Summary
כאן, אנו מספקים קלה, בעלות נמוכה, וזמן חסכוני פרוטוקול לתקן כימי רקמת מוח הפרימטים עם מקבע אקרולאין, המאפשר שימור לטווח ארוך התואמת טרום הטבעה אימונוהיסטוכימיה עבור במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים.
Abstract
למרות כל ההתקדמות הטכנולוגית ברמה המיקרוסקופית האור, מיקרוסקופ אלקטרונים נשאר הכלי היחיד במדעי המוח לבחון ולאפיין פרטי ultrastructural ו מורפולוגי של נוירונים, כגון קשרים סינפטיים. שימור טוב של רקמת המוח עבור במיקרוסקופ אלקטרונים ניתן להשיג על ידי שיטות קריו-קיבוע קפדני, אך הטכניקות הללו הם די יקרים ולהגביל את השימוש immunolabeling, שהוא חיוני כדי להבין את הקישוריות של מערכות עצביות מזוהה. שיטות Freeze-החלפה פותחו כדי לאפשר שילוב של קיבעון קריו עם immunolabeling. עם זאת, השחזור של גישות מתודולוגיות אלה בדרך כלל מסתמך על מכשירי קירור יקרים. יתר על כן, השיג תוצאות אמינות עם טכניקה זו הוא גוזל זמן מאוד ומיומן-מאתגר. לפיכך, המוח הקבוע המסורתי כימי, במיוחד עם מקבע אקרולאין, נשאר זמן-יעיל שיטה זולה לשלב אלקטרוניםמיקרוסקופ עם אימונוהיסטוכימיה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול ניסוי אמין באמצעות קיבוע acrolein כימי שמוביל לשימור רקמות מוח הפרימטים והוא תואם מראש הטבעת בדיקה מיקרוסקופית אלקטרונים אימונוהיסטוכימיה והעביר.
Introduction
במיקרוסקופ אור, כולל confocal מיקרוסקופיה שני פוטונים, הוכיחה להיות כלי יעיל לחקר בתהליכים עצביים vivo, בין היתר 1, 2. למרות הרזולוציה המרחבית הטיפוסית ברמת האור המיקרוסקופית (LM) היא כ 200 ננומטר, התקדמות טכנולוגית אחרונה באמצעות מקורות אור שונים, כגון אולטרה סגול קיצוני וכן במיקרוסקופ רנטגן הרכה, גדל בעיקר החלטה זו החלטה מרחבית 10 ננומטר כמעט 3 , 4, 5. התקדמות טכנולוגית אחרת הדמיה כוללת בשילוב הדמיה בתהודה מגנטית עם היסטולוגיה ולספק שיטה חדשה למדידת העובי של מעטפת המיאלין in vivo, פרמטר זה היה למדידה באופן מסורתי רק על מיקרוסקופית אלקטרונים (EM) הרמה 6, 7. AlthouGH התקדמויות אלה ברמת LM לספק כלי מצוין ללימוד תהליכי חיים, נוף ואפיון מפורט של מבנים, כגון קשרים סינפטיים, יכול להיות מושגת רק עם EM, המציע רזולוציה שיכול להגיע 0.5 ננומטר. עם זאת, תצפית ברמת EM מחייבת דגימות להיות מת ושינה במובנים מסוימים, עם fixatives כימי ותהליכי התייבשות, על מנת לשמר את cytoarchitecture. לפיכך, בחינת דגימות ביולוגיות ברזולוציה גבוהה יכול להיות מאתגרת בשל נזקי קרינה מקרן האלקטרונים, ניגודיות נמוכה, סטיות מבניות של ממברנות, או אפילו נוכחות של חפצים שיכולים להתרחש התייבשות אפוקסי הבאים הטבעה 8, 9, 10.
שימור דגימות בצורתם המקורית לניתוח מבני יכול להיות מושגת על ידי שימוש "Cryo EM סעיפים מזוגגים" או CEMOVIS, גישת חתך כיכרוך מקפיא והטבעה המדגם במהירות קרח זגוגי בחינת הסעיפים תחת EM בטמפרטורה קריוגני 11, 12. הליך זה מאפשר בחינת דגימות בזמן שהם עדיין מוצקים hydrated מלא, ובכך לחסל חפצים הנגרמים על ידי התייבשות מעבד 13. עם זאת, שיטה זו כרוכה מכשירים נוספים קריו-ultramicrotomy, כמו גם מכשירים נוספים על EM הרגיל, על מנת לאפשר תצפית זו בטמפרטורות מאוד נמוכות, אשר יוצרות עלויות משמעותיות נוספות. בנוסף, הגישה CEMOVIS מונע את השימוש של immunolabeling טכניקות, מאז נוגדנים בדרך כלל צריך להיות וטופחו על RT. לחלופין, אפשר לשלב ניתוח ultrastructural עם נהלים אימונוהיסטוכימיים ידי שימוש בגישה הקפאת-החלפה, שבמהלכה דגימות קבוע קריו הם הפשירו לאט תוך immerged ב כימיקלים קריו-מגן והם הen מוטבע שרפים מיוחדים, כגון Lowicryls. פוסט-הטבעת immunolabeling יכול להתבצע אז על חומר כזה 12. עם זאת, הקפאה-החלפה וטכניקות קריו-קיבוע הן זמן רב. הם דורשים התקנה של ציוד נוסף ועדיין דורשים דגימות להיחשף ממס אורגני ו מקבעים כימי שיכול לשנות את cytoarchitecture, למרות השימוש בטמפרטורה נמוכה 14, 15. לפיכך, למרות כל ההתקדמות הטכנולוגית הן בבית LM ורמת EM, קיבוע כימי של רקמת המוח, במיוחד עם acrolein, נשאר שיטה בעלות נמוכה זמן יעיל לשלב אימונוהיסטוכימיה עם EM 16.
בעשורים האחרונים, נעשו ניסיונות רבים למצוא תערובת של אלדהידים המספקים לשימור רקמות הטוב. לפני 1960, מקבע כימי רק כי נתן תוצאות מקובל EM היה tetroxide אוסמיום. עם זאת, tetroxide אוסמיום הוא רעיל ביותר ויקר, מניעת השימוש בו דרך מערכת כלי דם כדי לתקן איברים כמו המוח. Acrolein הוצג בשנת 1950 מאוחר כשיטה אמינה לשימור רקמות בעלי החיים מתאים תצפית EM של מבנים הסלולר 17. זה חודר לרקמה עמוקה יותר ומגיב מהר יותר מאשר אלדהידים אחרים כאשר נעשה שימוש עבור קיבוע על ידי טבילה ומאפשר שימור טוב של רכיבים ציטופלסמית, עם הצטמקות מינימאלית של הרקמה 17. תכונה כזו נותנת קיבוע acrolein יתרון ברור על פני אלדהידים אחרים בעת שימוש ברקמה טריה, על ידי מתן אפשרות לוקליזציה מדויקת יותר של חי תרכובות מולקולריות, כגון אנזימים וחלבונים אחרים 18. ואכן, שיטה זו הוכחה לאורך השנים כשיטה יעילה ונוחה בעלות נמוכה של קיבוע עבור להדמיה ברמה EM במינים רבים, כולל דו חיים מכרסמים, כפי שהוא יעיל stabiliפפטידים וחלבוני zes, שומרים antigenicity ומספקים יחסית ללא פגע ultrastructure כאשר נעשו שימוש בשילוב עם אלדהיד אחר קוֹבֵעַ 16, 18, 19, 20, 21. הפרוטוקולים לקיבוע acrolein במכרסמים יש ומאז כבר טופל ו שימוש נרחב, בעיקר על ידי קבוצת פיקל, ליישם immunolabeling כפול עבור 16 EM, 22. כמה קבוצות שהשתמשו קיבוע acrolein ברקמת המוח הפרימטים הלא-אנושי 23. עם זאת, למיטב ידיעתנו, יש רק פרוטוקול אחד שפורסם ביעילות המתאר קיבוע כימי עם acrolein ב פרימטים לא אנושיים התואמת EM immunolabeling 24.
במאמר זה, אנו מספקים שיטה קלה ואמינה כימיים יעיל לתקן אי-לזמזםמוח הפרימטים עם acrolein, המאפשר שימור לטווח ארוך בפוטנציה יחד עם טרום הטבעת EM immunolabeling והעביר בדיקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
משפט ואתיקה: כל הפרוטוקולים מעורבים בעלי חיים אושרו על ידי Laval Comité דה להגנת des animaux de l'אוניברסיטת ונעשו על פי המועצה הקנדית על מדריך Animal Care אל לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (אד 2.). הפרוטוקול המתואר כאן היה מותאם לבעלי חיים בוגרים של כ 800 גרם. הנפחים של מקבע צריכים להיות מותאמים בהתאם לגודל החיה.
1. הכנת פתרונות עבור Transcardiac זלוף
- הכן 1 ליטר של נתרן 50 מ"מ פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) פתרון על פי השלבים הבאים. הכן את הפתרון לכל היותר 24 שעות לפני זלוף ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- מדוד 800 מ"ל של מים מזוקקים בכוס L 1. מוסיפים 5.87 גרם של סודיום פוספט נטול dibasic (Na 2 HPO 4), 1.20 גרם של סודיום פוספט מונוהידראט monobasic (לאא 2 PO 4 · H 2 O), ו 9 גרםשל נתרן כלורי (NaCl). מערבבים לפזר.
- התאם את ה- pH 7.4 ידי הוספת בהדרגה 5 N NaOH. מוסיפים מים מזוקקים כדי להגיע בנפח כולל של 1 ל
זהירות: NaOH הוא תרכובת כימית מאכל. תלבש את אישי מגן ציוד מתאים (PPE;. מעיל מעבדה, כפפות, משקפי מגן, וכו ').
- כן 2 L של 4% paraformaldehyde (PFA) על פי השלבים הבאים. פתרון זה אמור להיות מוכן לכל היותר 24 שעות לפני הניתוח והמשיך ב 4 ° C עד השימוש.
- מדדו 1.5 ליטר של מים מזוקקים בכוס 2-L. להוסיף 23.48 גרם של נתרן פוספט נטול dibasic (Na 2 HPO 4) ו 4.80 גרם של סודיום פוספט מונוהידראט monobasic (לאא 2 PO 4 · H 2 O). מערבבים לפזר. מוסיפים מים מזוקקים כדי להגיע בנפח כולל של 2 ל
- מחממים את הפתרון מתחת למכסה המנוע אוורור עד שהטמפרטורה מגיעה לכ 45 - 55 מעלות צלזיוס. אין לחמם מעל 60 מעלות צלזיוס.
- מוסיפים בהדרגה 80 גרם של PFA לפתרון ומערבבים עד שהיא נמסה לחלוטין (כ 30 - 60 דקות). שמור ניטור הטמפרטורה כדי לשמור אותו מתחת 60 מעלות צלזיוס.
זהירות: PFA תנודתי מאוד, בצורת אבקה שלה. זה מאוד רעיל אם במגע עם עיניים או עור הוא מסוכן במקרה של שאיפה או בליעה. תלבש PPE ולהשתמש בזהירות מתחת למכסה המנוע אוורור. - מצננים את הפתרון עד 4 מעלות צלזיוס ולסנן. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- כן 1 ליטר של acrolein 3% ב 0.1 חיץ פוספט M (PB) על פי השלבים הבאים. פתרון PB צריך להיות מוכן לכל היותר 24 שעות לפני זלוף.
זהירות: Acrolein היא רעילה אם נשאף ויכולים לייצר נזק מיידי. זה גם מאכל רעיל מאוד אם נספג דרך העור. זה מסרטן ו מוטגנים. תלבש את PPE המתאים ולהשתמש מתחת למכסה המנוע אוורור.- מדוד 800 מ"ל של מים מזוקקים. מוסיפים 8.66 גרם של סודיום פוספט נטול dibasic (Na 2 4) ו 5.38 גרם של סודיום פוספט מונוהידראט monobasic (לאא 2 PO 4 · H 2 O). מערבבים עד שכל מלחים להתמוסס. מוסיפים מים מזוקקים כדי להגיע בנפח כולל של 1 ל שמור את הפתרון ב- C 4 °.
- לפני הניתוח, להעביר 900 מ"ל של הפתרון PB למיכל 1 L זכוכית ולהוסיף 30.94 מ"ל של תמיסת acrolein 97% מתחת למכסה המנוע אוורור. הוספת פתרון PB כדי להגיע בנפח כולל של 1 ליטר ומערבבים. סנן הפתרון ולשמור אותו 4 ° C.
2. Transcardiac זלוף המוח Dissection
- שמור פתרונות על הקרח במהלך ההליך הכירורגי כולו. הכן את המשאבה על ידי הנחת הצינור בפתרון הראשון לשמש (PBS; 50 מ"מ) וסיבוב המשאבה עד אין האוויר נשאר בצינור. עבור זלוף transcardiac של קוף מקוק, להשתמש במחט G 21 ולהגדיר את יצוא בכ 80 מ"ל / דקה.
- להרדים את החיה עם זריקה תוך שרירית של תמהילטבעה של קטמין (20 מ"ג / ק"ג), xylazine (4 מ"ג / ק"ג), ו acepromazine (0.5 מ"ג / ק"ג). שמרו את החיה תחת isoflurane (3%) סדציה.
- צרף את איברי גופו של בעל חי שולחן אוורור.
- עם אזמל, להסיר את העור לבתי השחי. חותכים את שרירי הבטן. השתמש במספריים כירורגית ההכבדות לחתוך את הצלעות רוחביות על ידי הימנעות האיברים החיוניים בזהירות.
- חותכים את הסרעפת עם מספריים כירורגיים ולהעלות את בית החזה כדי לחשוף את הלב. לאחר הסרעפת נחתכה, להמשיך במהירות, שכן בלב יפסיק לפעום בתוך דקות.
- הסר את קרום הלב עם להב סקלפל להכניס את המחט לתוך החדר השמאלי. עם אזמל, בזהירות לבצע כריתה קטנה העלייה הימנית. להתחיל את המשאבה במהירות 72 מ"ל / דקה והחזק את המחט במקום. במידת האפשר, להטות את החיה על מנת שיהיה ראשו ברמה נמוכה יותר מאשר הלב.
הערה: היזהר שלא לנקב מחצה interventricular כאשר החדרת המחט.- Rinsדואר בדם עם כ 300 מ"ל של PBS עד הריאות הם לבן ושום דם יוצא העלייה הימנית.
- עצור את המשאבה, במהירות להעביר את הצינור / צינור לפתרון acrolein 3%, ולהתחיל את המשאבה שוב. בהדרגה להגדיל את מהירות השאיבה כדי 80 מ"ל / דקה אחת בלב הפסיק לפעום. Perfuse כ 500 מ"ל של הפתרון acrolein.
- עצור את המשאבה, במהירות להעביר את הצינור פתרון 4% PFA, ולהתחיל את המשאבה שוב. צעד זה דורש כ 1 ליטר של PFA.
הערה: הקיבוע יושלם כאשר forelimbs הם נוקשים ואת הצוואר נוקשה. - חותכים את הראש בזהירות לנתח את המוח מתוך הגולגולת. תשמור על עצמך כדי לא להזיק למוח עם מכשירי הניתוח. זלוף הוא אופטימלי כאשר המוח הוא חיוור (ללא שמץ של דם) וקשיח (איור 1A).
- לטבול את המוח ללא פגע ב 4% PFA עבור 1 ש 'ב 4 מעלות צלזיוס.
- סדרתי לחתוך את המוח עם (C 4 °) קירור vibratomeבמישור הרצוי לתוך 50 חלקים עבים מיקרומטר ולאסוף אותם PBS (0.1 M) (איור 1B).
הערה: שלב זה יכול להתבצע בדרכים רבות על פי הפרוטוקול הרצוי. חצי כדור ניתן להפריד לפני vibratome חיתוך, או כל זמן. אם המוח הוא גדול מדי עבור פלטפורמת vibratome, אותו ניתן לחתוך לקוביות קטנות. לאחר שלב זה, ניתן לאחסן חלקים לתקופה ארוכה של זמן -30 ° C בתמיסה לרדיאטור עשוי 40% PB (50 מ"מ), 30% גליצרול, ו אתילן גליקול 30%.
3. טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה (איור 1C)
- הכן פתרון המניות 4 L של טריס שנאגרו מלוחים (TBS, 50 מ"מ, 7.6 pH) כדלקמן.
- מדוד 2L של מים מזוקקים בכוס 4 L, להוסיף 24.23 גרם של aminomethane trihydroxymethyl (Tham; C 4 H 11 NO 3), ומערבבים לפזר.
- התאם את ה- pH 7.6 עם כ 148 מ"ל של 1 N HCl. החומצה יש להוסיף עם cautiעל מנת למנוע הגעת pH מתחת 7.6. הנפח הכולל צריך להיות 4 ל
זהירות: HCl היא מאכל מאוד. תלבש את PPE המתאים.
- בחרו מקטעים (משלב 2.11) המכילים את האזור של עניין להיות מעובד על אימונוהיסטוכימיה EM.
- לשטוף את הסעיפים "פנויות" 3x ב PBS (0.1 M, pH 7.4) עבור 5 דקות ב RT לשטוף את הפתרון למניעת קפיאה.
- כן פתרון 0.5% של NaBH 4 מדולל PBS.
- לשקול 0.05 גרם של NaBH 4 ו לדלל אותו 10 מ"ל של PBS. אל תכסה. הכן את הפתרון הזה ממש לפני השימוש.
- דגירה סעיפים בפתרון NaBH 4 וטרי עבור 30 דקות ב RT. רוק בעדינות. אל תכסה.
- 3x Wash ב PBS עבור 10 דקות ב RT, נדנדה במרץ עד שאף אחד גז התגובה נשאר.
- כן פתרון לחסימה עבור EM עם 2% בסרום נורמלי המתאים ג'לטין דגים קרים 0.5% בדילול מלא PBS.
הערה: שאול הכמותd יחושב על מנת שיהיה מספיק את שלושת השלבים הבאים. השתמש בסרום עשוי מאותו המין חי אירוח הנוגדנים משני. הימנע משימוש בשיטות אחזור אנטיגן או תוספת של כמויות קטנות של טריטון (כדי להגביר את החדירה של נוגדנים), כמו שיטות אלה באופן משמעותי להתפשר על איכות הרקמה. - דגירת הסעיפים בפתרון החסימה עבור 1 ש 'ב RT. רוק בעדינות.
- כן פתרון נוגדן ראשוני מדולל הפתרון החוסם.
הערה: ריכוז של הנוגדן הראשוני הוא בדרך כלל זהה אימונוהיסטוכימיה LM, אבל לשקול בדיקות ניצוח עם ריכוזי נוגדנים שונים מראש, כפי שכמה נוגדנים ראשוניים עשויים שלא לפעול עם acrolein. אם כך, אפשר להשתמש בשילוב של glutaraldehyde (0.1 - 2%) ו 4% PFA זלוף transcardiac ולקבל תוצאות דומות. ייעל את הזמן ואת טמפרטורת דגירה גם כן. - דגירת מקטעי פתרון נוגדן ראשוניהלילה ב RT עם נדנדה עדינה. השתמש זמן דגירה נבדק בעבר וטמפרטורה.
- לשטוף את הסעיפים 3x ב PBS עבור 5 דקות ב RT עם נדנדה עדינה.
- כן 1: פתרון 1000 של נוגדנים משני biotinylated מדולל הפתרון החוסם.
הערה: הנוגדנים משני חייבים להישאל נגד מיני המארח השתמשו כדי ליצור את הנוגדן הראשוני. - דגירת מקטעי פתרון נוגדנים משני עבור 1.5 שעות ב RT. רוק בעדינות.
- כן פתרון avidin ביוטין-peroxidase (ABC) לפחות 60 דקות לפני סוף דגירת הנוגדנים משני.
- השתמש פיפטה מכויל למדוד 8.80 μL / מ"ל של פתרונות A ו- B ו- לדלל אותם PBS.
- רוק בעדינות במשך לפחות 60 דקות ב RT כדי לאפשר להשלים מחייב בין מולקולות avidin ו ביוטין.
- לאחר הדגירה בתמיסת נוגדן משנית, לשטוף 3x ב PBS עבור 10 דקות ב RT.
- דגירת סעיפי ABC כךlution עבור 1 ש 'ב RT. רוק בעדינות.
- שטפי פעם ב PBS פעמים ב TBS עבור 10 דקות ב RT עם נדנדה עדינה.
- כן פתרון חדש של 0.05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB) עם 0.005% H 2 O 2 מדולל TBS.
- לשקול 12.5 מ"ג של DAB ו לדלל אותו 25 מ"ל של TBS קר. להגן מפני אור.
זהירות: אבקת DAB היא מאוד תנודתי מזיקים אם נשאף. זה הרסני טרטוגניות. לכן, נשים הרות או מיניקות לא צריכות לתפעל את המוצר הזה, גם כאשר מדולל. השתמש מסכת N95 כאשר מניפולציה וללבוש PPE. - סנן הפתרון ולהוסיף 4.5 μL של 30% H 2 O 2 רק לפני השימוש.
- לשקול 12.5 מ"ג של DAB ו לדלל אותו 25 מ"ל של TBS קר. להגן מפני אור.
- סעיפי דגירה בתמיסת DAB עבור 3 עד 7 דקות ב RT. רוק בעדינות.
הערה: המשקע החום לא צריך להיות כהה מדי כדי למנוע רמה גבוהה של מכתים רקע. זמן הדגירה צריך להיות מותאם בהתאם. - עצור את התגובה על ידי שטיפה פעמיים במהירותב קר TBS, אז פעמים עבור 10 דק 'ב TBS הקר ב RT, ואחריו פעמים על ידי עבור 10 דק' ב PB, עם נדנדה עדינה.
הערה: השימוש PB (ולא PBS) הוא קריטי כדי לחסל כל זכר של NaCl, כפי שהוא יגיב עם קריסטלים אוסמיום וצורה.
4. Osmification והטבעה עבור אלקטרונים מיקרוסקופים תצפית
- הכן תמיסה של tetroxide אוסמיום 1% (OSO 4) מדולל PB. להגן מפני אור.
זהירות: אוסמיום היא רעילה ביותר ויש לא לבוא במגע עם העור, העיניים, או הפה לא צריך להיות בשאיפה. זה יכול לגרום למוות במקרה של בליעה. זה אמור לשמש רק מתחת למכסה המנוע אוורור ועם PPE המתאים. - דגירת מקטעי פתרון 4 OSO עבור 30 דקות ב RT ובמנוע האוורור (ללא תסיסה) ומכסה אותם בנייר אלומיניום כדי להגן עליהם מפני אור. לחלוטין לשטח את הסעיפים לפני הוספת הפתרון 4 OSO.
הערה: הסעיפים להיות מאוד חשוכים RIGID וצריך לטפל בהם בזהירות, לאחר שלב זה. - כן שרף אפוקסי דוחה המים במהלך osmification.
- להוסיף כמויות מתאימות של כל רכיב של תערובת אפוקסי שרף (20 גרם של שרף אפוקסי, 20 גרם של המקשה, 0.6 גרם של מאיץ ו 0.4 גרם של plasticizer) כדי כוס פלסטיק גדולה. מערבבים עם מקל עץ או טפטפת פלסטיק עד לצבע חום הומוגני מתקבל.
הערה: חשוב מאוד להשתמש הפרופורציה המדויקת של כל רכיב. - העבירו כמויות שוות כוסות אלומיניום בגדלים מתאימים, בהתאם למספר סעיפים כדי להיות מעובד. אפשר אותו לנוח.
- להוסיף כמויות מתאימות של כל רכיב של תערובת אפוקסי שרף (20 גרם של שרף אפוקסי, 20 גרם של המקשה, 0.6 גרם של מאיץ ו 0.4 גרם של plasticizer) כדי כוס פלסטיק גדולה. מערבבים עם מקל עץ או טפטפת פלסטיק עד לצבע חום הומוגני מתקבל.
- לשטוף את הסעיפים osmificated 3x ב PB עבור 10 דקות ב RT עם נדנדה במהירות נמוכה.
- מייבש את הסעיפים הבאים בסדרה של אתנול מדורג עבור 2 דקות כל אחד: 2 פעמים באתנול 35%; 1 זמן כל אחד 50, 70, 80, 90, ו 95% אתנול; ו 3x ב 100% אתנול.
- העברת חלקים ל מבחנות זכוכית להשלמת dehydratiעל התהליך על ידי דוגרים בסעיפים 3 פעמים במשך 2 דקות ב פרופילן אוקסיד.
זהירות: פרופילן אוקסיד הוא ממיס אורגני נדיף ורעילים מאוד. זה יכול לגרום לנזק רציני בעיניים ובעור במקרה של מגע או אם נשאף או בליעה. זה סווג חומר מסרטן 2 כיתה. זה אמור לשמש רק מתחת למכסה המנוע אוורור ועם PPE. זהו גם דליקים מאוד וצריכים להישמר הרחק מכל מקור חום.
הערה: לפני שלב זה, סעיפים יועברו בזהירות צלוחיות זכוכית, מאז פרופילן אוקסיד הוא ממיס אורגני אינו עולה בקנה אחד עם פלסטיק. בשלב זה, חלקים מאוד שביר וצריך לטפל בהם בזהירות. סעיפים ניתן להעביר לחילופין צלוחיות זכוכית לפני צעד 4.5. - העברת חלקים בזהירות, אחד אחד, בתוך כוסות אלומיניום ולהימנע ממגע עם אוויר ככל האפשר. שטוח להטביע את הסעיפים שרף אפוקסי דוחה מים מעורב בעבר דגירה אותם בן לילה תחת ventinברדס גרם ב RT.
הערה: בשלב זה, את הסעיפים הם לגמרי מיובש מאוד שביר וצריך לטפל בהם בזהירות. - באמצעות שמן מינרלים, להכין שקופיות זכוכית מצופי גריז יחד עם coverslips פלסטיק משומן.
- לרכך את השרף על ידי דוגרי כוסות אלומיניום ב 60 מעלות צלזיוס למשך 12-15 דקות לכל היותר. בזהירות לשטח את הסעיפים בצד המשומן של שקופית הזכוכית. מניח את coverslip משומנת ובזהירות לדחוף את כל אוויר נותר.
- דגירת השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
הערה: חשוב מאוד לא יעלו על 48 h זמן דגירה, כמו השרף יהפוך קשה מדי. - הסר את coverslip פלסטיק.
לדוגמא כנה 5. עבור Ultrathin חתך תצפית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים
- להשתמש במשקפת כדי למצוא באזור של העניין לחתוך חתיכה מרובעת קטנה של כ 1 מ"מ 2 עם אזמל.
- קובץ קצה גוש שרף ודבק quחתיכת adrangular גבי זה (איור 1C). אפשר הדבק להתייבש לפחות 1 h או לילה לפני חתך.
- שימוש ultramicrotome, לחתוך את פיסת מרובע לתוך 80 חלקים מיקרומטר בעובי (איור 1D).
- מניח את גוש השרף ב סיפון ultramicrotome במצב האנכי, באמצעות סכין גילוח חד, בהדרגה לחתוך בכל צד של הגוש שרף להרכיב טרפז עם צדדים חלקים.
- שים את סיפון מעמדה האופקית ולסובב את הבלוק עד שהצד הארוך ביותר של הטרפז פונה כלפי מטה.
- השתמש בכלי חיתוך יהלום או סכין זכוכית לקצץ פני השטח של יצירה המרובעת. הגדר את ultramicrotome לקצץ 300 מיקרומטר חלקים עבים על 1 מ"מ / s. התאם את הסכין להיות אנכית במקביל ליצירה מְרוּבָּע ולהציג זווית אופקי קטן מאוד של כ 1 °.
הערה: זווית זו תאפשר למשתמש לגשת רקמות כמעט במקביל לפני השטח של bלנעול, שבו אלמנטים immunolabeled נוטים יותר למצוא. בעת שימוש בפרמטרים הללו עם כלי חיתוך היהלום, שרף מציג צבע לבן מבריק. כאשר הרקמה מתבצעת לחתוך, זה משתנה לצבע סגול או ירקרק. - השתמש בסכין יהלום אולטרה 45 ° מאובזר עם סירה המלאה במים מזוקקים לקצץ 80 חלקים עבים מיקרומטר, להחליק חלקים על ידי העברה עליהם עם חתיכת סופג נייר הטה קסילן, וכן לאסוף קטעים סדרו על רשתות חריץ ניקל formvar מצופה או רשתות נחושת חשופים 150 רשת (איור 1E).
- מניחים את רשתות בתוך קופסת אחסון רשת.
- כתם הרשתות עם ציטראט להוביל.
- השתמש במזרק 5 מ"ל ומסנן מזרק 0.2 מיקרומטר להכין 1: פתרון 1 של מניות פתרון ציטראט להוביל מסוננים ומים מזוקקים מסונן. להגן עליו מפני אור.
הערה: הפתרון המניות של ציטרט להוביל צריכה להיעשות טרי מדי חודש, כדי למנוע היווצרות של depos מוצקשֶׁלָה. עיין גיליון נתונים מהותיים עבור מתכון המניות. בנוסף, אם סדרות רבות של רשתות צריכות להיות מוכתמות, לשנות את הפתרון בדילול כאשר הוא הופך להיות חלבי. - מניח כל רשת על ירידה של הפתרון המדולל, עם הסעיף במגע עם הפתרון. דגירה של 3 דקות.
- להשתמש בפינצטה קטנה להחזיק את הרשת, וכן לשטוף ביסודיות את זה בשתי כוסות המכילות מים מזוקקים.
- הסרה של עודפי מים באמצעות נייר סופג בעדינות. אחסן את הרשתות בקופסא לרשת. חכה 30 דקות לפני בחינת הסעיפים ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים (TEM; איור 1F).
- השתמש במזרק 5 מ"ל ומסנן מזרק 0.2 מיקרומטר להכין 1: פתרון 1 של מניות פתרון ציטראט להוביל מסוננים ומים מזוקקים מסונן. להגן עליו מפני אור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בחלק זה, אנו מציגים תוצאות נציגים שהושגו בעקבות התצפית, ברמת EM השידור, של רקמת המוח הפרימטים immunostained הקבוע כימי בתערובת של acrolein 3% ו 4% PFA. השגנו שימור טוב של ultrastructure, כפי שצוין על ידי מעטפת המיאלין יחסית ללא פגע והדמיון המודרך המסודר של ממברנות כפולות (איור 2 א). קשרים סינפטיים, יחד עם אלמנטים עצביים מן המיקרו-סביבה, ניתן לזהות בקלות (איור 2B). אלמנטים עצביים שכותרתו עם diaminobenzidine (DAB) immunoprecipitate מוכרים ברמה EM ידי הציטופלסמה או axoplasm פָּטוּם שלהם. הממברנה ואת המשטח החיצוני של אברונים גם מכוסות בדרך כלל עם משקע האלקטרונים צפופים (איור 3).
בניסוי הספציפי הזה, השתמשנו אגא נוגדניםInst טרנספורטר הסרוטונין (בהלבשה), acetyltransferase כולין (צ'אט), או טירוזין hydroxylase (TH) כדי להמחיש אלמנטים עצביים immunolabeled ב חיצוני (GPe) או פנימי (GPI) קטע של pallidus גלובוס קוף סנאי (איור 3). על מנת לעשות זאת, השתמשנו בשילוב של חומרים כימיים מקבעים משמרים antigenicity וכן ultrastructure, המאפשר חקירת מורפולוגי מפורטת. למרות נוגדנים רבים ניתן להשתמש עם פרוטוקול זלוף transcardiac שתואר לעיל, אנו ממליצים למשתמשים לבצע בדיקות ריכוז אופטימיזציה מראש, שכן כמה נוגדנים ראשוניים ידועים שלא לספק immunolabeling האופטימלית עם קיבוע acrolein. לחלופין, כאשר נוגדנים אינם מספקים immunolabeling אופטימלית עם קיבוע אקרולאין, דילול של 0.1 - 2% glutaraldehyde ב 4% PFA ניתן להשתמש עבור זלוף transcardiac. הוא מספק איכות רקמות יחסית שווה רקמת המוח קבוע acrolein עם antigenicity נשמר עבור רביםנוגדנים (איור 4).
לבסוף, אנו מספקים דוגמאות אופייניות של photomicrographs EM שהושג בעקבות מניפולציות בלתי הולמות. מאמין בכך קיבוע עניית נדני המיאלין שינו (איור 5 א, ב) וקשיים להדמיה של ממברנות הכפולות של neurites (איור 5 ג, ד), למנוע זיהוי וניתוח אמין של אלמנטים עצביים שכותרתו ללא תווית. זמן דגירה מופרז פתרון DAB יוצר רקע מוגזם מכתים הלא ספציפי שיכולה פוטנציאל ליצור תוצאות חיוביות שגויות. רקע או מכתים הלא ספציפי לפעמים נראה כמו מכתים שלם של אלמנטים עצביים (איור 6 א, ב), אבל לעתים קרובות יותר כמו רבים ממוקמים קרוב אלמנטים עצביים צבעוניים (האיור 6C, D). שימוש אבקה בפתרון חסימת המשנה באופן משמעותי את איכות הרקמה. זה עלול להוביל חסראברונים אלמנטים שכותרתו (איור 7 א) או השפלה של נדני המיאלין (7 ב איור) ואת קרום התא (7C איור), עיבוד כלשהו פרשנות חריפה של המיקרו-סביבה קשים. לבסוף, אך נכשל בתהליך osmification, כגון באמצעות פתרון שטיפה המכיל נתרן כלורי, מייצר תוצאות אמינות שבו המבנים הסלולר קשים להבחין (איור 7D).
איור 1: שרטוטים של צעדים חיוניים לפרוטוקול. מוח קוף (A) נחתך למקטעים סדרו עם vibratome קירור (B). זה מעובד מכן עבור טרום הטבעה מיקרוסקופיה אימונוהיסטוכימיה ו אלקטרונים, שלאחריו באזור של עניין מושם על קצה גוש שרף (C) וחותכים 80 secti ננומטר עבהons עם ultramicrotome (D). סעיפי Ultrathin נאספים אז על רשתות נחושת רשת חשופות 150 או רשתות ניקל-מצופה formvar (E), מוכתמים ציטראט להוביל ומוכן לשים לב תחת מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (F). ברי סולם: 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: רקמת המוח הפרימאטים השתמרו היטב לאחר Acrolein-PFA Transcardiac זלוף. Micrographs אלקטרונים של קוף סנאי (sciureus Saimiri) ברקמת המוח של GPI (א) ו GPe (B) נציג מראה השתמרו היטב בחומר לאחר ביצוע זלוף-PFA acrolein transcardiac ואת הטכניקה אימונו-diaminobenzidine. על ×נדן ילין של אקסונים (א) הוא יחסית ללא פגע (ראה Arrowhead ב א), ואת ultrastructure הכללי נשמר היטב A ו- B. דנדריטים פרופילים (ד), אקסונים unmyelinated קטן (א), ו ורידים האקסון (AV) יכול בקלות לְהִזדַהוֹת. דוגמא דליות האקסון הקמת קשר הסינפטי סימטרי (בין חיצים) עם פרופיל דנדריטים (ד) מוצגת B. בר סולם: 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: קטעים מתוך סנאי קוף GPe ו GPI immunolabeled עבור כולין acetyltransferase (צ'אט), סרוטונין טרנספורטר (בהלבשה), ו טירוזין hydroxylase (TH) באמצעות טכניקה אימונו-diaminobenzidine. חיסוניאלמנטי שכותרתו ניתן לזהות בקלות על ידי הציטופלסמה או axoplasm שלהם מלא משקע DAB אלקטרונים צפופים. פרופילים דנדריטים שכותרתו הם מוכרים על ידי microfilaments המלא, כפי שניתן לראות, שבו דנדריט-immunostained צ'אט GPI מקבל מגע סינפטי (בין חיצים) מתוך דליות האקסון ללא תווית (AV). מיקרוסקופ אלקטרונים ב B מראה האקסון myelinated ב GPe עם נדן יחסית ללא פגע המיאלין אשר axoplasm הוא immunolabeled עבור TH. הדוגמא ב- C מראה דליות האקסון GPI immunolabeled עבור בהלבשה ו נתפסה להקים קשר סינפטי סימטרי (בין חיצים) עם דנדריט (ד). בדוגמה זו, DAB לזרז קווי הממברנה ואת המשטח החיצוני של אברונים (מיטוכונדריון ואת שלפוחית סינפטית). דליות האקסון מוצגות D נצפו GPe ו immunolabeled עבור TH ומייצגות דוגמא DAB לזרז לחלוטין מילוי axoplasm, עם שלפוחית סינפטית להיות גלוי אך יותר קשה לשרטט. אלמנטים של המיקרו-סביבה ניתן לזהות בקלות, כפי שהודגם על ידי אקסונים myelinated ו unmyelinated (א) ו דנדריטים מזדמנים (ד) סביב דליות האקסון שכותרתו. Micrographs אלקטרונים משתנים מן 25, 26, 27. בר סולם: 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: דוגמאות של רקמות המוח הפרימאטים לאחר Glutaraldehyde-PFA Transcardiac זלוף. Micrographs אלקטרונים נציג של קוף מקוק (fascicularis מאכאכה) רקמת המוח של GPe (א) ו GPI (BD) לאחר performi transcardiac זלוף ng עם 0.2% glutaraldehyde מעורבב עם 4% PFA וטכניקה אימונו-diaminobenzidine עם נוגדן נגד טרנספורטר הסרוטונין (בהלבשה). כמו באיור 2, immunolabeled אלמנטים יכולים להיות מזוהים על ידי הציטופלסמה לבין axoplasm שלהם מלא משקע DAB אלקטרונים צפופים. Ultrastructure כללי הוא יחסית ללא פגע ואלמנטים של המיקרו-סביבה ניתן לזהות בקלות, כפי שמוצג על ידי אקסונים myelinated ו unmyelinated (א) ו דנדריטים מזדמנים (ד) ו- ורידים האקסון (AV) סביב ורידים האקסון שכותרתו, כמתואר באיור 2. עם זאת, מציין את חוסר העקביות באיכות ultrastructure, כונתה על ידי ממברנות פלזמה מוגדרות היטב (ראשי חץ), אבל מעטפת המיאלין נפגע יחסית (חץ). בר סולם: 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
: לשמור-together.within-page = "1"> 
איור 5: דוגמאות של רקמות מוח הפרימאטים שהושגו בעקבות זלוף Transcardiac מוצלח. תוצאות מתוך קיבעון כימי מוצלח מוצגות כאן קוף הסנאים GPI (A - B) ו GPe (C - D) perfused transcardially עם פתרון שטיפת 0.9% NaCl ו תערובת של% PFA 4-קר כקרח 15% picric חומצה מדוללת ב 0.1 M PB (pH 7.4). והמוח היה שלאחר קבוע 1 שעות ב 4 ° C ב 4% PFA ו 30% סוכרוז וחותך 60 מיקרומטר חלקי sagittal עבים עם vibratome קירור. יכולה להיות מוכרת Inappropriately רקמת מוח קבוע על ידי מעטפת המיאלין פגומה (A ו- B, ראשי חץ), כמו גם על ידי ממברנות פלזמה מטושטשות או לא מוגדרות (C ו- D, לראות ראשי חץ עבור דוגמאות). אלמנטים עצביים שונים הם DIFficult לזהות, עיבוד כלשהו פרשנות ultrastructure האמין. בר סולם: 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: דוגמאות immunolabeling לפטפט ללא ספציפית סנאי קוף GPe. רקע מכתים או immunolabeling שאינו ספציפי לפעמים מופיע תחת מכתים EM כמו החלקי של אלמנטי הסלולר גדולים, כפי שמודגם - B (ראשי חץ). מכתים נוקבים כזה מופיע בתדירות גבוהה יותר על פני השטח של חלקי immunostained. דוגמאות נוספות immunolabeling שאינו ספציפי כוללות התצפית התכופה של אלמנטים קטנים מאוד מעוררת אקסונים קטנים, unmyelinated חלקית או לחלוטין מלאים DAB וממוקמים קרוב מאוד אחדnother, כפי שהוכח על ידי ראשי חץ ב- C ו- D. בר סולם: 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: פגומים סנאי קוף GPe רקמות לאחר משגים ב לדוגמא כהכנה מיקרוסקופית אלקטרונים. שימוש אבקה, כגון טריטון X-100, הפתרון החוסם, אפילו בריכוז נמוך של 0.02%, משמעותי משנה את היושרה של ultrastructure ידי פגיעת הציטופלסמה של דנדריטים (א) או מעטפת המיאלין של אקסונים (B ). האלמנטים עצביים שונים הם גם קשה להבחין בין זה לזה (C), מאז ממברנות פלזמה ניזוקים קשה לשרטט. תהליך osmification זה ALSo צעד חשוב לקראת המדגם. שימוש נתרן כלורי בשטיפת פתרונות (ד) משנה את הקיבוע של הרקמה, עיבוד קשה לניתוח שלאחר מכן. בר סולם: 800 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול אמין זלוף transcardiac של פרימטים לא אנושיים אימונוהיסטוכימיה טרום ההטבעה המתאימה לבדיקת מדגם EM. למרות טיפוסי קריו-EM, כגון CEMOVIS, מספק שימור טוב של ultrastructure המוח, זה גם מגביל את השימוש אימונוהיסטוכימיה 12. טכניקות אחרות, כוללים החלפת קריו וטכניקת Tokuyaso, לאפשר שיתוף של פוסט-הטבעת אימונוהיסטוכימיה, אך הטכניקות הללו הן יקרות בשל התקנים נוספים הדרושים בתהליך ויכולות להיות רב זמן ומיומן-מאתגר 12, 14, 15. יתר על כן, על מנת ביעילות להשתמש בשיטה קריו-קיבוע, המדגם צריך להיות קטן יחסית (עד 200 מיקרומטר עובי בעת שימוש בלחץ גבוה מקפיא 28 ו 10 מיקרומטר בלחץ אטמוספרי 29). באופן אידיאלי, כדי לקבל טובותתוצאות עם קריו-קיבוע של רקמת המוח הפרימטים, המדגם צריך להילקח ביופסיה, גורמת לבעיות במציאת המיקום המדויק של האזור של עניין. בעיה זו חייבת לעקוף באמצעות קואורדינטות stereotaxic. הקיבעון הכימי עם acrolein וטכניקה טרום הטבעה המוצעת לעיל מספק שיטה קלה, בעלות נמוכה, זמן יעיל, ואמינה עבור הכנת מדגם של רקמת מוח הפרימטים ו immunolabeling עבור EM. על ידי ביצוע השלבים הבאים, אחד יהיה להשיג ultrastructure השתמרה היטב יחד עם antigenicity כדי לאפשר את immunolabeling של רוב החלבונים. עם זאת, קיבוע כימי עבור EM גם יש חסרונות. ראשית, בעוד פתרונות מקבעים כגון acrolein לשמר את הפרטים מורפולוגי של רקמת המוח, יתכן כי כמה שינויים מורפולוגיים להתרחש במהלך תהליך הקיבוע הכימי ולשנות את התוצאות בהשוואה לאלו שהיו מתקבלים עם CEMOVIS או טכניקות-החלפת קריו. שנית, תהליך הקיבועהתייבשות לאחר דרושים שרפו הטבעה להסיר את רוב הנוזלים התאיים וסוחטי מרכיבים תאיים יחד, גרימת הצטמקות של רקמות אשר משנה הגודל שלהם באופן משמעותי וצורה לעומת תאים קבועים קריו 21, 30. עם זאת, קיבוע אלדהיד שמש בהצלחה במעבדות רבות ברחבי העולם, והוא מקובל בספרות כשיטה אמינה לחקר תכונות ultrastructural של נוירונים ותאי גלייה, למרות כאמור חששות 21, 30, 31, 32.
לשם השוואה עם השיטה המתוארת לעיל, אימונוהיסטוכימיה postembedding נחוצה עבור דגימות קבועות קריו המוטבעים שרף methacrylate, היא פחות רגישה זיהוי של אנטיגנים מערכת עצבים מרכזיים הוא מוגבל 14 >, 33. עם זאת, קיבוע אלדהיד גם יש מגבלות לגבי antigenicity. לכן, חשוב לבדוק את הספציפיות של הנוגדנים עבור פרוטוקול קיבוע כימי נתון ברמת LM לפני תחילת הכנת EM. איכות אימונוהיסטוכימיה על רקמת מוח קבוע acrolein גם תלוי שביר בעבר אג"ח אלדהיד החזק נוצר על ידי הקיבוע הכימי. צעד זה יכול להיות מושגת על ידי דוגרי הסעיפים לפני אימונוהיסטוכימיה עם borohydride נתרן (ראה שלבים 3.3 - 3.5). השמטת צעד זה בהחלט תגרום immunostaining הכי מוצלח 34. אם נוגדנים כדי לשמש לא לתת מכתים אופטימלי על חלקים במוח קבוע עם acrolein, אפשר להשתמש לחילופין glutaraldehyde (0.1 - 2%) מדולל 4% PFA. זה הוכח היטב לשמר ultrastructure המוח תוך שמירת antigenicity מספיק עבור נוגדנים רבים כדי לספק רקמת המוחמתאים לאחסון ארוך טווח עם שינויים מינימאליים 20, 21, 35, 36, 37. אפשר גם להשיג קיבוע יחסי טוב antigenicity מתאים EM עם PFA לבד על ידי הרמת pH המשמעותית של הפתרון, אבל שילוב של יותר מ מקבע אחד במהלך זלוף ספק תוצאות טובות יותר 34, ומחקרים תומכים כי קיבוע PFA לבד בדרך כלל לייצר גרוע רקמה נשמרה לבדיקת EM 38, 39. עם זאת, במקרים נדירים, antigenicity קשה מאוד לשמור, קיבעון PFA לבד נשאר האפשרות המעשית היחידה לבדיקת EM.
צעדים רבים בפרוטוקול זה צריך להיות מלווה בזהירות על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר. למשל, הכנת פתרון 4% PFAחייבת להתבצע בטמפרטורה מעל 45 מעלות צלזיוס על מנת לאפשר את אבקת PFA להתמוסס, אבל זה הכרחי כי נשארה בטמפרטורה מתחת 60 ° C. אחרת, הפתרון PFA depolymerizes לתוך פורמאלדהיד וחומצה פורמית, אשר פותר את הרקמה באופן שונה ויוצר תמיסה חומצית שיכול לשנות איכות הרקמה באופן משמעותי 40, 41. בנוסף, זה קריטי, כי הצעדים זלוף להתבצע במהירות פעם לסרעפת נחתך, מאז היפוקסיה ו hypercapnia תייצר שינויים פיזיולוגיים בלתי הפיך למוח שיכול לשנות את איכות ותקינות של הרקמה 31. קיבוע פגום יכול להזיק לשימור רקמות מוח לצמיתות לשנות את ultrastructure של רקמות, כגון ממברנות פלזמה, המיטוכונדריה וסינפסות. לפיכך, הכנת פתרון וצעדי זלוף צריכות להתבצע בזהירות. preparatio מדגם EM מוצלחn גם תלוי במידה רבה על פוסט-קיבוע טוב tetroxide אוסמיום. ואכן, זלוף ישירה עם tetroxide אוסמיום תוארה לייצר רקמות שלמות סבירה לצורך השגחת EM 21, 39. עם זאת, הבדלים רבים במונחים של כמות של שטח תאי והופעת קרום הפלזמה בין perfused-אוסמיום וחיות-perfused אלדהיד כבר שם לב. יתר על כן, השחרת והתקשות של רקמות לאחר זלוף אוסמיום שניתנו הסרת המוח מהגולגולת, לנתיחה שלאחר מכן, ואת הבידול בין חומר לבן ואפור יותר קשה, העדפת זלוף אלדהיד לשימור רקמות טובה יותר ומניפולציה קל 21. קיבוע אלדהיד לבד מופיע כדי לצמצם את המרחב התאי, אשר משנה את שלמות הרקמה ונותן את הרושם של צומת הדוקים שבו שטח תאים יש לראות, ובכך נכשל להראותmicrographs אלקטרונים מקובל גם לאחר 42 מכתים ציטראט להוביל. עם זאת, postfixation ב tetroxide אוסמיום התהפך המצב הזה בכך שהוא מאפשר הפרדה ברורה ביותר בין אלמנטי רקמות, אשר היא הכרחי עבור הזדהותם 42, ובכך בבירור להצדיק את החשיבות של ביצוע צעדי osmification (צעדים 4.1 - 4.2) בזהירות.
התנאים וריכוזי לפיו הפעולות הבאות מתבצעות נבדקו במעבדה שלנו, במיוחד עבור טרום הטבעה אימונוהיסטוכימיה באמצעות DAB כמו המשקע על חלקים במוח הפרימטים. מיומנות-מאתגר, פעמי אימונוהיסטוכימיה אמנם אפשרית באמצעות פוסט-הטבעה אימונוהיסטוכימיה עם זהב חלקיקי 43. אלקטרון-הצפוף DAB משקע המתקבל לאחר טכניקת אימונו-diaminobenzidine המוצע כאן היא קלה מאוד לזהות ברמת EM, שכן הוא מתאר ממברנות פלזמה והחוצהאה משטחים של אברונים, תוך שהוא מאפשר זיהוי של רכיבים-הסלולר משנה, כגון מיטוכונדריה קשרים סינפטיים. בנוסף, פעם הטכניקה הנוכחית היא שולטת אימונוהיסטוכימיה יחיד, אפשר לבצע אימונוהיסטוכימיה כפול על ידי שילוב DAB לזרז את חלקיקי זהב, אשר יותר להבחין בקלות זה מזה מאשר חלקיקי זהב בגדלים שונים. אנחנו ממליצים לעשות בדיקות מחמירות של סגוליות נוגדנים, ריכוזיים אוסמיום, וזמן דגירה וטמפרטורה לפני העיבוד חלק במוח עבור EM. הפרוטוקולים עבור הטבעה מראש אימונוהיסטוכימיה כפול עבור EM פורסמו בעבר וניתן להתאים עבור רקמת המוח הפרימטים 16.
לסיכום, פרוטוקול זלוף transcardiac עבור פרימטים לא אנושיים המוצגים מאפשר לעיל עבור אחסון לטווח ארוך של חלקים במוח שיכולים לאחר מכן לשמש אימונוהיסטוכימיה הטבעה-מראש EM. SectioNS שהתקבל מתאים גם ללימודי neuroanatomical ברמת LM. לפיכך, באמצעות פרוטוקול מתאים הן EM ו- LM, אפשר להקטין את מספר בעלי החיים המשמשים, בעלות-יעיל שיקול מוסרי. זה גם מאפשר השוואה ישירה בין תוצאות המתקבלות בבית LM ורמות EM באותו החי מאפשר שימוש אור הקורלטיבי ואלקטרון מיקרוסקופי (קלם) מחקרים. מחקרים קלם התמקדו בעיקר על השימוש בעכברים מהונדסים גנטי לבטא חלבוני ניאון, כגון EGFP, אשר יכול לאחר מכן להיות מתויגת עם משקע אלקטרונים צפופים וצופים ברמת EM 44. לחלופין, כדי לעקוף את הבעיה של אימונוהיסטוכימיה, קריו-קיבוע ניתן לשלב עם זריקת intraneuronal של סמנים אלקטרון-צפוף, כגון נקודות קוונטיות 45, לפני ההקפאה, המאפשרות הדמיה ברמת EM 46. עם זאת, נקודות קוונטיות הן לא ביולוגיות, והשימוש בם הוא יקר זמן רב בשל מנגנון ההקפאה הנוסף הנדרש עבור הכנת רקמה שלאחר מכן. למרות הטכניקות הללו עדיין מעדיפים קריו-קיבוע ולהקפיא-החלפת שיטות, יש כמה התפתחויות לשימוש תגיות כימיות על חצי דקה (300 ננומטר) קטעים לתייג חלבונים תאיים שונים עם fluorophores הסינטטי, אשר יכול להיות מתואם עם ניתוח EM 47 . טכניקות המאפשר, למשל, הקורלציה בין לוקליזציה האקסון אחד ספציפית באמצעות קרינה ואת הקשר הסינפטי שלה עם הנוירונים של מבנה יעד נתון באמצעות EM, הם דווקא מבטיחים להבנת הארגון של מערכת העצבים, במיוחד אצל הפרימטים. במקרה זה, קיבוע acrolein מומלץ להעדיף על פני glutaraldehyde, כפי שהאחרון יהיה לייצר autofluorescence שיכול לשנות את להדמיה התקינה של מבנים במוח ברמת LM. עם זאת, מעט מאוד מחקרים מסוג זה בוצעו אצל הפרימטים, מ 'ostly בשל אתגרים טכניים ואת העלות הגבוהה שניסויים כאלה להטיל. לפיכך, התפתחויות חדשות נדרשות מחקרים קלם מוצלחים בעלות הנמוכה אצל הפרימטים, כגון שיפור שיטות קיבוע או באמצעות תגים כימיים גלויים הן ברמה של LM ורמות EM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC, 401,848-2011 כדי MP). MP קיבל פרס הקריירה מן Fonds דה משוכלל ונדיר קוויבק-Santé (FRQ-S). LE היה הנמען של דוקטורט מן FRQ-S (FRQ-S 14D 29,441). אנו מודים מארי ג'וזי Wallman לקבלת סיוע טכני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) | Fisher scientific | S374-500 | |
| Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4·H2O) | EM Science | SX0710-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher scientific | S271-3 | |
| Hydroxymethyl aminomethane (THAM) | Fisher scientific | T370-500 | |
| HCl | EMD | HX0603-3 | 1 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection. |
| NaOH | EMD | SX0590-1 | 5 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection. |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection. |
| Acrolein (90%) | Sigma | 110221 | 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection. |
| Autopsy venting table | Mopec | CE400 | |
| Electronic perfusion pump | cole parmer | masterflex L/S 7523-90 | |
| Needle (perfusion) | terumo | NN-1838R | 18 G 11/2 |
| Needle | terumo | NN-2713R | 21 G 1/2 |
| Ketamine | 20 mg/kg | ||
| Xylazine | 4 mg/kg | ||
| Acepromazine | 0.5 mg/kg | ||
| Scalpel | |||
| Scalpel blades | Feather lance | 201011 J9913 | No.22 for surgery and No. 11 for EM |
| Surgical scissors | |||
| Rongeurs | |||
| Vibratome | Leica | VT 1200S | Calibrate blade before each use, when the device allows it |
| Vibratome razor blade | Gillette | GIN 642107 | |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | 30% dilution |
| Ethylene glycol | Fisher scientific | E178-4 | 30% dilution |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | S-9125 | |
| Normal horse serum (NHS) | Jackson immunoResearch Laboratories | 008-000-121 | 2% dilution |
| Cold-fish gelatin | Aurion | 900.033 | 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40% |
| Primary antibody, SERT | Santa Cruz biotechnology | SC-1458 | 1/500 dilution |
| Primary antibody, ChAT | Chemicon (Millipore) | AB144P | 1/25 dilution |
| Primary antibody, TH | ImmunoStar | 22941 | 1/1,000 dilution |
| Biotinylated secondary antibody, goat | Vector laboratories | BA-9500 | 1/1,000 dilution |
| Biotinylated secondary antibody, mouse | Vector laboratories | BA-2000 | 1/1,000 dilution |
| Vectastain elite ABC kit | Vector laboratories | PK6100 | 8.8 µL/mL of A and B each |
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) | Sigma | D5637 | 0.05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink. |
| Peroxide (H2O2) 30% | Fisher scientific | H-323 | 0.005% dilution |
| Osmium tetroxide (OsO4) | Electron microscopic science | 2% 19152 4% 19150 |
Original solution can be either 2 or 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection. |
| Durcupan water-repellent epoxy resin | Sigma | A: M epoxy resin (44611) B: hardener 964 (44612) C: accelerator 960 (DY 060) (44613) D: plasticizer (44614) |
Polymerize 48 h at 58 °C before throwing in waste. |
| Alumium cups | Electron microscopic science | 70048-01 | |
| Ethanol | commercial alcohols | 1019C | Dilute in distilled water with appropriate concentration |
| Propylene oxide | Electron microscopic science | 20401 | Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood. |
| Non-coated medium glass slides | brain research laboratories | 3875-FR | Grease surface with mineral oil |
| Plastic film (Aclar embedding film) | Electron microscopic science | 50425-25 | Grease surface with mineral oil |
| Ultramicrotome | Leica UC7 | EM UC7 | |
| Diamond trimming tool (ultratrim) | Diatome | UT 1081 | Can use glass knife alternatively |
| Ultra 45° Diatome Diamond knife | Diatome | MC13437 | equipped with a boat |
| Xylenes | Fisher scientific | X5SK-4 | |
| 150-mesh copper grids | Electron microscopic science | G150-cu | |
| grid-box | Electron microscopic science | 71138 | Can store up to 100 grids |
| Sodium citrate | Anachemia | 81983 | |
| Lead nitrate | Sigma | L-6258 | Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76 g of sodium citrate diluted in 42 mL of preboiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1 N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light. |
| Syringe | terumo | SS-05L | 5 mL |
| Syringe filter | Corning | 431222 | 0.2 µm |
| Absorbing paper (bibulous paper) | Electron microscopic science | 70086-1 | |
| Parafilm | Laboratory film | PM-999 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 |
References
- Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005 (2015).
- Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
- Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
- Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
- Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
- Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
- Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
- Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
- Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
- Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
- Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
- Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
- Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
- Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
- Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
- Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
- Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
- Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
- King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
- Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
- Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
- Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
- Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
- Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
- Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
- Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
- McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
- Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
- Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
- Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
- Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
- Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
- Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
- Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
- Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
- Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
- Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
- Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
- Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
- Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
- van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
- Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
- Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
- Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008 (2016).
- Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
- Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).
