيق، الرمز بواسطة أغشية البلازما واضحة المعالم (السهام)، ولكن تضررت نسبيا غمد المايلين (السهم). شريط الحجم: 1 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الرقم 5
الشكل 5: أمثلة من نسيج الدماغ الرئيسيات التي تم الحصول عليها بعد Transcardiac الإرواء غير ناجحة. وتظهر نتائج من التثبيت الكيميائية غير ناجحة هنا في قرد السنجاب مؤشر التكافؤ بين الجنسين (A - B) وإصدار Google Play (C - D) perfused لtranscardially مع كلوريد الصوديوم 0.9٪ الشطف حل وخليط من الجليد الباردة PFA 4٪ و 15٪ البكريك حمض المخفف في 0.1 M PB (7.4 درجة الحموضة). العقول وبعد ثابتة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية في 4٪ PFA و 30٪ سكروز ومقطعة إلى 60 ميكرون أقسام السهمي سميكة مع vibratome التبريد. غير لائق أنسجة المخ ثابتة يمكن التعرف عليه بواسطة غمد تلف المايلين (A و B، السهام)، فضلا عن ضبابية أو غير محددة أغشية البلازما (C و D، انظر النصال على سبيل المثال). عناصر الخلايا العصبية المختلفة وDIFficult لتحديد وتقديم أي تفسير التركيب الدقيق لا يمكن الاعتماد عليها. شريط الحجم: 1 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: أمثلة من Immunolabeling دردشة غير محدد في السنجاب قرد إصدار Google Play. يبدو تلوين الخلفية أو immunolabeling غير محددة أحيانا تحت EM تلطيخ كما جزئي من العناصر الخلوية كبيرة، كما هو موضح في A - B (السهام). يبدو هذا تلطيخ غير محددة في كثير من الأحيان على سطح أقسام immunostained. ومن الأمثلة الأخرى من immunolabeling غير محددة الملاحظة المتكررة من عناصر صغيرة جدا تستحضر، محاور كمون الفعل صغيرة مملوءة جزئيا أو كليا مع DAB وتقع قريبة جدا من واحدنوثر، كما يتبين من السهام في C و D. شريط الحجم: 1 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7: التالفة السنجاب قرد إصدار Google Play الأنسجة بعد الأخطاء في إعداد نموذج لالمجهر الإلكتروني. استخدام المنظفات، مثل تريتون X-100، في عرقلة الحل، حتى في تركيز منخفض من 0.02٪، يغير بشكل جوهري على سلامة التركيب الدقيق عن طريق اتلاف السيتوبلازم من التشعبات (A) أو غمد المايلين من المحاور (B ). العناصر العصبية المختلفة هي أيضا من الصعب تمييزها عن بعضها البعض (C)، حيث يتم تلف أغشية البلازما وصعبة لتحديد. عملية المعاملة بالأوزميك هو المرضس خطوة هامة في إعداد العينات. استخدام كلوريد الصوديوم في الشطف حلول (D) يغير تثبيت الأنسجة، مما يجعل من الصعب تحليلها لاحقا. شريط الحجم: 800 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة، نقدم بروتوكول موثوق بها لنضح transcardiac من الرئيسيات غير البشرية والمناعية قبل التضمين مناسبة لEM فحص العينة. وعلى الرغم من نموذجي البرد EM، مثل CEMOVIS، يوفر المحافظة لا بأس به من التركيب الدقيق الدماغ، كما أنه يحد من استخدام المناعية 12. تقنيات أخرى، بما في ذلك البرد الإحلال وتقنية Tokuyaso، تسمح بعد تضمين المناعية، ولكن هذه التقنيات غالية الثمن بسبب الأجهزة الإضافية اللازمة أثناء العملية، ويمكن أن يكون والمهارات تحدي 12، 14، 15 تستغرق وقتا طويلا. وعلاوة على ذلك، من أجل الاستعمال الفعال للطريقة البرد التثبيت، العينة يجب أن تكون صغيرة نسبيا (حتى 200 ميكرون في سمك عند استخدام الضغط العالي تجميد 28 و 10 ميكرومتر في الضغط الجوي 29). من الناحية المثالية، للحصول على خيرالنتائج مع البرد تثبيت من أنسجة الدماغ الرئيسيات، يجب أن يؤخذ من خزعة، مما يسبب مشاكل في العثور على الموقع الدقيق للمنطقة الفائدة العينة. يجب التحايل على هذه المشكلة باستخدام الإحداثيات التجسيمي. التثبيت الكيميائية مع الأكرولين وتقنية التضمين قبل المقترحة أعلاه يوفر ومنخفضة التكلفة سهلة، لمرة وكفاءة، وطريقة موثوق بها لإعداد عينة من أنسجة المخ الرئيسيات وimmunolabeling لEM. باتباع الخطوات التالية، واحد الحصول على التركيب الدقيق المحفوظة جيدا جنبا إلى جنب مع استضداد للسماح immunolabeling معظم البروتينات. ومع ذلك، التثبيت الكيميائية لEM له أيضا سلبياته. أولا، في حين أن الحلول تثبيتي مثل الأكرولين الحفاظ على التفاصيل الشكلية للأنسجة المخ، فمن الممكن أن بعض التغيرات المورفولوجية تحدث أثناء عملية التثبيت الكيميائية وتغير النتائج مقارنة مع تلك التي سيتم الحصول عليها مع CEMOVIS أو تقنيات البرد تبديل. ثانيا، عملية تثبيت والجفاف اللاحقة اللازمة لراتنج تضمين إزالة معظم السوائل خارج الخلية والضغط المكونات الخلوية معا، مما تسبب في انكماش الأنسجة التي يعدل بشكل ملحوظ إلى حجمه وشكله مقارنة مع الخلايا الثابتة البرد 21 و 30. ومع ذلك، فقد استخدمت ألدهيد تثبيت بنجاح في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم، وقبلت على نطاق واسع في الأدب كوسيلة موثوق بها لدراسة الخصائص التركيبية للخلايا العصبية والخلايا الدبقية، على الرغم من المخاوف التي سبق ذكرها 21، 30، 31، 32.

وبالمقارنة مع الطريقة الموصوفة أعلاه، فإن المناعية postembedding أن هناك حاجة لعينات ثابتة البرد جزءا لا يتجزأ من الراتنج ميتاكريليت، هي أقل حساسية والكشف عن المستضدات الجهاز العصبي المركزي محدودة 14 33. ومع ذلك، فقد ألدهيد تثبيت حدوده أيضا في ما يخص استضداد. لذلك، من المهم لاختبار خصوصية الأجسام المضادة للبروتوكول تثبيت مادة كيميائية معينة على مستوى LM قبل البدء في إعداد EM. يعتمد على نوعية المناعية على أنسجة المخ ثابتة الأكرولين أيضا على كسر سابقا السندات ألدهيد قوية إنشاؤها من قبل التثبيت الكيميائية. هذه الخطوة يمكن أن يتحقق عن طريق احتضان أقسام قبل المناعية مع بوروهيدريد الصوديوم (انظر خطوات 3،3-3،5). أن إهمال هذه الخطوة تؤدي بالتأكيد في المناعية الأمثل 34. إذا كانت الأجسام المضادة لاستخدامها لا تعطي تلطيخ الأمثل على أقسام الدماغ ثابتة مع الأكرولين، فمن الممكن استخدام بدلا من غلوتارالدهيد (0،1-2٪) المخفف في 4٪ PFA. وقد ثبت هذا إلى الحفاظ جيدا التركيب الدقيق الدماغ مع الحفاظ بما فيه الكفاية استضداد لكثير من الأجسام المضادة وتوفير أنسجة المخمناسبة للتخزين طويل الأجل مع الحد الأدنى من التعديلات 20 و 21 و 35 و 36 و 37. ومن الممكن أيضا لتحقيق تثبيت جيد نسبيا واستضداد مناسبة لEM مع PFA وحدها التي رفع كبير في درجة الحموضة من الحل، ولكن مزيج من تثبيتي أكثر من خلال نضح قدمت نتائج أفضل 34، ودراسات تدعم أن PFA تثبيت وحده عموما إنتاج الأنسجة محفوظ بشكل سيء للEM فحص 38 و 39. ومع ذلك، في بعض الحالات النادرة، استضداد من الصعب جدا للحفاظ على، ويبقى PFA تثبيت وحده الخيار الوحيد القابل للتطبيق لفحص EM.

ينبغي اتباع العديد من الخطوات في هذا البروتوكول بعناية من أجل الحصول على أفضل النتائج. على سبيل المثال، وإعداد الحل PFA 4٪يجب أن يؤديها في درجات حرارة أعلى من 45 درجة مئوية وذلك للسماح للمسحوق PFA إلى حل، ولكن لا بد من أن درجة الحرارة لا تزال أقل من 60 درجة مئوية. على خلاف ذلك، فإن الحل PFA depolymerizes إلى الفورمالديهايد وحمض الفورميك، الذي يحدد نسيج مختلف، ويشكل المحاليل الحمضية يمكن أن يغير بشكل ملحوظ نوعية الأنسجة 40 و 41. بالإضافة إلى ذلك، فمن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ الخطوات نضح بها على وجه السرعة بمجرد قطع الحجاب الحاجز، منذ نقص الأكسجين وفرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم سوف تنتج التغيرات الفسيولوجية لا رجعة فيها إلى الدماغ يمكن أن يغير نوعية وسلامة الأنسجة 31. تثبيت خلل يمكن أن يكون ضارا في الحفاظ على أنسجة المخ ويغير بشكل دائم التركيب الدقيق للأنسجة، مثل أغشية البلازما، الميتوكوندريا ونقاط الاشتباك العصبي. وهكذا، وإعداد الحل والخطوات نضح يحتاج إلى أن تتم بعناية. ناجح EM عينة محضراتن أيضا يعتمد بشكل كبير على جيدة بعد التثبيت في رباعي أكسيد الأوزميوم. وبالفعل، فقد وصفت نضح المباشر مع رباعي أكسيد الأوزميوم عن إنتاج أنسجة سليمة بشكل معقول للمراقبة EM 21، 39. ومع ذلك، فقد لاحظ العديد من الاختلافات من حيث كمية الفضاء خارج الخلية وظهور غشاء البلازما بين-perfused لالأوسيميوم وperfused لألدهيد الحيوانات. وعلاوة على ذلك، واسوداد وتصلب الأنسجة بعد نضح الأوسيميوم جعل إزالة الدماغ من الجمجمة، وتشريح لاحقة، والتفريق بين المادة البيضاء والرمادية أكثر صعوبة، لصالح ألدهيد نضح لتحسين الحفاظ على الأنسجة وأسهل التلاعب 21. يبدو ألدهيد تثبيت وحدها للحد من الفضاء خارج الخلية، مما يغير من سلامة الأنسجة ويعطي انطباعا منعطفات ضيقة حيث ينبغي أن ينظر إلى الفضاء خارج الخلية، وبالتالي عدم اظهارالميكروسكوب الإلكتروني مقبول حتى بعد الرصاص تلطيخ سترات 42. ومع ذلك، postfixation في رباعي أكسيد الأوزميوم عكس هذا الوضع من خلال السماح لفصل أكثر واضح بين عناصر الأنسجة، وهو أمر ضروري لتحديد هويتهم 42، مما يبرر بوضوح أهمية تنفيذ الخطوات المعاملة بالأوزميك (الخطوات 4،1-4،2) بحذر.

وقد تم اختبار الظروف وتركيزات التي يتم بموجبها تنفيذ هذه الخطوات في مختبرنا، وتحديدا لمرحلة ما قبل التضمين المناعية باستخدام DAB كما يعجل في أقسام الدماغ الرئيسيات. وعلى الرغم-تحدي المهارات، انقر نقرا مزدوجا المناعية ممكنة من خلال مرحلة ما بعد تضمين المناعية مع الذهب جسيمات 43. وDAB الإلكترون الكثيفة يعجل تم الحصول عليها بعد تقنية المناعي ظهور-diaminobenzidine المقترحة هنا من السهل جدا التعرف على مستوى EM، لأنه يحدد أغشية البلازما والخروجإيه أسطح العضيات، في حين لا يزال يسمح بتحديد المكونات الفرعية الخلوية، مثل الميتوكوندريا والاتصالات متشابك. بالإضافة إلى ذلك، بمجرد يتقن هذه التقنية الحالية لالمناعية واحدة، فمن الممكن أن تؤدي المناعية مزدوجة من خلال الجمع بين DAB يعجل إلى جزيئات الذهب، والتي يتم تمييزها بسهولة أكبر عن بعضها البعض من جزيئات الذهب من مختلف الأحجام. نود أن نوصي به اختبارات صارمة من خصوصية الأجسام المضادة، وتركيزات الأوسيميوم، وفترة حضانة ودرجة الحرارة قبل معالجة أقسام الدماغ لEM. بروتوكولات لمرحلة ما قبل التضمين والمناعية مزدوجة لEM وقد نشرت سابقا ويمكن تكييفها لأنسجة الدماغ الرئيسيات 16.

وفي الختام، وبروتوكول نضح transcardiac عن الرئيسيات غير البشرية الواردة أعلاه يسمح للتخزين على المدى الطويل من أقسام الدماغ التي يمكن بعد ذلك أن تستخدم لEM-تضمين قبل المناعية. التقطيعةنانوثانية تم الحصول عليها هي أيضا مناسبة للدراسات تشريحي عصبي على مستوى LM. وبالتالي، باستخدام البروتوكول الذي هو مناسبة لكلا EM وLM، فمن الممكن للحد من عدد الحيوانات المستخدمة، النظر فعالة من حيث التكلفة والأخلاقي. كما أنه يتيح المقارنة المباشرة بين النتائج التي تم الحصول عليها في LM ومستويات EM على نفس الحيوان ويسمح باستخدام المترابطة الخفيفة والدراسات الكترون مجهرية (CLEM). وقد ركزت الدراسات CLEM في الغالب على استخدام الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية، مثل EGFP، والتي يمكن بعد ذلك أن يكون المسمى مع يعجل الإلكترونات كثيفة ولوحظ على مستوى EM 44. بدلا من ذلك، إلى الالتفاف على مشكلة المناعية، البرد تثبيت يمكن دمجها مع حقنة داخل العصبون من علامات الإلكترون الكثيفة، مثل النقاط الكمومية 45، قبل التجميد، مما يسمح التصور على مستوى EM 46. ومع ذلك، النقاط الكمومية ليست حيويا، واستخدامها مكلف ويستغرق وقتا طويلا نظرا لجهاز التجميد الإضافية اللازمة لإعداد الأنسجة لاحق. على الرغم من أن هذه التقنيات لا يزال يفضل البرد تثبيت وطرق إحلال تجميد، وهناك بعض التطورات لاستخدام العلامات الكيميائية على شبه رقيقة (300 نانومتر) أقسام لتسمية البروتينات الخلوية المختلفة مع fluorophores الاصطناعية، والتي يمكن أن تكون مرتبطة مع تحليل EM 47 . تقنيات تسمح، على سبيل المثال، فإن العلاقة بين التعريب محور عصبي معين واحد باستخدام مضان والعلاقة متشابك مع الخلايا العصبية هيكل هدف معين باستخدام EM، واعدة وليس لفهم تنظيم الجهاز العصبي، وتحديدا في المقدمات. في هذه الحالة، ينبغي تفضيل الأكرولين تثبيت أكثر من غلوتارالدهيد، وهذا الأخير سوف تنتج تألق ذاتي يمكن أن يغير التصور السليم للهياكل الدماغ على مستوى LM. ومع ذلك، فقد تم إجراء دراسات قليلة جدا من هذا النوع في المقدمات، مostly بسبب التحديات التقنية والتكلفة العالية التي تفرض مثل هذه التجارب. وبالتالي، هناك حاجة إلى التطورات الجديدة للدراسات ناجحة وCLEM منخفضة التكلفة في الرئيسيات، مثل تحسين طرق التثبيت أو باستخدام علامات كيميائية واضحة في كل من LM ومستويات EM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذه الدراسة من قبل العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC، 401٬848-2٬011 إلى MP). استقبل النائب جائزة مهنة من فون دي بحوث كيبيك-سانتيه (FRQ-S). كان LE المستفيدة من زمالة الدكتوراه من FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). ونحن نشكر ماري جوزيه ولمان للحصول على المساعدة الفنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) Fisher scientific S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4·H2O) EM Science SX0710-1
Sodium chloride (NaCl) Fisher scientific S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM) Fisher scientific T370-500
HCl  EMD HX0603-3 1 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
NaOH EMD SX0590-1 5 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%) Sigma 110221 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table Mopec CE400
Electronic perfusion pump cole parmer masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion) terumo  NN-1838R 18 G 11/2
Needle terumo  NN-2713R 21 G 1/2
Ketamine 20 mg/kg
Xylazine 4 mg/kg
Acepromazine 0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades Feather           lance 201011           J9913 No.22 for surgery and No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome Leica VT 1200S Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade Gillette GIN 642107
Glycerol Fisher scientific G33-4 30% dilution
Ethylene glycol Fisher scientific E178-4 30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma S-9125
Normal horse serum (NHS) Jackson immunoResearch Laboratories 008-000-121 2% dilution
Cold-fish gelatin Aurion 900.033 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT Santa Cruz biotechnology SC-1458 1/500 dilution
Primary antibody, ChAT Chemicon (Millipore) AB144P 1/25 dilution
Primary antibody, TH ImmunoStar 22941 1/1,000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat Vector laboratories BA-9500 1/1,000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse Vector laboratories BA-2000 1/1,000 dilution
Vectastain elite ABC kit Vector laboratories PK6100 8.8 µL/mL of A and B each
3,3'-diaminobenzidine (DAB) Sigma D5637 0.05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30% Fisher scientific H-323 0.005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4) Electron microscopic science 2% 19152
4% 19150
 Original solution can be either 2 or 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin Sigma A: M epoxy resin (44611)
B: hardener 964 (44612)
C: accelerator 960 (DY 060) (44613)
D: plasticizer (44614) 		 Polymerize 48 h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups Electron microscopic science 70048-01
Ethanol commercial alcohols 1019C Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide Electron microscopic science 20401 Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides brain research laboratories 3875-FR Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film) Electron microscopic science 50425-25 Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome Leica UC7 EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim) Diatome  UT 1081 Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife Diatome  MC13437 equipped with a boat
Xylenes Fisher scientific X5SK-4
150-mesh copper grids Electron microscopic science G150-cu
grid-box Electron microscopic science 71138 Can store up to 100 grids
Sodium citrate Anachemia 81983
Lead nitrate Sigma L-6258 Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76 g of sodium citrate diluted in 42 mL of preboiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1 N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe terumo  SS-05L 5 mL
Syringe filter Corning 431222 0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper) Electron microscopic science 70086-1
Parafilm Laboratory film PM-999
Mineral oil Sigma M5904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005 (2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008 (2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

Tags

علم الأعصاب، العدد 122، انتقال المجهر الإلكتروني، قرد، التشريح العصبي، المناعية، والأجسام المضادة، الأكرولين، transcardiac نضح، التضمين، مشراح مستدق
إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eid, L., Parent, M. Preparation of… More

Eid, L., Parent, M. Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (122), e55397, doi:10.3791/55397 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter