Summary
Hier bieten wir eine einfache, kostengünstige und zeitsparendes Protokoll zu chemisch fixieren Primaten Hirngewebe mit Acrolein Fixiermittel, so dass für die Langzeitarchivierung, die kompatibel mit vorge Einbettung Immunhistochemie für die Transmissionselektronenmikroskopie.
Abstract
Trotz aller technologischen Fortschritte bei der Lichtmikroskopie Niveau bleibt Elektronenmikroskopie das einzige Werkzeug in den Neurowissenschaften zu untersuchen und zu charakterisieren, ultrastrukturelle und morphologische Details von Neuronen, wie synaptische Kontakte. Gute Erhaltung von Hirngewebe für die Elektronenmikroskopie kann durch strenge Kryo-Fixierung Verfahren erhalten werden, aber diese Techniken sind ziemlich teuer und begrenzen die Verwendung von Immunmarkierung, die von entscheidender Bedeutung ist, um die Konnektivität von identifizierten neuronalen Systemen zu verstehen. Gefriersubstitution Verfahren wurden die Verbindung von Kryo-Fixierung mit Immunmarkierung zu ermöglichen, entwickelt. Allerdings stützt sich die Reproduzierbarkeit dieser methodischen Ansätze in der Regel auf teure Gefriergeräte. Darüber hinaus wird mit dieser Technik zuverlässige Ergebnisse zu erzielen ist sehr zeitraubend und Geschick schwer. Somit bleibt das traditionelle chemisch fixierte Gehirn, insbesondere Acrolein Fixiermittel, eine zeiteffiziente und kostengünstige Methode Elektron zu kombinierenMikroskopie mit Immunhistochemie. Hier bieten wir ein zuverlässiges experimentelles Protokoll unter Verwendung von chemischen Acrolein Fixierung, die zur Erhaltung der Primaten Hirngewebe führt und ist kompatibel mit Pre-Einbettung Immunhistochemie und Transmissions-Elektronen-mikroskopische Untersuchung.
Introduction
Lichtmikroskopie, einschließlich konfokale und Zwei-Photonen - Mikroskopie, hat sich als ein wirksames Instrument zur in vivo neuronalen Prozesse zu studieren, unter anderem 1, 2. Obwohl die typische räumliche Auflösung bei der Lichtmikroskopische (LM) Ebene ungefähr 200 nm, die jüngsten technologische Fortschritte sind verschiedene Lichtquellen, wie beispielsweise extremer Ultraviolett- und weiche Röntgenmikroskopie, hat insbesondere diese Auflösung auf eine fast 10 nm räumlichen Auflösung erhöht 3 , 4, 5. Weitere technologische Fortschritte in der bildgebenden Magnetresonanz - Bildgebung umfassen mit der Histologie kombiniert und bieten ein neues Verfahren zur in vivo , die Dicke der Myelinscheide Messen eines Parameters, der traditionell meßbaren nur an der Elektronenmikroskopische (EM) Stufe 6, 7 war. Although diese Fortschritte bei der LM-Ebene ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Untersuchung lebende Prozesse liefern, um eine Detailansicht und Charakterisierung von Strukturen, wie synaptische Kontakte kann nur mit EM erreicht werden, die eine Auflösung bietet, die 0,5 nm erreichen kann. Allerdings Beobachtung bei der EM-Ebene erfordert die Proben in gewisser Weise tot und verändert zu werden, mit chemischen Fixateure und Entwässerungsverfahren, um die Zytoarchitektur zu bewahren. Somit können biologische Proben bei hoher Auflösung der Prüfung herausfordernd aufgrund von Strahlungsschäden des Elektronenstrahls, geringem Kontrast, strukturelle Abweichungen von Membranen oder auch das Vorhandensein von Artefakten , die nach der Dehydratisierung und epoxy auftreten können Einbettung 8, 9, 10.
Die Erhaltung Proben in ihrer nativen Form für die Strukturanalyse kann mit „Cryo EM verglastem Sections“ oder CEMOVIS, mit schneidendem Ansatz erreicht werden, dassbeinhaltet schnell einfrieren und die Probe in Eis glasiger Einbettungs und die Abschnitte unter der EM bei einer kryogenen Temperatur 11, 12 zu untersuchen. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung von Proben , während sie noch fester und vollhydratisierte sind, so dass Artefakte , die durch Austrocknung Beseitigung verarbeitet 13. Jedoch beinhaltet dieses Verfahren zusätzliche Vorrichtungen für Kryo-Ultramikrotomie, sowie zusätzliche Geräte auf dem Standard-EM, um diese Beobachtung bei sehr niedrigen Temperaturen zu ermöglichen, was erhebliche Mehrkosten erzeugen. Darüber hinaus schließt die CEMOVIS Ansatz die Verwendung von Techniken Immunmarkierung, da Antikörper in der Regel bei RT inkubiert werden müssen. Alternativ ist es möglich, ultrastrukturelle Analyse mit immunhistochemischen Verfahren zu kombinieren, indem eine Gefriert Substitution Ansatz, bei dem Kryo-fixierten Proben langsam aufgetaut werden, während in Cryo-Schutzchemikalien immerged und sind then in Spezialharze eingebettet, wie Lowicryls. Post-Einbettung Immunmarkierung kann dann auf einem solchen Material 12 durchgeführt werden. Allerdings Gefriersubstitution und Kryo-Fixierung Techniken sind zeitaufwendig. Sie erfordern die Installation zusätzlicher Ausrüstung und erfordern noch Proben zu organischem Lösungsmittel und chemische Fixiermittel ausgesetzt werden, die die Zytoarchitektur verändern können, trotz der Verwendung einer niedrigen Temperatur 14, 15. Daher trotz aller technologischen Fortschritte sowohl bei dem LM und EM - Ebene, chemische Fixierung von Hirngeweben, insbesondere Acrolein, bleibt eine kostengünstige und zeitsparende Methode zu kombinieren Immunhistochemie mit EM 16.
In den letzten Jahrzehnten wurden viele Versuche unternommen, eine Mischung von Aldehyden zu finden, das die beste Gewebeerhaltung bieten. Vor den 1960er Jahren die einzige Fixiermittel Chemikalie, die akzeptable Ergebnisse für EM gab, war Osmiumtetroxid. Allerdings ist Osmiumtetroxid sehr giftig und teuer, ihre Verwendung durch das Gefäßsystem ausschließen Organe wie das Gehirn zu fixieren. Acrolein wurde in den späten 1950er Jahren als ein zuverlässiges Verfahren für die Tiergewebekonservierung geeignet für EM Beobachtung von Zellstrukturen 17 eingeführt. Es durchdringt die tiefen Gewebe und reagiert schneller als anderer Aldehyde , wenn zur Fixierung durch Eintauchen verwendet , und ermöglicht eine gute Konservierung zytoplasmatischer Komponenten mit minimaler Schrumpfung des Gewebes 17. Ein solches Merkmal ergibt Fixierung acrolein einen klaren Vorteil gegenüber anderen Aldehyden in frischem Gewebe bei der Verwendung, durch eine genauere Lokalisierung von lebenden molekulare Verbindungen ermöglichen, wie Enzyme und andere Proteine , 18. Tatsächlich hat es sich als einfache, effiziente und kostengünstige Methode der Fixierung für Visualisierung an der EM-Ebene in vielen Arten, darunter Amphibien und Nagetiere, wie sie effizient stabili im Laufe der Jahre validiertZES Peptide und Proteine, behalten Antigenität und liefern relativ intakt Ultrastruktur , wenn 16 in Kombination mit einem anderen Aldehyd Fixativ verwendet, 18, 19, 20, 21. Protokolle für Acrolein Fixation in Nagetieren seitdem wurden umfassend, vor allem durch die Pickel - Gruppe, zur Umsetzung dual Immunomarkierung für EM 16, 22 standardisiert und verwendet. Einige Gruppen haben Acrolein Fixation in nicht-menschlichen Primaten - Hirngewebe 23 verwendet. Jedoch unser Wissen gibt es nur ein veröffentlichtes Protokoll effizient chemische Fixierung mit Acrolein in nicht-menschlichen Primaten beschreibt , die kompatibel sind mit EM Immunmarkierung 24.
In diesem Artikel stellen wir eine einfache und zuverlässige Methode effizient chemisch nicht-hum zu behebenein Primaten Gehirne mit Acrolein, so dass für eine potentiell langfristige Konservierung sowie vor Einbettungs Immunomarkierung und Übertragung EM Prüfung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethik-Statement: Alle Protokolle Tiere beteiligt sind, wurden durch die Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (Ed. 2) hergestellt. Das hier beschriebene Protokoll wurde von ca. 800 g für ausgewachsene Tiere optimiert. Die Volumina des Fixiermittel sollte nach dem Tiergröße angepasst werden.
1. Herstellung von Lösungen für die transkardiale Perfusion
- Herstellung von 1 l eines 50 mM Natriumphosphat-gepufferte Saline (PBS) -Lösung, entsprechend den folgenden Schritten. Bereiten Sie die Lösung höchstens 24 Stunden vor der Perfusion und Halten bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Messung 800 ml destilliertem Wasser in einem 1 L Becherglas. Hinzufügen 5,87 g wasserfreies zweibasisches Natriumphosphat (Na 2 HPO 4), 1,20 g monobasisches Natriumphosphat - Monohydrat (NaH 2 PO 4 · H 2 O) und 9 gNatriumchlorid (NaCl). Stir aufzulösen.
- Den pH-Wert auf 7,4 durch die schrittweise Zugabe von 5 N NaOH. In destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l zu erreichen
ACHTUNG: NaOH ist eine ätzende chemische Verbindung. Tragen Sie die erforderliche Schutzausrüstung (PSA;. Laborkittel, Handschuhe, Schutzbrille, etc.).
- 2 l 4% Paraformaldehyd (PFA) gemäß den folgenden Schritten. Diese Lösung soll bis zur Verwendung bei höchstens 24 Stunden vor der Operation und bei 4 ° C hergestellt werden.
- Messen 1,5 l destilliertem Wasser in einem 2-l-Becherglas. Hinzufügen 23,48 g wasserfreies zweibasisches Natriumphosphat (Na 2 HPO 4) und 4,80 g monobasisches Natriumphosphat - Monohydrat (NaH 2 PO 4 · H 2 O). Stir aufzulösen. In destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 2 L. zu erreichen
- Die Lösung wird unter einer Entlüftungshaube, bis die Temperatur etwa 45 erreicht - 55 ° C. Erhitzen Sie nicht auf über 60 ° C.
- Allmählich 80 g PFA zu der Lösung hinzu und rührt bis zur vollständigen Auflösung (ca. 30 bis 60 min). Halten Sie die Temperaturüberwachung zu halten, unter 60 ° C.
ACHTUNG: PFA ist sehr volatil in seiner Pulverform. Es ist sehr giftig, wenn in Kontakt mit den Augen oder der Haut und ist bei Einatmen oder Verschlucken gefährlich. Tragen Sie PPE und mit Vorsicht unter einer Entlüftungshaube verwenden. - Die Lösung wird auf 4 ° C und Filter nach unten. Lagerung bei 4 ° C.
- Bereiten 1 l 3% Acrolein in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) gemäß den folgenden Schritten. Die PB-Lösung sollte höchstens 24 Stunden vor der Perfusion hergestellt werden.
ACHTUNG: Acrolein ist sehr giftig beim Einatmen und unmittelbaren Schaden erzeugen. Es ist auch korrosive und hochgiftig, wenn durch die Haut absorbiert. Es ist krebserregend und erbgutverändernd. Tragen Sie die geeignete PSA und Einsatz unter einem Entlüftungshaube.- Messen Sie 800 ml destilliertem Wasser. Hinzufügen 8,66 g wasserfreies zweibasisches Natriumphosphat (Na & sub2 ; 4) und 5,38 g monobasisches Natriumphosphat - Monohydrat (NaH 2 PO 4 · H 2 O). Rühren, bis alle Salze aufzulösen. Destilliertes Wasser, um ein Gesamtvolumen von 1 l Die Lösung wird bei 4 ° C zu erreichen.
- Vor der Operation überträgt 900 ml der PB-Lösung in einen 1-L-Glasbehälter und fügen 30.94 ml 97% Acrolein Lösung unter einem Entlüftungshaube. In PB Lösung ein Gesamtvolumen von 1 l und umrühren zu erreichen. Filtriere die Lösung und halten sie auf 4 ° C.
2. transkardiale Perfusion und Gehirnsezierung
- Halten Sie Lösungen auf Eis während des gesamten chirurgischen Eingriffs. Vorbereiten der Pumpe durch das Rohr in der ersten Lösung verwendet werden, zu platzieren (PBS; 50 mM) und Drehen der Pumpe, bis keine Luft verbleibt im Schlauch. Für die transkardiale Perfusion eines Makaken-Affen, verwendet, um eine 21 G-Nadel und stellen am Ausfluss etwa 80 ml / min.
- Betäubt das Tier mit einer intramuskulären Injektion einer Mischungture von Ketamin (20 mg / kg), Xylazin (4 mg / kg) und Acepromazin (0,5 mg / kg). Pflegen das Tier unter Isofluran (3%) Sedierung.
- Bringen Sie die Gliedmaßen des Tieres an einen Entlüftungstisch.
- Mit einem Skalpell, entfernen Sie die Haut mit den Achseln. Schneiden Sie die Bauchmuskeln. Verwenden Sie schwere chirurgische Schere, die Rippen zu schneiden seitlich durch sorgfältig die lebenswichtigen Organe zu vermeiden.
- Schneiden Sie die Membran mit chirurgischen Schere und heben Sie den Brustkorb, das Herz zu belichten. Sobald die Membran geschnitten wird, gehen Sie schnell, da wird das Herz innerhalb von wenigen Minuten zu schlagen stoppen.
- Entfernen Sie die Perikard mit einer Skalpellklinge und die Nadel in die linke Ventrikel. Mit einem Skalpell, machen vorsichtig eine kleine Entfernung in den rechten Vorhof. Schnell die Pumpe bei 72 ml / min gestartet und die Nadel in Position halten. Wenn möglich, kippen Sie das Tier, um auf einem niedrigeren Niveau den Kopf zu haben, als das Herz.
HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht die Scheidewand zu durchdringen, wenn die Nadel eingeführt wird.- Rinse das Blut mit etwa 300 ml PBS, bis die Lungen sind weiß und kein Blut kommt aus dem rechten Vorhof.
- Stoppen der Pumpe übertragen schnell den Schlauch / Rohr auf das 3% Acrolein-Lösung und wieder starten die Pumpe. Erhöhen Sie die Pumpgeschwindigkeit auf 80 ml / min, wenn das Herz zu schlagen aufgehört hat. Perfundieren etwa 500 ml der Acroleinlösung.
- Stoppen Sie die Pumpe, schnell den Schlauch an die 4% PFA-Lösung übertragen, und die Pumpe erneut starten. Dieser Schritt erfordert etwa 1 l PFA.
HINWEIS: Die Fixierung abgeschlossen ist, wenn die vorderen Gliedmaßen steif starr und der Hals sind. - Schneiden Sie den Kopf und seziert vorsichtig das Gehirn aus dem Schädel. Achten Sie darauf, nicht mit den chirurgischen Instrumenten, das Gehirn zu beschädigen. Die Perfusion ist optimal , wenn das Gehirn ist blass (keine Spur von Blut) und starre (1A).
- Tauchen intaktes Gehirn in 4% PFA für 1 h bei 4 ° C.
- schneiden seriell das Gehirn mit einem Kühl Vibratom (4 ° C)in der gewünschten Ebene in 50 & mgr; m dicke Abschnitte und sammeln sie in PBS (0,1 M) (1B).
Hinweis: dieser Schritt in vielerlei Hinsicht kann nach durchgeführt zu dem gewünschten Protokoll. Hemisphären kann vor dem Vibratom Schneiden getrennt werden, oder ganzen gehalten. Wenn das Gehirn für die Vibratom Plattform zu groß ist, kann es in kleinere Blöcke geschnitten werden. Nach diesem Schritt können Abschnitte für einen langen Zeitraum bei -30 ° C in einer Gefrierschutzlösung aus 40% PB (50 mM), 30% Glycerin und 30% Ethylenglykol gelagert werden.
3. Pre-Einbettungs Immunhistochemie (1C)
- Bereiten eine 4 l Stammlösung von Tris-gepufferter Saline (TBS, 50 mM, pH 7,6) wie folgt.
- Messung 2 l destilliertem Wasser in einem 4 l Becherglas, fügt 24,23 g Trihydroxymethyl aminomethan (THAM; C 4 H 11 NO 3), und umrühren aufzulösen.
- Den pH-Wert auf 7,6 mit etwa 148 ml 1 N HCl. Die Säure sollte mit cauti hinzugefügt werdenauf zu vermeiden, einen pH-Wert unter 7,6 zu erreichen. Das Gesamtvolumen sollte 4 L. sein
ACHTUNG: HCl ist stark ätzend. Tragen Sie die geeignete PSA.
- Wählen Abschnitte (aus Schritt 2.11), um die Region von Interesse enthalten, für EM Immunhistochemie verarbeitet werden.
- Waschen Sie die freischwebenden Teile 3x in PBS (0,1 M, pH 7,4) für 5 min bei RT die Gefrierschutzlösung zu spülen.
- Vorbereiten einer 0,5% igen Lösung von NaBH 4 in PBS verdünnt.
- Man wiegt 0,05 g NaBH 4 , und verdünnte sie in 10 ml PBS. Nicht abdecken. Bereiten Sie diese Lösung unmittelbar vor Gebrauch.
- Inkubieren Sie die Abschnitte in der frisch hergestellten NaBH4 - Lösung für 30 min bei RT. Rock sanft. Nicht abdecken.
- Wasch 3x in PBS für 10 min bei RT, bleibt, bis keiner des Reaktionsgases kräftig schaukeln.
- Bereiten eine Blockierungslösung für EM mit 2% entsprechendem Normalserum und 0,5% Gelatine in kaltem PBS Fisch verdünnt.
HINWEIS: Die Menge shoulzu haben, ausreichend für die folgenden drei Schritte d berechnet werden, um. Verwenden, um ein Serum aus der gleichen Tierspezies aus dem sekundären Antikörper hostet. Vermeiden die Verwendung von Antigen-Retrieval-Verfahren oder Zugabe von geringen Mengen von Triton (das Eindringen von Antikörpern zu erhöhen), wie diese Verfahren erheblich die Qualität des Gewebes beeinträchtigt wird. - Inkubieren Sie die Abschnitte in der Blockierungslösung für 1 h bei RT. Rock sanft.
- Bereiten primäre Antikörperlösung in der Blockierungslösung verdünnt.
HINWEIS: Die Konzentration des primären Antikörpers ist in der Regel der gleiche wie für LM Immunhistochemie, aber vorher mit verschiedenen Antikörperkonzentrationen der Durchführung von Tests betrachten, da einige primären Antikörper mit Acrolein können nicht funktionieren. Wenn ja, ist es möglich, eine Mischung aus Glutaraldehyd zu verwenden (0,1-2%) und 4% PFA für transkardiale Perfusion und ähnliche Ergebnisse zu erzielen. Optimierung der Inkubationszeit und -temperatur sowie. - Inkubieren der Schnitte in primären Antikörperlösungüber Nacht bei RT unter leichtem Schütteln. Verwenden einer zuvor getesteten Inkubationszeit und Temperatur.
- Waschen Sie die Abschnitte 3x in PBS für 5 min bei RT unter leichtem Schütteln.
- Bereiten einer 1: 1000 Lösung von biotinyliertem sekundärem Antikörper in der Blockierungslösung verdünnt.
HINWEIS: Der sekundäre Antikörper muss gegen die Wirtsart angehoben werden verwendet, um die primären Antikörper zu erzeugen. - Inkubieren der Schnitte in sekundären Antikörperlösung für 1,5 h bei RT. Rock sanft.
- Bereiten eine Avidin-Biotin-Peroxidase (ABC) Lösung, die mindestens 60 min vor dem Ende der sekundären Antikörper inkubiert.
- Verwenden einer kalibrierten Pipette 8,80 ul / ml der Lösungen A und B und verdünnte sie in PBS zu messen.
- Rock mild für mindestens 60 min bei RT der komplett zu ermöglichen Bindung zwischen Avidin und Biotin-Molekülen.
- Nach der Inkubation in sekundärer Antikörperlösung, Waschen 3x in PBS für 10 min bei RT.
- Inkubieren Sie die Abschnitte in dem ABC solution für 1 h bei RT. Rock sanft.
- Waschen Sie einmal in PBS und zweimal in TBS für 10 min bei RT unter leichtem Schütteln.
- Eine frische Lösung von 0,05% 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) mit 0,005% H 2 O 2 in TBS verdünnt.
- Man wiegt 12,5 mg DAB und verdünnt es in 25 ml kaltem TBS. Vor Licht schützen.
ACHTUNG: Das DAB-Pulver ist sehr volatil und gesundheitsschädlich beim Einatmen. Es ist karzinogen und teratogen. So Frauen schwanger sind oder stillen, sollten dieses Produkt nicht manipulieren, auch wenn verdünnt. Verwenden Sie eine N95-Maske, wenn die Manipulation und PSA tragen. - Filtriere die Lösung und füge 4,5 ul 30% H 2 O 2 kurz vor der Verwendung.
- Man wiegt 12,5 mg DAB und verdünnt es in 25 ml kaltem TBS. Vor Licht schützen.
- Inkubieren Abschnitte in der DAB-Lösung für 3 bis 7 min bei RT. Rock sanft.
HINWEIS: Der braune Niederschlag nicht zu dunkel sein sollte, um ein hohes Maß an Hintergrundfärbung zu vermeiden. Die Inkubationszeit sollte entsprechend optimiert werden. - Die Reaktion durch schnell zweimal Waschenin kaltem TBS und dann zweimal für 10 Minuten in kaltem TBS bei RT, gefolgt von zweimal 10 min in PB, mit mildem Rocking.
HINWEIS: Die Verwendung von PB (und nicht PBS) ist von entscheidender Bedeutung, um alle Spuren von NaCl zu beseitigen, wie es mit Osmium und bilden Kristalle reagieren würde.
4. Osmification and Embedding für Elektronenmikroskopische Beobachtung
- Es wird eine Lösung von 1% Osmiumtetroxid (OsO 4) , verdünnt in PB. Vor Licht schützen.
ACHTUNG: Osmium ist sehr giftig und soll in Kontakt mit der Haut, Augen nicht kommen, oder dem Mund und nicht inhaliert werden soll. Es kann zum Tod führen, wenn sie verschluckt. Es sollte nur unter einer Entlüftungshaube und mit geeigneten PSA verwendet werden. - Inkubieren der Schnitte in OsO 4 -Lösung für 30 min bei RT unter der Entlüftungshaube (ohne Rühren) und sie mit Aluminiumfolie sie vor Licht zu schützen. Abflachen vollständig die Abschnitte vor der OsO 4 -Lösung hinzugefügt.
Hinweis: Die Abschnitte werden sehr dunkel und rigid und sollte mit Sorgfalt nach diesem Schritt manipuliert werden. - Bereiten wasserabweisenden Epoxidharz während des osmification.
- Fügen geeignete Mengen jeder Komponente der Epoxidharzes Mischung (20 g Epoxidharz 20 g Härter, 0,6 g Beschleuniger und 0,4 g Weichmacher) zu einem großen Kunststoffbecher. Rührt mit einem Holzstab oder Plastikpipette, bis eine homogene braune Farbe erhalten wird.
HINWEIS: Es ist wichtig, den genauen Anteil der einzelnen Komponenten zu verwenden. - Übertragen Sie gleiche Mengen an Aluminiumbecher geeigneter Größen, abhängig von der Anzahl der Abschnitte verarbeitet werden. Lassen Sie es ruhen.
- Fügen geeignete Mengen jeder Komponente der Epoxidharzes Mischung (20 g Epoxidharz 20 g Härter, 0,6 g Beschleuniger und 0,4 g Weichmacher) zu einem großen Kunststoffbecher. Rührt mit einem Holzstab oder Plastikpipette, bis eine homogene braune Farbe erhalten wird.
- Waschen Sie die osmificated Abschnitte für 10 min bei RT mit Low-Speed-rocking in PB 3x.
- Dehydrieren, die Abschnitte in der folgenden Reihe von abgestuften Ethanol für 2 min je 2 mal in 35% Ethanol; 1-mal jeweils in 50, 70, 80, 90 und 95% Ethanol; und 3x in 100% Ethanol.
- Übertragen Sie die Abschnitte zu Glasfläschchen, die dehydrati zu vervollständigenauf das Verfahren durch die Abschnitte 3 mal für 2 min in propylenoxid inkubierte.
ACHTUNG: Propylenoxid ist eine sehr volatil und toxischen organischen Lösungsmittel. Es kann zu schweren Schäden in den Augen verursachen oder die Haut bei Berührung oder Einatmen oder Verschlucken. Es wurde als Grad 2 krebserregende Substanz eingestuft. Es sollte nur unter einer Entlüftungshaube und mit PPE verwendet werden. Es ist auch sehr leicht entflammbar und soll weg von jeder Wärmequelle gehalten werden.
HINWEIS: Vor diesem Schritt sollten sorgfältig Abschnitte in Glasphiolen übertragen werden, da Propylenoxid ist ein organisches Lösungsmittel und ist nicht kompatibel mit Kunststoff. An diesem Punkt Abschnitte sind sehr empfindlich und sollten mit Vorsicht gehandhabt werden. Abschnitte können alternativ an Glasphiolen vor übertragen werden 4,5 Schritt. - Transferabschnitte sorgfältig, eins nach dem anderen, in den Aluminiumbecher und vermeiden Kontakt mit Luft so viel wie möglich. Flach einzubetten, die Abschnitte in vorher gemischten wasserabweisenden Epoxidharz und inkubieren sie über Nacht unter dem Venting Haube bei RT.
HINWEIS: Bei diesem Schritt sind die Abschnitte vollständig entwässert und sehr zerbrechlich und sollte mit Vorsicht gehandhabt werden. - Verwendung von Mineralöl, Fett herzustellen beschichtete Glasobjektträger zusammen mit gefetteten Kunststoff-Deckgläschen.
- Erweichen des Harzes durch Aluminiumbecher bei 60 ° C für 12-15 min höchstens inkubierte. abflachen bitte die Abschnitte auf der Seite des gefetteten Glasträgers. Legen Sie das gefettete Deckglas und vorsichtig herausschieben verbliebene Luft.
- Inkubieren der Objektträger bei 60 ° C für 48 h.
HINWEIS: Es ist wichtig, nicht 48 Stunden Inkubationszeit überschreiten, da das Harz zu hart werden wird. - Entfernen Sie das Plastikdeck.
5. Probenvorbereitung für die Ultradünnes Sectioning und Beobachtung ein Transmissionselektronenmikroskop
- Verwenden Sie ein Fernglas in die Region von Interesse zu finden und ein kleines viereckiges Stück von etwa 1 mm 2 mit einem Skalpell geschnitten.
- Datei, die die Spitze eines Harzblock und kleben die quadrangular Stück auf sie (Figur 1C). Lassen Sie den Kleber für mindestens 1 h oder über Nacht vor dem Schneiden trocknen.
- Unter Verwendung eines Ultramikrotoms, schneiden die viereckiges Stück in 80 & mgr; m dicke Abschnitte (1D).
- Platzieren Sie den Harzblock in einem Ultramikrotom Deck in der vertikalen Position und eine scharfe Rasierklinge geschnitten allmählich auf jede Seite des Harzblockes zu einem Trapez mit glatten Seiten zu bilden.
- Legen Sie das Deck in seiner horizontalen Position und dreht, um den Block, bis die längste Seite des Trapezes nach unten weist.
- Verwenden eines Diamantschneidwerkzeug oder ein Glas Messer der Oberfläche des viereckigen Stück zu trimmen. Stellen Sie die Ultramikrotom geschnitten 300 & mgr; m dicke Schnitte bei 1 mm / s. Justieren des Messers auf das viereckige Stück zu sein, vertikal parallel und einen sehr kleinen horizontalen Winkel von etwa 1 ° bis anzuzeigen.
HINWEIS: Dieser Winkel der Benutzer das Gewebe ermöglicht, fast zu nähern, um die Oberfläche des b parallelsperren, wo immunomarkiert Elemente eher zu finden sind. Wenn diese Parameter mit dem Diamantschneidwerkzeug verwendet wird, zeigt das Harz eine glänzende weiße Farbe. Wenn das Gewebe geschnitten wird, ändert es zu einer violetten oder grünlicher Farbe. - Verwenden ein ultra 45 ° Diamantmesser mit einem Boot mit destilliertem Wasser gefüllt ausgestattet 80 um dicke Schnitte geschnitten, glätten Abschnitte durch mit einem Stück über sie verläuft Papier absorbiert in Xylol gekippt, und sammelt Serienschnitt auf Formvar-beschichtete Nickelschlitzgittern oder bare 150 mesh - Kupfergitter (Figur 1E).
- Platzieren Sie die Gitter in einem Raster Aufbewahrungsbox.
- Beflecken die Gitter mit Bleizitrat.
- Verwenden, um eine 5-ml-Spritze und ein 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter eine 1 vorzubereiten: 1-Lösung von gefiltertem Bleicitrat Stammlösung filtriert und destilliertes Wasser. Schützen Sie es vor Licht.
HINWEIS: Die Stammlösung von Bleizitrat sollte jeden Monat frisch gemacht werden, um die Bildung von festen Depos zu vermeidenseine. Sehen Sie sich das Materialdatenblatt für die Aktien Rezept. wenn viele Reihe von Gittern zu färbenden müssen, ändern Sie die verdünnte Lösung Zusätzlich wird, wenn es milchig wird. - Platzieren jedes Gitter auf einen Tropfen der verdünnten Lösung, mit dem Abschnitt in Kontakt mit der Lösung. Inkubieren für 3 min.
- Verwenden kleine Pinzette das Raster zu halten, und es gründlich in zwei Becher spülen destilliertes Wasser enthielt.
- Entfernen Sie überschüssiges Wasser durch vorsichtige absorbierendes Papier. Speichern der Gitter in einer Gitterbox. Warte 30 min vor dem Abschnitt durch Transmissions - Elektronenmikroskopie untersucht (TEM; 1F).
- Verwenden, um eine 5-ml-Spritze und ein 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter eine 1 vorzubereiten: 1-Lösung von gefiltertem Bleicitrat Stammlösung filtriert und destilliertes Wasser. Schützen Sie es vor Licht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In diesem Abschnitt präsentieren wir repräsentative Ergebnisse, die nach der Beobachtung erhalten wurden, bei der Übertragung EM-Ebene, von immunhistochemisch primate Hirngewebe chemisch mit einem Gemisch aus 3% Acrolein und 4% PFA fixiert. Wir erzielen gute Konservierung der Ultrastruktur, wie durch die relativ intakte Myelinscheide und der reinen Visualisierung von Doppelmembranen (2A) angedeutet ist . Synaptische Kontakte zusammen mit neuronaler Elemente aus der Mikroumgebung, können leicht identifiziert werden (2B). Neuronaler Elemente markiert mit Diaminobenzidin (DAB) Immunpräzipitat sind an der EM-Ebene durch ihr gefülltes Zytoplasma oder Axoplasma erkannt. Die Plasmamembran und die Außenfläche von Organellen ebenfalls typischerweise mit dem elektronendichte Niederschlag (3) ausgekleidet ist .
In diesem speziellen Experiment verwendeten wir Antikörper against Serotonintransporter (SERT), Cholin - Acetyltransferase (ChAT) oder Tyrosinhydroxylase (TH) immunomarkiert neuronaler Elemente in den äußeren (GPe) oder internem (GPI) Segment des squirrel monkey Pallidum (Abbildung 3) sichtbar zu machen. Um dies zu tun, haben wir eine Kombination von Fixateur Chemikalien, die Antigenität sowie Ultrastruktur erhalten, eine detaillierte morphologische Untersuchung ermöglicht. Obwohl viele Antikörper mit dem transkardiale Perfusion oben beschriebenen Protokoll verwendet werden können, empfehlen wir, dass die Nutzer Optimierung Konzentrationstests im Vorfeld durchzuführen, da einige primären Antikörper nicht optimal Immunmarkierung mit Acrolein Fixierung sorgen dafür bekannt sind. Alternativ kann, wenn Antikörper nicht optimal Immunomarkierung mit Acrolein Fixierung bereitzustellen, eine Verdünnung von 0,1 bis 2% Glutaraldehyd in 4% PFA kann für transkardiale Perfusion verwendet werden. Es stellt Gewebequalität relativ gleichwertig zu Acrolein-fixierten Hirngewebe mit erhaltener Antigenität für vieleAntikörper (Abbildung 4).
Schließlich bieten wir typische Beispiele für EM mikroskopische Aufnahmen folgende unangemessenen Manipulationen erhalten. Eine schlechte Fixierung resultiert eine neue Myelinscheiden (5A, B) und Schwierigkeiten bei der Visualisierung der Doppelmembranen von Neuriten (5C, D), eine zuverlässige Identifikation und Analyse von markierten und unmarkierten neuronaler Elemente verhindert wird . Eine übermäßige Inkubationszeit in der DAB-Lösung schafft übermäßigen Hintergrund und nicht-spezifische Färbung, die möglicherweise falsch-positive Ergebnisse generieren kann. Hintergrund oder nicht-spezifische Färbung erscheint manchmal als unvollständige Färbung neuronaler Elemente (6A, B), aber häufiger als zahlreich und eng gefärbte neuronaler Elemente (6C, D) befand. Die Verwendung von Reinigungsmitteln in der Blockierungslösung verändert signifikant die Qualität des Gewebes. Es kann zu fehlenOrganellen in beschrifteten Elementen (7A) oder einen Abbau der Myelinscheiden (7B) und Zellmembranen (7C), keine akute Interpretation der Mikroumgebung schwierig machen. Schließlich wird ein Fehltritt im osmification Verfahren, wie Spüllösung unter Verwendung von Natriumchlorid, unzuverlässigen Ergebnisse erzeugt , wo die zellulären Strukturen schwer zu unterscheiden ist (Figur 7D).
Abbildung 1: Schema der wesentlichen Schritte des Protokolls. Das Affenhirn (A) geschnitten wird , in serielle Abschnitte mit einem Kühl Vibratom (B). Es wird dann für die prä-Einbettungs verarbeitet Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie, nach der der Bereich von Interesse auf der Spitze eines Harzblock (C) und geschnitten in 80 nm dicke Abschnit platziertons mit einem Ultramikrotom (D). Ultradünne Schnitte werden dann auf blanken 150 mesh - Kupfergitter aufgefangen oder Formvar-beschichtete Nickelgittern (E), gefärbt mit Bleicitrat und bereit unter Transmissions - Elektronenmikroskops (F) zu beobachten. Maßstabsbalken: 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Gut erhaltene Primatengehirngewebe nach Acrolein-PFA transkardiale Perfusion. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von squirrel monkey (Saimiri sciureus) Hirngewebe des GPi (A) und GPe (B) zeigt repräsentative gut erhaltenen Materials nach dem Acrolein-PFA transkardiale Perfusion durchführt und die Immunperoxidase-Diaminobenzidin - Technik. SieYelin Hülle von Axonen (a) relativ intakt ist (siehe A in Pfeilspitze) und die allgemeine Ultrastruktur wird in A und B. dendritische Profilen (d), kleiner unmyelinisierte Axone (a) und Axon Varikositäten (AV) kann gut erhalten leicht identifiziert werden. Ein Beispiel eines Axons varicosity einen symmetrischen synaptischen Kontakts (zwischen den Pfeilen) mit einem dendritischen Profil (d) Festlegung ist in B gezeigt. Maßstabsbalken: 1 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Abschnitte von Totenkopfäffchen GPe und GPi immunomarkiert für Cholin - Acetyltransferase (ChAT), Serotonin - Transporter (SERT) und Tyrosinhydroxylase (TH) , indem die Immunoperoxidase-Diaminobenzidin - Technik. Immunobezeichnete Elemente, können leicht durch ihre Zytoplasma oder Axoplasma mit elektronendichten DAB Präzipitat gefüllt identifiziert werden. Labelled dendritische Profile werden von gefülltem Mikrofilamente erkannt, wie in A zu sehen ist , wo ein ChAT-immunhistochemisch Dendriten in GPI einen synaptischer Kontakt erhält (zwischen den Pfeilen) von einem nicht markierten Axon varicosity (AV). Die elektronenmikroskopische Aufnahme in B zeigt einen myelinisierten Axonen im GPe mit einer relativ intakten Myelinscheide , dessen Axoplasma ist immunomarkiert für TH. Das Beispiel in C zeigt einen Axon varicosity im GPi immunomarkiert für SERT und ist einen symmetrischen synaptischen Kontakt (zwischen Pfeilen) mit einem Dendrit (d) herzustellen gesehen. In diesem Beispiel fällt die DAB-Linien, die die Plasmamembran und die Außenfläche von Organellen (Mitochondrien und synaptischen Vesikeln). Das Axon varicosity in D wurde in den GPe und immunomarkiert für TH und stellt ein Beispiel für DAB - Niederschlag füllt vollständig die axop beobachtetLASM, mit synaptischen Vesikeln sichtbar, aber schwieriger zu beschreiben. Elemente der Mikroumgebung können leicht identifiziert werden, wie beispielhaft durch myelinisierten Axonen und unmyelinisierte (a) und gelegentliche Dendriten (d) umgebenden markierten Axon varicosity. Elektronenmikroskopische Aufnahmen werden modifiziert von 25, 26, 27. Maßstabsbalken: 1 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Beispiele für Primatengehirn Gewebe nach Glutaraldehyde-PFA transkardiale Perfusion. Repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahmen von Rhesusaffen (Macaca fascicularis) Hirngewebe von GPE (A) und GPi (BD) nach performing transkardiale Perfusion mit 0,2% Glutaraldehyd gemischt mit 4% PFA und Immunperoxidase-Diaminobenzidin-Technik mit einem Antikörper gegen den Serotonintransporter (SERT). Wie in Abbildung 2, immunmarkierten können Elemente von ihrem Zytoplasma und Axoplasma mit elektronendichten DAB Präzipitat gefüllt identifiziert werden. Allgemein Ultrastruktur ist relativ intakt und Elemente der Mikroumgebung können leicht identifiziert werden, wie durch myelinisierten Axonen und unmyelinisierte (a) und gelegentliche Dendriten (d) und Axon Varikositäten (av) umgebende markierten Axon Varikositäten gezeigt, wie in Abbildung 2 beschrieben. Beachten Sie jedoch, die Inkonsistenz in der Qualität der Ultrastruktur, bezeichnet mit gut definierten Plasmamembranen (Pfeilspitzen), aber relativ Myelin-Schicht (Pfeil). Maßstabsbalken: 1 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Beispiele für Primatengehirn Gewebe erhielten eine erfolglose transkardiale Perfusion folgende. (- B A) und GPe (C - D) ergibt sich aus einer nicht erfolgreichen chemischen Fixierung sind hier im squirrel monkey GPi gezeigt transkardial mit 0,9% NaCl Spüllösung und ein Gemisch aus eiskalter 4% PFA und 15% Pikrinsäure perfundiert verdünnt in 0,1 M PB (pH 7,4). Die Gehirne wurden nachfixiert 1 h bei 4 ° C in 4% PFA und 30% Saccharose und geschnitten in 60 & mgr; m dicke Sagittalschnitten mit einem Kühl Vibratom. Unsachgemäß befestigt Hirngewebe können durch die Myelin - Schicht (A und B, Pfeilspitzen), sowie durch verschwommenen oder undefiniert Plasmamembranen (C und D, siehe Pfeilspitzen für die Beispiele) erkannt werden. Unterschiedliche neuronale Elemente difrig zu identifizieren, jede Interpretation des unzuverlässig Ultra machen. Maßstabsbalken: 1 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Beispiele für nicht-spezifische Immunmarkierung ChAT im Totenkopfäffchen GPe. Hintergrundfärbung oder nicht-spezifische Immunmarkierung erscheint manchmal unter der EM als Teilfärbung von großen Zellelementen, wie in A - B (Pfeilspitzen). Eine solche unspezifische Färbung erscheint an der Oberfläche der immunhistochemisch Abschnitte häufiger. Andere Beispiele für nicht-spezifische Immunmarkierung umfassen die häufige Beobachtung von sehr kleinen Elementen evoziert kleinen, unmyelinisierte Axone teilweise oder vollständig mit DAB gefüllt und sie in unmittelbarer Nähe eines another, wie durch Pfeile in C und D gezeigt. Maßstabsbalken: 1 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Beschädigte Totenkopfaffe GPe Gewebe nach Fehltritten in Probenvorbereitung für Elektronenmikroskopie. Die Verwendung von Detergens, wie Triton X-100, in der Blockierungslösung, selbst bei einer geringen Konzentration von 0,02%, ändert im wesentlichen die Integrität der Ultrastruktur durch das Zytoplasma von Dendriten zu beschädigen (A) oder die Myelinscheide von Axonen (B ). Die verschiedenen neuronalen Elemente sind auch schwierig voneinander (C) zu unterscheiden, da die Plasmamembranen beschädigt sind und schwierig zu beschreiben. Der osmification Prozess ist also ein wichtiger Schritt bei der Probenvorbereitung. Die Verwendung von Natriumchlorid in Spüllösungen (D) verändert , um die Fixierung des Gewebes, schwierig , eine nachfolgende Analyse zu machen. Maßstab: 800 nm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In diesem Artikel präsentieren wir ein zuverlässiges Protokoll für transkardiale Perfusion von nicht-menschlichen Primaten und Pre-Embedding Immunhistochemie geeignet für EM Probenprüfung. Obwohl typische Kryo-EM, wie CEMOVIS, eine gute Erhaltung des Gehirns Ultra bietet, schränkt sie auch die Verwendung von Immunhistochemie 12. Andere Techniken, einschließlich Kryo-Substitution und Tokuyaso Technik erlauben post-Einbettungs Immunhistochemie, aber diese Techniken sind teuer aufgrund zusätzlicher Geräte während des Prozesses benötigt , und kann zeitraubend und Geschick schwer 12, 14, 15 sein. Darüber hinaus effizient, um die Kryo-Fixierungsverfahren zu verwenden, muss die Probe relativ klein sein (bis zu 200 & mgr; m in der Dicke , wenn Hochdruck unter Verwendung von 28 und 10 & mgr; m bei Atmosphärendruck Einfrieren 29). Im Idealfall, um guteErgebnisse mit Kryo-Fixierung von Primaten Hirngeweben, hat die Probe aus einer Biopsie entnommen wurde, Probleme bei der Suche nach dem genauen Standort der Region von Interesse verursacht. Dieses Problem muss mit Stereotaxierahmen Koordinaten umgangen werden. Die chemische Fixierung mit Acrolein und prä-Einbettungstechnik, die oben bietet eine einfache, kostengünstige, zeitsparende und zuverlässige Methode zur Probenvorbereitung von Primaten-Hirngeweben und Immunmarkierung für EM vorgeschlagen. Durch die folgenden Schritte, wird man eine gut erhaltene Ultrastruktur zusammen mit Antigenität erhalten für die Immunmarkierung der meisten Proteine zu ermöglichen. Allerdings chemische Fixierung für EM hat auch seine Nachteile. Erstens, während Fixierungslösungen wie Acrolein der morphologischen Einzelheiten des Hirngewebes erhalten, ist es möglich, dass einige morphologischen Veränderungen bei den chemischen Fixierungsverfahren auftreten und verändern die Ergebnisse im Vergleich zu denen, die mit CEMOVIS oder Kryo-Substitutionstechniken erhalten werden würden. Zweitens ist die Fixierung Prozess undanschließende Dehydratisierung zum Harz erforderlich meisten der extrazellulären Flüssigkeiten Einbettungs entfernen und zellulären Komponenten zusammenzudrücken, wodurch Schrumpfen des Gewebes , die ihre Größe signifikant modifiziert und an Zellen Kryo-21 befestigt verglichen Form 30. Dennoch hat Aldehyd Fixierung der Welt erfolgreich in vielen Laboratorien und ist weit verbreitet in der Literatur als zuverlässige Methode akzeptiert für die Untersuchung der ultrastrukturellen Eigenschaften von Neuronen und Glia - Zellen verwendet worden, trotz vorher betreffen 21 erwähnt, 30, 31, 32.
Durch Vergleich mit dem oben beschriebenen Verfahren, die postembedding Immunhistochemie , die für Kryo-fixierten Proben eingebettet in Methacrylatharz benötigt wird, weniger empfindlich ist und die Erkennung von Antigenen des zentralen Nervensystems ist begrenzt 14 33. Jedoch Aldehyd Fixierung hat auch ihre Grenzen in Bezug auf Antigenität. Daher ist es wichtig, die Spezifität des Antikörpers für ein gegebene chemische Fixierung Protokoll auf der LM-Ebene zu testen, bevor die EM-Vorbereitung zu starten. Die Qualität der Immunhistochemie auf Acrolein-fixierten Hirngewebe hängt auch von zuvor die starken Aldehydbindungen durch die chemische Fixierung geschaffen brechen. Dieser Schritt kann durch Inkubation der Abschnitte vor Immunhistochemie mit Natriumborhydrid erreicht werden (siehe Schritte 3,3-3,5). Diesen Schritt Weglassen würde auf jeden Fall zu einer suboptimalen Immunfärbung 34. Wenn die Antikörper verwendet werden, gibt nicht optimale Färbung auf Hirnschnitte mit Acrolein fixiert ist, ist es möglich, alternativ Glutaraldehyd zu verwenden (0,1-2%) in 4% PFA verdünnt. Dies hat sich bewährt, um Gehirn Ultra gut zu erhalten und gleichzeitig ausreichend Antigenität für viele Antikörper zu erhalten und Hirngewebe zu schaffen,geeignet für 20 Langzeitlagerung mit minimalen Veränderungen, 21, 35, 36, 37. Es ist auch möglich , ein relativ gute Fixierung und Antigenität geeignet für EM mit PFA durch signifikant allein zu erzielen den pH - Wert der Lösung erhebend, sondern eine Kombination von mehr als ein Fixativ während der Perfusion wird 34 bessere Ergebnisse zur Verfügung gestellt, und Studien unterstützen , dass PFA Fixation allein im Allgemeinen schlecht erhaltenen Gewebe für EM Prüfung produzieren 38, 39. Doch in einigen seltenen Fällen Antigenität ist sehr schwierig zu halten und PFA Fixierung allein bleibt die einzig gangbare Option für EM Prüfung.
Viele Schritte in diesem Protokoll sollten sorgfältig befolgt werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Zum Beispiel ist die Herstellung der 4% PFA-Lösungmuß über 45 ° C, um bei Temperaturen durchgeführt werden, das PFA-Pulver zu ermöglichen, sich aufzulösen, aber es ist zwingend notwendig, dass die Temperatur unter 60 ° C bleibt. Andernfalls depolymerisiert die PFA - Lösung in Formaldehyd und Ameisensäure, die das Gewebe anders fixiert und bildet eine saure Lösung , die 40 deutlich Gewebequalität verändern könnten, 41. Darüber hinaus ist es entscheidend , dass die Perfusion Schritte schnell durchgeführt werden , sobald die Membran geschnitten wurde, da Hypoxie und Hyperkapnie irreversiblen physiologische Veränderungen im Gehirn produzieren, die die Qualität und Integrität des Gewebes 31 verändern könnten. Defekte Fixierung auf die Erhaltung von Hirngewebe schädlich sein könnte und dauerhaft die Ultrastruktur des Gewebes, wie Plasmamembranen, Mitochondrien und Synapsen verändern. So müssen Lösungsherstellung und Perfusions-Schritte mit Sorgfalt durchgeführt werden. Erfolgreiche EM Probe VORBEREITUn hängt auch stark von einer guten Postfixierung in Osmiumtetroxid. Tatsächlich wurde , wie die Herstellung weniger intakt Gewebe zur Beobachtung EM 21, 39 direkte Perfusion mit Osmiumtetroxid beschrieben. Es wurden jedoch viele Unterschiede in Bezug auf die Menge des extrazellulären Raum und die Erscheinung der Plasmamembran zwischen Osmium durchbluteten und Aldehyd durchbluteten Tieren bemerkt. Darüber hinaus machten die Schwärzung und Verhärtung der Gewebe nach Osmium Perfusion der Entfernung des Gehirns aus dem Schädel, die nachfolgenden Dissektion, und die Unterscheidung zwischen Weiß und grauer Substanz schwieriger, Aldehyd- Perfusion für bessere Gewebekonservierung begünstigten und einfache Manipulation 21. Aldehydfreies Fixierung allein scheint den extrazellulären Raum zu reduzieren, was die Integrität des Gewebes verändert und vermittelt den Eindruck von tight junctions, wo extrazellulären Raum gesehen werden soll, so zeigen, andernfallsakzeptabler elektronenmikroskopischen Aufnahmen auch nach Bleicitrat Anfärbung 42. Jedoch Nachfixierung in Osmiumtetroxid diese Situation umgekehrt durch eine sehr deutliche Trennung zwischen Gewebeelementen ermöglicht, die für ihre Identifikation 42, so notwendig ist , deutlich die Bedeutung der Rechtfertigung der osmification Schritte durchgeführt (Schritte von 4,1 bis 4,2) mit Vorsicht.
Die Bedingungen und Konzentrationen unter denen diese Schritte durchgeführt haben in unserem Labor speziell für Pre-Einbettung Immunhistochemie DAB als Niederschlag auf Primaten Hirnschnitten getestet. Obwohl qualifikations herausfordernden doppelt Immunhistochemie möglich ist , durch post-Einbettungs Immunhistochemie mit Goldpartikeln 43. Die elektronendichte DAB nach der hier ist sehr einfach in der EM-Ebene zu identifizieren vorgeschlagen Immunperoxidase-Diaminobenzidin Technik erhaltene Niederschlag, da es Plasmamembranen skizziert und auser Oberflächen von Organellen, während immer noch die Identifizierung von subzellulären Komponenten ermöglichen, wie Mitochondrien und synaptische Kontakte. Darüber hinaus, wenn die vorliegende Technik für einzelne Immunhistochemie beherrscht wird, ist es möglich, Doppel Immunhistochemie durchzuführen, indem die Kombination von DAB zu Goldpartikel auszufällen, die mehr sind leicht voneinander als Goldpartikel unterschiedlicher Größe zu erkennen. Wir würden dabei strenge Tests der Antikörper-Spezifität, Osmium Konzentrationen und Inkubationszeit und Temperatur vor der Verarbeitung Gehirnschnitten für EM empfehlen. Protokolle für die Pre-Embedding und Doppel Immunhistochemie für EM zuvor veröffentlicht worden und kann für Primaten Hirngewebe 16 angepasst werden.
Abschließend stellte die transkardiale Perfusion Protokoll für nichtmenschliche Primaten ermöglicht die oben für die Langzeitlagerung von Hirnschnitten, die anschließend für die EM vorgeEinbettungs Immunhistochemie verwendet werden kann. Sections erhalten sind auch für neuroanatomische Studien an der LM-Ebene geeignet. Somit wird durch ein Protokoll, das für beide EM und LM geeignet ist, ist es möglich, die Anzahl der verwendeten Tiere zu verringern, eine kosteneffiziente und ethische Betrachtung. Es ermöglicht auch einen direkten Vergleich zwischen den Ergebnissen bei der LM und EM Ebenen auf dem gleichen Tier erhalten und ermöglicht die Verwendung von Korrelative Licht und Elektronenmikroskopische (CLEM) Studien. Clem Studien haben meist auf der Verwendung von gentechnisch veränderten Mäusen fokussieren exprimierenden fluoreszierende Proteine, wie EGFP, die später mit elektronendichte Niederschlag markiert werden können , und bei der EM - Ebene 44 beobachtet. Alternativ kann das Problem der Immunhistochemie, Kryo-Fixierung umgehen kann mit einer intraneuronale Injektion von elektronendichten Marker, wie Quantenpunkten 45, vor dem Einfrieren kombiniert werden, so dass die Visualisierung auf der EM - Ebene 46. Allerdings sind Quantenpunkte nicht biokompatibel undihre Verwendung ist teuer und zeitaufwendig aufgrund der zusätzlichen Kühlvorrichtung für eine nachfolgende Gewebepräparation benötigt. Obwohl immer noch diese Techniken Kryo-Fixierung begünstigen und gefrierSubstitutionsVerfahren, gibt es einige Entwicklungen für die Verwendung von chemischen Tags auf halb dünne (300 nm) Abschnitte unterschiedliche zelluläre Proteine mit synthetischen Fluorophore etikettieren, die mit EM - Analyse korreliert werden können 47 . Techniken ermöglicht, beispielsweise die Korrelation zwischen einer spezifischen Axon Lokalisierungs Fluoreszenz- und seiner synaptischen Beziehung mit Neuronen einer gegebenen Zielstruktur unter Verwendung unter Verwendung von EM, sind recht vielversprechend für das Verständnis der Organisation des Nervensystemes, insbesondere in Primaten. In diesem Fall sollte Acrolein Fixierung über Glutaraldehyd bevorzugt werden, da diese Autofluoreszenz produzieren, die die richtige Visualisierung von Hirnstrukturen bei der LM-Ebene verändern könnten. Doch nur sehr wenige Studien dieser Art sind in Primaten durchgeführt worden ist, mostly aufgrund technischer Herausforderungen und die hohen Kosten, die solche Experimente zu verhängen. So werden neue Entwicklungen benötigt für eine erfolgreiche und kostengünstige CLEM Studien an Primaten, wie Fixationsmethoden zu verbessern oder chemische-Tags sichtbar sowohl an der LM und EM Ebenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC, 401848-2011 zu MP) unterstützt. MP erhielt eine Karriere Auszeichnung vom Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). LE war der Empfänger einer Promotionsstipendium aus dem FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Wir danken Marie-Josée Wallman für technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) | Fisher scientific | S374-500 | |
| Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4·H2O) | EM Science | SX0710-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher scientific | S271-3 | |
| Hydroxymethyl aminomethane (THAM) | Fisher scientific | T370-500 | |
| HCl | EMD | HX0603-3 | 1 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection. |
| NaOH | EMD | SX0590-1 | 5 N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection. |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection. |
| Acrolein (90%) | Sigma | 110221 | 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection. |
| Autopsy venting table | Mopec | CE400 | |
| Electronic perfusion pump | cole parmer | masterflex L/S 7523-90 | |
| Needle (perfusion) | terumo | NN-1838R | 18 G 11/2 |
| Needle | terumo | NN-2713R | 21 G 1/2 |
| Ketamine | 20 mg/kg | ||
| Xylazine | 4 mg/kg | ||
| Acepromazine | 0.5 mg/kg | ||
| Scalpel | |||
| Scalpel blades | Feather lance | 201011 J9913 | No.22 for surgery and No. 11 for EM |
| Surgical scissors | |||
| Rongeurs | |||
| Vibratome | Leica | VT 1200S | Calibrate blade before each use, when the device allows it |
| Vibratome razor blade | Gillette | GIN 642107 | |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | 30% dilution |
| Ethylene glycol | Fisher scientific | E178-4 | 30% dilution |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | S-9125 | |
| Normal horse serum (NHS) | Jackson immunoResearch Laboratories | 008-000-121 | 2% dilution |
| Cold-fish gelatin | Aurion | 900.033 | 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40% |
| Primary antibody, SERT | Santa Cruz biotechnology | SC-1458 | 1/500 dilution |
| Primary antibody, ChAT | Chemicon (Millipore) | AB144P | 1/25 dilution |
| Primary antibody, TH | ImmunoStar | 22941 | 1/1,000 dilution |
| Biotinylated secondary antibody, goat | Vector laboratories | BA-9500 | 1/1,000 dilution |
| Biotinylated secondary antibody, mouse | Vector laboratories | BA-2000 | 1/1,000 dilution |
| Vectastain elite ABC kit | Vector laboratories | PK6100 | 8.8 µL/mL of A and B each |
| 3,3'-diaminobenzidine (DAB) | Sigma | D5637 | 0.05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink. |
| Peroxide (H2O2) 30% | Fisher scientific | H-323 | 0.005% dilution |
| Osmium tetroxide (OsO4) | Electron microscopic science | 2% 19152 4% 19150 |
Original solution can be either 2 or 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection. |
| Durcupan water-repellent epoxy resin | Sigma | A: M epoxy resin (44611) B: hardener 964 (44612) C: accelerator 960 (DY 060) (44613) D: plasticizer (44614) |
Polymerize 48 h at 58 °C before throwing in waste. |
| Alumium cups | Electron microscopic science | 70048-01 | |
| Ethanol | commercial alcohols | 1019C | Dilute in distilled water with appropriate concentration |
| Propylene oxide | Electron microscopic science | 20401 | Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood. |
| Non-coated medium glass slides | brain research laboratories | 3875-FR | Grease surface with mineral oil |
| Plastic film (Aclar embedding film) | Electron microscopic science | 50425-25 | Grease surface with mineral oil |
| Ultramicrotome | Leica UC7 | EM UC7 | |
| Diamond trimming tool (ultratrim) | Diatome | UT 1081 | Can use glass knife alternatively |
| Ultra 45° Diatome Diamond knife | Diatome | MC13437 | equipped with a boat |
| Xylenes | Fisher scientific | X5SK-4 | |
| 150-mesh copper grids | Electron microscopic science | G150-cu | |
| grid-box | Electron microscopic science | 71138 | Can store up to 100 grids |
| Sodium citrate | Anachemia | 81983 | |
| Lead nitrate | Sigma | L-6258 | Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76 g of sodium citrate diluted in 42 mL of preboiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1 N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light. |
| Syringe | terumo | SS-05L | 5 mL |
| Syringe filter | Corning | 431222 | 0.2 µm |
| Absorbing paper (bibulous paper) | Electron microscopic science | 70086-1 | |
| Parafilm | Laboratory film | PM-999 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 |
References
- Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005 (2015).
- Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
- Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
- Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
- Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
- Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
- Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
- Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
- Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
- Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
- Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
- Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
- Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
- Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
- Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
- Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
- Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
- Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
- King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
- Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
- Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
- Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
- Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
- Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
- Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
- Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
- McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
- Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
- Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
- Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
- Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
- Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
- Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
- Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
- Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
- Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
- Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
- Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
- Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
- Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
- van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
- Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
- Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
- Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008 (2016).
- Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
- Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).
