Abstract
A-rilascio controllato diossido di cloro (ClO 2) sacchetto è stato sviluppato sigillando forma di fanghi di ClO 2 in pellicola polimerica semipermeabile; le proprietà di rilascio della sacca sono stati monitorati in contenitori con o senza frutta. Il sacchetto è stato applicata all'interno di una conchiglia forata contenente uva pomodori, e l'effetto sulla popolazione microbica, compattezza, e la perdita di peso è stata valutata durante un periodo di conservazione 14 giorni a 20 ° C. Entro 3 giorni, la concentrazione di ClO 2 nelle custodie di plastica ha raggiunto 3,5 ppm e rimane costante fino al giorno 10. Successivamente, si è ridotta a 2 ppm di giorno 14. Il ClO 2 sacchetto esposto forte attività antimicrobica, riducendo le popolazioni di Escherichia coli mediante 3,08 log CFU / g e Alternaria alternata popolazioni di 2,85 log CFU / g dopo 14 giorni di conservazione. Il trattamento ClO 2 ha anche ridotto la perdita di ammorbidimento e di peso e ha esteso la durata complessiva dei pomodori. I nostri risultatisuggeriscono che il trattamento ClO 2 è utile per estendere la shelf life e migliorare la sicurezza microbiologica dei pomodori durante la conservazione, senza compromettere la qualità.
Introduction
Una dieta ricca di frutta e verdura fresca può contribuire a ridurre il rischio di molte malattie, tra cui la malattia coronarica e specifici tipi di tumori 1. Tuttavia, ci sono un certo numero di agenti patogeni microbici di origine alimentare, come Escherichia coli, Salmonella enterica e Listeria monocytogenes, legati al consumo di frutta fresca e verdura che possono causare malattie o addirittura la morte tra i consumatori che mangiano contaminati prodotti 2. Ad esempio, E. coli O157: H7 focolai sono stati associati con l'uva, pomodori e fragole 3, 4, e le epidemie di epatite A sono stati associati con mirtilli freschi 5. Inoltre, la contaminazione microbica può causare la perdita sostanziale prodotto attraverso postharvest decadimento 6. Alternaria alternata è un importante impianto funghi patogeni t cappello è noto per provocare macchie fogliari e altre malattie in oltre 380 specie di piante ospiti 7. E 'stato dimostrato di essere la causa di una macchia nera Alternaria 8, una malattia gambo cancro e una piaga foglia di pomodoro 9. Pertanto, un trattamento post-raccolta decontaminazione sicuro ed efficace è necessario per entrambi i patogeni controllo e per evitare il decadimento post-raccolta in prodotti freschi.
tecnologie bassa e non residui sono nuove tendenze per disinfettanti alternativi. Una varietà di fungicidi post-raccolta sono stati utilizzati per ridurre gli organismi di deterioramento e per prevenire malattie a trasmissione alimentare. Ozono, un forte agente antimicrobico, ha dimostrato di preservare la qualità e la freschezza di fragole e mirtilli 10, 11. Tuttavia, l'ozono può causare l'ossidazione dei tessuti superficie del frutto e può provocare lo scolorimento e il deterioramento della qualità sapores = "xref"> 12. Il cloro è stato usato per disinfettare i prodotti freschi, come ad esempio i mirtilli e mele 13. Pur efficace, il cloro può reagire con composti contenenti azoto o ammoniaca, con conseguente sottoprodotti cancerogeni 14, specialmente se utilizzati per la sanificazione di frutta fresca 15.
Il biossido di cloro (ClO 2), in alternativa disinfettante, è stato approvato dalla Cina e gli Stati Uniti per il trattamento post-raccolta di frutta e verdura 16. ClO 2 è un agente ossidante idrosolubile con una capacità di ossidazione 2,5 volte superiore a quella di cloro libero 17. ClO 2 è altamente efficace a basse concentrazioni e con un breve tempo di contatto 18. ClO 2 ha una bassa tossicità e corrosività minima alle concentrazioni utilizzate per la disinfezione, ed è riconosciuto come uno dei più efficaci battericidae agenti fungicidi per l'uso in una varietà di impostazioni 19, 20, 21.
Numerosi risultati delle ricerche hanno dimostrato che ClO 2 può controllare patogeni e decadimento post-raccolta 16. Ad esempio, ClO 2 gas è stato utilizzato per inattivare L. monocytogenes, Salmonella e E. coli O157: H7 e prevenire mirtillo e fragola deterioramento 22, 23. ClO 2 gas riduce il rischio di contaminazione microbica, pur mantenendo le caratteristiche di frutta fresca, ed era efficace nel controllare il decadimento post-raccolta di fragole 24. Tuttavia, è instabile ad alte concentrazioni e non trasportabile storicamente richiedono costosi generatori sul posto o inefficiente due parti polvere miscelazione.
Tuttavia, un nuovo CIO2 prodotto con una formulazione pronta, a rilascio controllato (ad esempio, non richiede un generatore o la premiscelazione di ingredienti) ha dimostrato di essere altamente efficace nel controllare organismi cibo alteranti e patogeni in esperimenti preliminari 25. È un conveniente, non corrosivo, facilmente trasportabile, e la forma a rilascio controllato in sicurezza del ClO 2, senza effetti negativi sull'ambiente. Esperimenti precedenti hanno dimostrato che questo lento rilascio ClO 2 polvere avvolto in materiale di filtrazione e collocato nella confezione a conchiglia ha ridotto significativamente il decadimento di mirtilli e fragole, diminuita perdita di acqua bacche, frutta e mantenuto consistenza durante la conservazione post-raccolta 25, 26. Recentemente, un rilascio controllato ClO 2 pacchetto è stato sviluppato sigillando forma di fanghi di ClO 2 in una pellicola di polimero semipermeabile. Gli obiettivi di questo lavoro sono statia: 1) monitorare ClO proprietà release 2 gas sia in un contenitore chiuso e in clamshells forati, 2) studiare l'effetto di un rilascio controllato ClO 2 sacchetto racchiuso in un contenitore su patogeni e il decadimento di uva pomodori, e 3) valutare gli effetti del rilascio controllato ClO 2 sulla qualità dei pomodori uva stoccaggio.
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Protocol
1. Misurazione del gassoso ClO 2 nello spazio di testa di una camera chiusa
- Ottenere i materiali: ClO 2 sacchetto (0,5 g di ClO 2 slurry (9,5% AI) in un film polimero scelto per la sua velocità di rilascio (superficie totale del 6 cm 2); i componenti esatti sono di proprietà), una camera di vetro (19.14 L), ed un coperchio con ingresso di gas commutabile e uscita.
- Attaccare il sacchetto ClO 2 al coperchio mediante nastro biadesivo.
- Chiudere la camera sigillando il coperchio con vaselina.
- Collegare l'ingresso e l'uscita di un rilevatore di gas ClO 2 alla camera.
NOTA: Si tratta di un sistema di circolazione del gas, e si è verificato alcuna perdita di gas quando le misurazioni. - Accendere il flusso di ingresso e di uscita del gas e misurare la concentrazione di ClO 2 nella camera dopo incubazione di 0, 1, 2, 3, 4, 24, 26, 28, e 48 ore.
- Monitorare la temperatura e l'umidità relativa (RH) nella camera con calmaature e RH data logger.
2. Frutta Preparazione e conservazione
- Ottenere 15 kg di pomodori uva fresca (Solanum lycopersicum var. Cerasiforme) da un rivenditore locale. Assicurarsi che i frutti sono sani e non hanno difetti visivi.
- Preparazione dell'inoculo
- Utilizzare ceppi di E. coli (wild type) e A. alternata da superfici di agrumi 27 per l'inoculazione.
- Cultura E. coli su E. coli agar (ECA) a 35 ° C per 1 giorni 27 e poi ri-coltura gli organismi su una nuova piastra per 1 giorni. Confermare gli organismi campionando piastre ECA con un BAC-loop, striature i batteri sulla Levine eosina blu metilene (EMB) agar, e incubando per 24 ore a 35 ° C; culture che trasformano riflettente, verde metallico sono positivi per E. coli.
- Cultura A. alternata su patata destrosio agar (PDA) a 25 °; C fino spore appaiono.
- Raschiare le cellule di E. coli dalla piastra di agar in 50 ml di acqua distillata sterile fino a che la concentrazione stimata raggiunge 9 log CFU / ml usando un confronto con standard equivalenza torbidità McFarland. Aggiungere 1.950 ml di acqua sterile contenente 0,1% Tween-20 per fare 2 L totale del inoculo finale.
- Verificare la concentrazione cellulare mediante placcatura su piastre di agar diluizione CE. Raschiare le spore A. alternata dal mezzo di coltura e sospenderle in 2 L di acqua distillata sterile contenente 0,1% Tween-20.
NOTA: La popolazione finale di E. coli è stato del 7,5 log CFU / g, e la popolazione A. alternata era 5,5 log CFU / g.
- Posizionare 7 kg di pomodori in una vaschetta dell'acciaio inossidabile 10 L che è completamente coperto da un sacchetto autoclavabile. Posizionare il sacchetto e pan in una cappa di sicurezza. Applicare la soluzione inoculo (2 L) ai frutti usando uno spruzzatore grilletto applicata dall'alto agitando moderatamente lafrutti con una mano guantata.
- Dopo 5 minuti, collocare i pomodori in un unico strato su fogli sterilizzati e consentire loro di asciugare all'aria per 2 ore. Mettere circa 200 g di frutta ciascuno in twent-quattro 1 lb (~ 1,14 L) bivalve perforate.
- Ribaltare con cautela le lamine contaminati e metterli nella padella di acciaio. Togliere i guanti e metterle nella padella. Avvolgere la borsa autoclavabile e autoclave tutte le forniture contaminati a 121 ° C per 25 min.
- Fissare ClO 2 sacchetti per i coperchi delle 12 custodie di plastica. Utilizzare le altre 12 custodie di plastica come controlli. Pesare ogni intero a conchiglia. Conservare la frutta a 20 ° C per 14 giorni.
- Prendere campioni nei giorni 3, 7, 10, e 14. Esempi di tre custodie di plastica, che rappresentano 3 repliche, per il trattamento al giorno.
3. Monitoraggio di ClO 2 Concentrazione nei Conchiglie
- Inserire l'ingresso e l'uscita tubi del rivelatore di gas ClO 2 nel centro delle custodie di plastica, with una distanza 2 cm tra le due estremità, ed effettuare la misura ClO 2 nei giorni 3, 7, 10 e 14.
4. Determinazione della popolazione microbica e frutta attributi di qualità
- Agitare 5 frutti (circa 60 g) da ogni replicare a 100 rpm per 1 h in un sacchetto di campionamento sterilizzati insieme con 99 mi di tampone potassio fosfato sterile (0,01 M, pH 7,2) su un agitatore orbitale.
- Diluizioni seriali piastra (1-, 10-, e 100 volte) del tampone di lavaggio, 50 microlitri ciascuna, ECA (per E. coli) e PDA (per A. alternata) utilizzando un placcatore spirale.
- Incubare le piastre a 35 ° ECA C per 24 ore e le piastre PDA a 25 ° C per 3 giorni. Leggi la conta delle colonie microbiche utilizzando un lettore di piastre ottica. Disinfettare tutte le attrezzature, che ha contattato il frutto contaminati dopo l'uso.
- Misurare la fermezza frutta con un tester di frutta fermezza utilizzando il protocollo del produttore. Calibrare il tester primaogni utilizzo. Misura 20 frutta per ogni replica ed esprimere i risultati come la forza di pressione, Newton (N), necessaria per comprimere il frutto di 1 mm (convertito in N · m - 1).
- Pesare il tutto a conchiglia con la frutta ad inizio e durante la conservazione e calcolare la perdita di peso rispetto al peso iniziale.
5. Analisi statistica
- Replicare tutti gli esperimenti in triplice copia. Analizzare i dati utilizzando l'analisi della varianza (ANOVA). Determinare la separazione media da test a intervallo multiplo di Duncan; il significato è definito a p <0.05.
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Representative Results
Il rilascio di ClO 2 esposto un modello lineare sulle prime ore. La concentrazione aumentata di circa 2,38 ppm / h rispetto al primo 4 h. La velocità di rilascio rallentato dopo 24 ore di incubazione, e la concentrazione di ClO 2 ha raggiunto 25,4 ppm. Tuttavia, la concentrazione tendeva ad essere stabile dopo 24 ore di incubazione (Figura 1).
Lo spazio di testa concentrazione ClO 2 nella conchiglia con uva pomodori era circa 4 ppm tra il giorno 3 e il giorno 10, si è ridotta dopo 10 giorni di conservazione, ed era circa 2 ppm al giorno 14 (Figura 2). Le popolazioni iniziali di E. coli e A. alternata nel frutto dall'inoculo erano 4,3 e 3,4 log CFU / g, rispettivamente (Figura 3). Il trattamento con ClO 2 sacchetti ridotto le popolazioni di E. coli e A. alternata da 3,08 e2,85 log CFU / g, rispettivamente, dopo 14 giorni di conservazione (Figura 3).
Gli effetti del trattamento ClO 2 sulla consistenza dei frutti e perdita di peso sono presentati nelle figure 4 e 5. ClO 2 ha impedito una perdita di compattezza e peso nel frutto, e questi effetti cresciuto con tempo di conservazione prolungato (figure 4 e 5).
Figura 1: 2 ClO profilo di rilascio di un 0,5-g ClO 2 sacca in un contenitore di vetro sigillato, vuoto 19.14-L a 20 ° C e umidità relativa 91%.
Figura 2: Concentrazione di ClO 2 in 1 lb confezione forata bivalve200 g di pomodori dell'uva a 20 ° C. I valori sono la media ± SD.
Figura 3: Effetto del trattamento ClO 2 su E. coli e A. popolazioni alternata sulle superfici di pomodori uva inoculate conservate per 14 giorni a 20 ° C. I valori sono la media ± SD.
Figura 4: Effetto del ClO 2 trattamento sulla fermezza di pomodori dell'uva conservato per 14 giorni a 20 ° C. I valori sono la media ± SD.
Figura 5: Effetto del ClO 2 trattamento sulla perdita di peso di uva pomodoroes conservati per 14 giorni a 20 ° C. I valori sono la media ± SD.
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Discussion
Il biossido di cloro è un biocida ideale per prevenire il deterioramento cibo. Tuttavia, è instabile ad alte concentrazioni e non trasportabile, che richiedono generatori costosi o inefficienti due parti polvere miscelazione. Questo studio ha esaminato l'applicazione di una stalla, pronti per l'uso di biossido di cloro per ridurre il deterioramento degli alimenti e l'incidenza della malattia alimentare. A differenza di altre tecnologie applicative biossido di cloro attualmente in uso, la ClO commerciale 2 usato qui è conveniente, ha una lunga durata, e non richiedono grandi generatori o premiscelazione. Tuttavia, a causa delle forti proprietà ossidanti di ClO 2, le proprietà di rilascio del gas di ClO 2 sono difficili da misurare e quindi sono segnalati raramente. In uno studio precedente, un metodo di titolazione è stato utilizzato per misurare il tasso di rilascio 28. Tuttavia, questo metodo è meno preciso e più complicato. Alcune ricerche ha valutato la concentrazione di ClO 2 assorbendoin acqua e poi misurata utilizzando gascromatografia con spettrometria di massa (GC-MS) rilevamento 29. Tuttavia, questo strumento GC-MS è complicato e costoso 30. Nella nostra ricerca, un rivelatore di gas ClO 2 è stato usato per misurare la concentrazione di ClO 2. Questo rilevatore ha più sensori che forniscono risultati più accurati in un tempo più breve.
Nel nostro protocollo, per la preparazione dell'inoculo, l'uso di un, 10 L pan acciaio profonda lati come bacino per l'applicazione di inoculo, si è posta all'interno di un sacchetto autoclavabile, nonché foglio sterile su cui asciugare la frutta , permette una rapida pulizia e aiuta a evitare l'esposizione umana ad organismi patogeni eventualmente attraverso il contatto accidentale. Spruzzare il frutto entro i confini del sacchetto autoclavabile ridotto la dispersione di aerosol microbici. Essiccazione frutto sulla pellicola consentito per la rimozione completa e la successiva sterilizzazione di tutte le superficicon la quale il frutto contaminata era venuto in contatto.
Biossido di cloro esposto forte attività antimicrobica contro E. coli e A. alternata in uva pomodori (Figura 3). ClO soluzione 2 è stata usata per lavare frutta e verdura. Il trattamento con ClO 2 gas a 4.1 mg / L (1.484 ppm) per 20 min a 23 ° C significativamente ridotto la popolazione di Salmonella, E. coli O157: H7 e L. monocytogenes su appena tagliate lattuga, cavolo e carote, senza causare effetti negativi sulle proprietà sensoriali 31. Riduzioni superiori a 3-log di E. coli O157: H7 sono state raggiunte dopo 4 mg / L (1.448 ppm) ClO 2 trattamenti gas per 10 min a 21 ° C e 90% UR sulla mela superfici 32. Gli effetti del trattamento ClO 2 sulla consistenza dei frutti e perdita di peso sono presentati nelle figure 4 e 5. la fermezzadi ClO 2 -treated pomodori aumentate rispetto al frutto controllo (Figura 4). ClO 2 -treated frutta dimostrato attività enzimatica inibita, anche in perossidasi e polifenolo ossidasi, che è stato attribuito un ruolo importante nel processo di addolcimento 33, o tassi di respirazione inibiti e produzione di etilene 34, 35. Una relazione lineare tra rammollimento e perdita di peso è stata dimostrata in mirtilli 36. È stato suggerito che ClO 2 potrebbe ridurre il metabolismo frutta oltre a prevenire la perdita di peso e mantenere fermezza 37. Si è concluso che il sacchetto ClO 2 era una tecnica patogeno-riduzione promettente, non termica per frutta e verdura fresca. Ha mantenuto la fermezza e ha ridotto la perdita di peso di pomodori uva.
Una caratteristica limite di questo metodo di sanitatione è che anche se questa tecnologia ClO 2 può ridurre l'inoculo superficie pomodoro di A. alternata, riducendo il rischio di nuove infezioni postharvest da questo fungo, non sarà in grado di controllare stabilita, infezioni latenti di A. alternate 38. infezioni stabiliti sono tipicamente prodotte in campo prima del raccolto e sono la principale causa di pomodoro post-raccolta macchie nere, che causano notevoli perdite economiche per l'industria. Un'altra caratteristica limitante è la rapida reazione di ClO 2, che impedisce al prodotto da microrganismi combattere efficacemente che sono profondamente incorporate in un ambiente ricco di acqua o densi materiale organico 39. In genere, il potenziale sanificazione del prodotto a basse concentrazioni perde rapidamente efficacia prima di essere in grado di penetrare a sufficienza per l'interno di grandi frutti. La soluzione a questo problema, una maggiore concentrazione del prodotto, comportaproblemi propri, compresi gli effetti phytopathic e sbiancamento tessuto vegetale. Pertanto, per ogni applicazione unica di materie prime rispetto al patogeno, è necessario trovare una concentrazione disinfettante che bilancia l'efficacia antimicrobica con danni delle materie prime accettabili.
In sintesi, ClO 2 può essere utilizzata come disinfettante per controllare patogeni, lieviti e muffe sulla frutta. I risultati di questo studio suggeriscono che ClO 2 a basse concentrazioni per durate di tempo più lunghi in imballaggio attivo è utile per migliorare la sicurezza microbica e riducendo decadimento durante la conservazione senza alterare le proprietà fisiche del frutto. Le future applicazioni di questo protocollo includono testare l'efficacia del lento rilascio ClO 2 sacchetti in aggiunta al packaging commerciale contro gli agenti patogeni di origine alimentare e gli organismi di alterazione di qualsiasi numero di prodotti alimentari freschi, tra cui frutta, verdura, carni e pane esistente.
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il sostegno finanziario fornito da Worrell Water Technologies, LLC. Menzione di un marchio o prodotto di proprietà è solo per l'identificazione e non implica una garanzia o garanzia del prodotto da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curoxin® chlorine dioxide pouch | Worrell Water Technologies | Slurry, a.i. 9.5% in sealed semi-permeable polymer film | |
| Grape tomato | Santa Sweets, Inc | Santa Sweets Authentic | |
| ClO2 gas detector | Analytical Technology, Inc., Collegeville, PA | PortaSens II | |
| Perforated clamshell | Packaging Plus LLC, Yakima, WA | OSU #1, 1 lb | |
| Escherichia coli | Wild Type (WT) from fruit surface | ||
| Alternaria alternata | from fruit surface | ||
| E. coli agar | EC Broth, Oxoid, UK | EC Broth with 1.5% agar | |
| Potato dextrose agar | BD Difco, Sparks, MD | ||
| Levine eosin methylene blue agar | BD Difco, Sparks, MD | ||
| Trigger spray bottle | Impact Products, LLC., Toledo, OH | ||
| Sterilized sampling bag | Fisherbrand, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Orbit shaker | New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ | Innova 2100 | |
| IUL Instruments Neutec Eddy jet spiral plater inoculation plating system | Neutec Group Inc., Farmingdale, NY | ||
| EZ micro optical plate reader | Synoptics, Ltd., Cambridge, UK | ProtoCOL | |
| Fruit firmness tester | Bioworks Inc, Wamego, KS | FirmTech 2 | |
| Tinytag temperature and RH data logger | Gemini Data Loggers, West Sussex, UK | ||
| McFarland equivalence turbidity standard | Fisherbrand, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA |
References
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