Abstract
的控释二氧化氯（CLO 2）袋是由密封二氧化氯的浆液形式成半透聚合物膜显影;袋的释放特性在有或无果的容器进行了监测。将袋固定到含有葡萄西红柿穿孔蛤壳的内部，并在微生物群体，坚固性的效果，并在在20℃下14天的储存期进行评价的重量损失。在3天后，将二氧化氯浓度在蛤壳达到为3.5ppm和保持不变，直到第10天。此后，通过3.08日志CFU降低至2ppm白天14.二氧化氯袋显示出强大的抗微生物活性，从而减少大肠杆菌群体/克和链格孢种群由2.85日志CFU /克后存储14天。的二氧化氯处理也降低软化和体重减轻和延长了的西红柿的整体的货架寿命。我们的研究结果表明，二氧化氯的治疗是用于延长保质期和储存过程中改善的西红柿的微生物安全性而不损害它们的质量是有用的。
Introduction
丰富的新鲜水果和蔬菜的饮食可能有助于减少许多疾病，包括冠状动脉心脏疾病和特定类型的癌症1的风险。不过，也有一些食源性致病微生物，如大肠杆菌 ， 沙门氏菌和李斯特菌 ，新鲜水果和蔬菜，可能会导致消费者谁食用被污染的农产品2中患病甚至死亡的消费有关。例如， 大肠杆菌（E.coli）O157：H7爆发已经与葡萄，番茄，草莓和3,4相关联，并且甲型肝炎爆发已与新鲜蓝莓5相关联。此外，微生物污染可导致通过采后腐烂6实质的产品损失。 交链孢是一种重要的植物病原真菌ŧ帽是已知会导致叶斑和其他疾病中的植物7的超过380宿主物种。它已被证明是一种黑斑病 8，茎溃疡病，西红柿9的叶枯病的原因。因此，安全有效的采收后处理净化是需要两个控制食源性致病菌并防止采后腐烂在新鲜的农产品。
低收入和无渣技术是替代消毒剂的新趋势。各种采后杀菌剂已被用于减少腐败菌，防止食源性疾病。臭氧，强大的抗微生物剂，已显示出保留草莓和蓝莓10，11的质量和新鲜度。然而，臭氧可以引起水果表面组织的氧化，可导致变色和风味质量的恶化S = “外部参照”> 12。氯已被用于消毒新鲜农产品，如蓝莓和苹果13。虽然有效，氯可以与含氮化合物或氨反应，导致致癌的副产物14，用于新鲜水果15中的消毒时尤其如此。
二氧化氯（二氧化氯 ），洗手液的替代物，正在为水果和蔬菜16的采后处理批准中国和美国。二氧化氯是一种水溶性氧化剂与氧化能力比的游离氯17的大2.5倍。二氧化氯是在低浓度和具有短接触时间18非常有效。二氧化氯具有用于消毒浓度低毒性和最小的腐蚀性，并且它被认为是最有效的杀菌之一并在各种设置19，20，21使用杀菌剂。
众多的研究结果已经表明，二氧化氯可以控制食源性致病菌和采后腐烂16。例如，二氧化氯的气体已被用于灭活单增李斯特菌 ， 沙门氏菌和大肠杆菌 O157：H7和防止蓝莓，草莓变质22,23。二氧化氯的气体减少了微生物污染的风险，同时保持新鲜水果的属性，并且它是在控制草莓24的采后腐烂有效。然而，在高浓度和不可传输不稳定的，需要在历史上的网站或低效的两部分粉末混合昂贵发电机。
然而，一个新的CLO2产物与现成的，控制释放制剂（ 即，它不要求一个发生器或成分的预混合）已被证明是在控制的预备试验25食品腐败生物和病原体非常有效。它是一种安全，经济高效，无腐蚀性，易于运输和控释二氧化氯的形式，对环境无不良影响。先前的实验已经证明，该缓释CLO 2粉末包裹在过滤材料，并放置在吸塑包装显著减少的新鲜蓝莓和草莓的衰退，减少浆果失水，和采后存储器25，26期间维持果实硬度。最近，一种控释二氧化氯包通过在半透性聚合物膜密封二氧化氯的浆液形式开发的。这项工作的目标是：于：1）监测在两个封闭的容器中二氧化氯的气体释放性和在穿孔的蛤壳，2）调查控制释放二氧化氯袋封闭在上食源性致病菌的容器和葡萄西红柿的衰减的效果，以及3）评价对葡萄西红柿的质量存储控释二氧化氯的影响。
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Protocol
1.在封闭腔室的顶部空间气体二氧化氯的测定
- 获得的材料：二氧化氯袋（0.5克在选择用于其释放速率的聚合物膜CLO 2浆料（9.5％AI）的（6厘米2）的总表面面积;确切的组分是专有的），玻璃室（19.14 L），并具有可切换气体入口和出口的盖子。
- 附加二氧化氯袋使用双面胶带盖子。
- 通过密封用凡士林盖关闭所述腔室。
- 连接CLO 2气体检测到所述腔室的入口和出口。
注意：这是一个气体循环系统，并在测量时没有发生气体损失。 - 打开的入口和出口气体流量和测量所述室中的二氧化氯浓度为孵育后0，1，2，3，4，24，26，28，和48小时。
- 监测温度和相对湿度（RH）在与回火腔室ATURE和RH数据记录仪。
2.水果制品和存储
- 从本地零售商获得15千克的新鲜葡萄番茄（ 番茄变种cerasiforme）。确保水果是健康的，没有视觉上的缺陷。
- 接种的准备
- 使用从柑橘类水果表面27 大肠杆菌 （野生型）和链格孢的菌株接种。
- 在35℃下对大肠杆菌琼脂（ECA）培养大肠杆菌中27 1天，然后再培养于1天一个新板的生物体。通过与BAC-环采样ECA板，条纹上莱文细菌曙红亚甲基蓝（EMB）琼脂，并在35℃温育24小时，确认生物体;该转反射，金属绿培养是阳性的大肠杆菌 。
- 在马铃薯葡萄糖琼脂培养链格孢 （PDA），在25℃下直至孢子出现。
- 刮除从琼脂板中的大肠杆菌细胞在50mL的无菌蒸馏水直到估计浓度达到9日志CFU / mL的使用具有麦克法兰等价浊度标准的比较。加入1950毫升的含有0.1％无菌水吐温20，使2 L的总的最终接种物。
- 验证通过在埃克·阿加平板稀释电镀的细胞浓度。从培养基中刮去链格孢孢子，并将其暂停到2L含有0.1％Tween-20的无菌蒸馏水中。
注：最终大肠杆菌人口为7.5日志CFU / g，并且所述链格孢人口为5.5日志CFU / g以下。
- 放置7千克西红柿的入10升的不锈钢制锅，其是完全由耐高压加热的袋覆盖。放置在一个安全罩袋和锅。使用从顶部施加，同时轻轻搅拌该扳机喷雾器应用接种物溶液（2L）到水果水果用戴着手套的手。
- 5分钟后，将西红柿上灭菌片材的单个层，并允许他们在空气中干燥2小时。把约200g每个水果的成twent四个1磅（1.14〜L）穿孔的蛤壳。
- 小心地折污染箔和它们放入钢锅。取下手套，把它们放进锅里。包裹袋高压灭菌和高压釜中于121℃下所有污染的用品25分钟。
- 附着二氧化氯袋至12个蛤壳盖。使用其他12个蛤壳作为对照。称量每个整个翻盖。保存在20°C的水果14天。
- 采取样品第3天，7，10，和14样品3个蛤壳，代表3次重复，每人每天的治疗。
在蛤壳二氧化氯浓度3.监测
- 插入二氧化氯的气体检测器的入口和出口管导入蛤壳的中心，无线TH两个端部之间的2厘米的距离，并采取天3，7，10，和14中的二氧化氯的测量。
4.确定微生物种群和果实品质属性的
- 从各搅拌5种水果（约60g）复制在100rpm在无菌取样袋99毫升无菌磷酸钾缓冲液的沿轨道振荡器上1个小时（0.01M，pH 7.2）中。
- 的缓冲液洗涤板连续稀释液（1-，10-，和100-倍），每次50微升，在ECA（用于大肠杆菌 ），使用螺旋接种仪和PDA（对于链格孢 ）。
- 孵育在35℃下24个小时的ECA板和PDA平板在25℃下3天。读取使用的光学板阅读器中微生物菌落计数。清理所有设备在使用后接触到受污染的水果。
- 测量使用制造商的协议的果实硬度测试仪果实硬度。校准测试仪前每次使用。测量水果20为每个复制和表达的结果作为压力力，牛顿（N），由1毫米到压缩果需要（换算成N·米- 1）。
- 称取与水果整个蛤壳式的开始处和在储存过程中和计算相比于初始重量的重量损失。
5.统计分析
- 复制所有实验一式三份。分析使用方差分析（ANOVA）分析数据。确定由Duncan多范围检验的均值分离;的意义是在p <0.05所定义。
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Representative Results
二氧化氯的释放显示出在最初的几个小时的线性图案。浓度在第一4小时增加约2.38 PPM /小时。温育24个小时后的释放速度减慢，并且二氧化氯浓度达到25.4 ppm的。然而，浓度趋向于孵育的24个小时（ 图1）后保持稳定。
顶部空间二氧化氯浓度与葡萄西红柿蛤壳为3天和第10天之间约4ppm，它储存后10天降低，并且它是在第14天（ 图2）约2ppm。 大肠杆菌的初始种群和链格孢在水果 接种后分别为4.3和3.4日志CFU /克，分别为（ 图3）。与CLO治疗2袋由3.08减少大肠杆菌和链格孢的人口和2.85日志CFU /克，分别储存后的14天（ 图3）。
二氧化氯处理对果实硬度和重量损失的影响在图4和5给出。二氧化氯防止硬度和重量损失在水果，并且这些影响增长具有持久的贮存时间（ 图4和5）。
图1：在20℃的0.5克二氧化氯小袋在密封的空19.14-L玻璃容器和相对湿度91％的二氧化氯释放曲线。
图2：在1磅穿孔吸塑包装用二氧化氯浓度在20℃下200克葡萄西红柿。的值是平均值±SD。
图3： 二氧化氯处理对大肠杆菌和链格孢群体的影响 上，在20℃下储存14天接种葡萄西红柿的表面。的值是平均值±SD。
图4：二氧化氯处理对在20℃储存14天，葡萄西红柿的硬度的影响。的值是平均值±SD。
图5：二氧化氯处理对葡萄番茄的重量损失的影响存储14天的ES在20℃。的值是平均值±SD。
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Discussion
二氧化氯是防止食品腐烂的理想杀菌剂。然而，在高浓度和非运输的，需要昂贵的发电机或低效的两部分粉末混合不稳定。本研究二氧化氯的稳定，随时可以使用形式的应用，以减少食品腐败和食源性疾病的发生率。相较于目前使用的其他二氧化氯应用技术，这里使用的商业二氧化氯具有成本效益，具有保质期长，且不需要大型发电机或预混。然而，由于二氧化氯的强氧化性，二氧化氯的气体释放性难以测量，因此很少报道。在先前的研究中，使用滴定法测量释放速率28。但是，这种方法是不准确的，更复杂。一些研究通过吸收评估二氧化氯的浓度它在水中，然后使用气相色谱-质谱（GC-MS）检测29测量它。然而，该GC-MS仪器是复杂且昂贵30。在我们的研究中，使用了二氧化氯的气体检测器以测量二氧化氯的浓度。该检测器具有多个传感器，用于提供在更短的时间更精确的结果。
在我们的协议，用于接种物的制备中，使用了深片面的，10升钢盘作为用于接种物的应用盆的，本身放置在高压灭菌袋内，以及在其上以干燥水果无菌箔，可以快速清理，并有助于避免通过偶然接触人体暴露于可能致病微生物。喷射高压灭菌袋的范围内的水果减少微生物气溶胶的分散体。干燥上箔果允许完全移除和所有表面的随后的灭菌与受污染的水果已经接触到。
二氧化氯表现出强的抗微生物活性对大肠杆菌和葡萄西红柿链格孢 （ 图3）。二氧化氯溶液已被用来洗水果和蔬菜。与二氧化氯的气体处理在4.1毫克/升（1484 ppm的），用于在23℃下20分钟沙门氏菌 ， 大肠杆菌 O157的人口显著降低：H7，和单增李斯特菌对鲜切莴苣，卷心菜，胡萝卜，而对感官性状31造成恶劣影响。 大肠杆菌 O157的高于3-数减少：H7是后4毫克/升（1448 ppm的）二氧化氯在21℃10分钟和90％RH对苹果表面32气体处理来实现的。二氧化氯处理对果实硬度和重量损失的影响在图4和5给出。坚定性CLO的2 -处理的西红柿增加与对照相比果（ 图4）。二氧化氯 -处理的水果证明抑制的酶的活性，包括在过氧化物酶和多酚氧化酶，这是由于在软化过程33中起重要作用，或抑制呼吸速率和乙烯生产34,35。软化和体重减轻之间的线性关系表现在蓝莓36。有人建议，二氧化氯可以减少在除了防止减肥和保持坚定性37果实新陈代谢。得出的结论是，二氧化氯袋是一种很有前途的，无热，病原体减少的新鲜水果和蔬菜的技术。它维持硬度和降低了的重量损失葡萄西红柿。
sanitat的这种方法的一个限制特性离子的是，虽然此二氧化氯技术可减少链格孢的番茄表面接种物，通过这种真菌减少新的收获后的感染的风险，也不会能够控制建立，A.备用 38的潜感染。成立感染在收获前场通常生产和采后是番茄黑点，这造成显著的经济损失该行业的主要原因。另一个限制特性是二氧化氯 ，这防止产品从被深深嵌入一个富含水的环境或致密的有机材料39内有效地打击微生物的快速反应。通常，在低浓度产品的消毒潜在很快能够充分渗透到大型水果内部之前失去效力。对这个问题的解决方案，该产品的更高浓度，进行与它它自己的问题，包括phytopathic效果和植物组织漂白。因此，对于商品与病原体的每个唯一应用，有必要找到一种平衡具有可接受的商品损伤抗微生物效力消毒剂浓度。
总之，二氧化氯可用作杀菌剂以控制水果食源性致病菌，酵母菌和霉菌。本研究中的结果表明，二氧化氯在低浓度对活性包装更长的持续时间是用于提高微生物安全和贮存过程中减少衰减而不损害水果的物理性质是有用的。本协议的未来应用包括测试有效性缓释二氧化氯袋作为除了现有的对食源性致病菌和任何数量的新鲜食品，包括水果，蔬菜，肉类和面包的腐败菌商业包装。
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Acknowledgments
我们要感谢由Worrell水技术有限责任公司提供的财政支持。商标或专利产品的提及仅是为了进行识别，并不意味着由农业部美国农业部保证或产品的保证。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curoxin® chlorine dioxide pouch | Worrell Water Technologies | Slurry, a.i. 9.5% in sealed semi-permeable polymer film | |
| Grape tomato | Santa Sweets, Inc | Santa Sweets Authentic | |
| ClO2 gas detector | Analytical Technology, Inc., Collegeville, PA | PortaSens II | |
| Perforated clamshell | Packaging Plus LLC, Yakima, WA | OSU #1, 1 lb | |
| Escherichia coli | Wild Type (WT) from fruit surface | ||
| Alternaria alternata | from fruit surface | ||
| E. coli agar | EC Broth, Oxoid, UK | EC Broth with 1.5% agar | |
| Potato dextrose agar | BD Difco, Sparks, MD | ||
| Levine eosin methylene blue agar | BD Difco, Sparks, MD | ||
| Trigger spray bottle | Impact Products, LLC., Toledo, OH | ||
| Sterilized sampling bag | Fisherbrand, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Orbit shaker | New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ | Innova 2100 | |
| IUL Instruments Neutec Eddy jet spiral plater inoculation plating system | Neutec Group Inc., Farmingdale, NY | ||
| EZ micro optical plate reader | Synoptics, Ltd., Cambridge, UK | ProtoCOL | |
| Fruit firmness tester | Bioworks Inc, Wamego, KS | FirmTech 2 | |
| Tinytag temperature and RH data logger | Gemini Data Loggers, West Sussex, UK | ||
| McFarland equivalence turbidity standard | Fisherbrand, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA |
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