Abstract
制御放出二酸化塩素（のClO 2）パウチ半透性ポリマーフィルムへのClO 2のスラリー状の封止によって開発されました。ポーチの放出特性を持つか、果物のない容器にモニターしました。パウチはグレープトマトを含む穿孔クラムシェルの内部に固定し、微生物集団、堅さ、および体重減少に対する効果は20°Cで14日間の保存期間中に評価しました。 3日以内に、クラムシェル中のClO 2濃度は3.5 ppmのに達し、その後10日目まで一定のままで、それは/のClO 2パウチは3.08対数CFUによって大腸菌の個体数を減少させる、強力な抗菌活性を示し、14日目によっては2ppmまで低下しました貯蔵の14日後の2.85対数CFU / GによってG及びアルテルナリアalternata集団 。 ClO 2処理は、軟化および体重減少を低減し、トマトの全体的な貯蔵寿命を延長しました。我々の結果ClO 2治療は貯蔵寿命を延長し、その品質を損なうことなく保存中のトマトの微生物の安全性を向上させるために有用であることを示唆しています。
Introduction
新鮮な果物や野菜が豊富な食事は、冠状動脈性心臓病や癌1の特定の種類を含む多くの疾患のリスクを軽減するのを助けることができます。しかし、農産物2を汚染食べる消費者の間で病気や死さえを引き起こす可能性があり、新鮮な果物や野菜の消費に伴う、 大腸菌 、 サルモネラ菌 、およびリステリア菌などの食中毒微生物病原体の数が、あります。例えば、 大腸菌 O157：H7の発生は4、ブドウ、トマト、イチゴ及び3に関連している、およびA型肝炎の発生は、新鮮なブルーベリー5に関連しています。また、微生物汚染は収穫後の崩壊6を通じてかなりの製品損失を引き起こす可能性があります。 ルナリアのalternataは重要な植物病原性真菌トンであります帽子は、植物7の380以上の宿主種における葉のスポットや他の病気を引き起こすことが知られています。 ルナリア黒点8、幹潰瘍病とトマト9の葉枯病の原因であることが示されています。したがって、安全で効果的な収穫後の汚染除去処理の両方の制御食品媒介病原体に必要とされ、新鮮な農産物で収穫後腐敗を防止します。
低・非剰余技術は、代替消毒剤のための新しいトレンドです。収穫後の殺菌剤の様々な腐敗生物を低減し、食中毒を予防するために使用されています。オゾン、強力な抗菌剤は、イチゴとブルーベリー10、11の品質と鮮度を保つことが示されています。しかし、オゾンは、果実の表面組織の酸化を引き起こし、変色や風味品質の劣化につながることができますS = "外部参照"> 12。塩素は、ブルーベリーやリンゴ13のように、生鮮食品を消毒するために使用されています。有効ながら、塩素は、新鮮な果物15の消毒のために使用する場合は特に、発癌性副生成物14が得られ、窒素含有化合物又はアンモニアと反応することができます。
二酸化塩素（二酸化塩素2）、消毒剤の代替は、果物や野菜16の収穫後の治療のために、中国と米国の両方によって承認されました。 ClO 2は、遊離塩素17のそれよりも2.5倍高い酸化能を有する水溶性酸化剤です。 ClO 2は非常に低濃度で効果的で短い接触時間18です。 ClO 2は、消毒のために使用される濃度で毒性が低く、最小限の腐食性を有し、それは最も効果的な殺菌の一つとして認識されていますそして、設定19、20、21の様々な使用のための殺菌剤。
数多くの研究結果は、のClO 2は、食品媒介病原体と収穫後の腐敗16を制御することができることを示しています。 H7及びブルーベリーとイチゴ腐敗22,23を防止するために：例えば、のClO 2ガスは、 リステリア・モノサイトゲネス 、 サルモネラ 、 大腸菌 O157を不活性化するために使用されてきました。新鮮なフルーツの属性を維持しながらのClO 2ガスは、微生物汚染のリスクを低減し、そしてそれはイチゴ24の収穫後の減衰を制御するのに有効でした。しかし、歴史的サイトまたは非効率的な二部粉末混合に高価な発電機を必要とする、高濃度及び非輸送性で不安定です。
しかし、新しいのClO既製、制御放出製剤（ すなわち、それは発電機または成分の予備混合を必要としない）で2製品が予備実験25において食品腐敗生物及び病原体を制御するのに非常に有効であることが示されました。それは、安全で費用対効果の高い、非腐食性、容易に輸送、および環境に対する悪影響はないとのClO 2の制御放出形態です。以前の実験は、濾過材で包み、クラムシェル包装に入れ、この徐放性のClO 2粉末は著しく、新鮮なブルーベリーとイチゴの崩壊を減少ベリー水分損失を減少し、収穫後の記憶部25、26間に果実硬度を維持することを実証しました。最近では、制御放出のClO 2のパケットは、半透性ポリマー膜中のClO 2のスラリー状の封止によって開発されました。この作業の目的でした：1）両方の密閉容器中のClO 2つのガス放出特性を監視し、穿孔クラムシェルで、2）のClO 2ポーチは食品媒介病原体に対する容器及びグレープトマトの減衰で囲まれた制御放出の効果を調べ、そして3）グレープトマトのストレージ・品質上の制御放出のClO 2の効果を評価します。
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Protocol
密閉室のヘッドスペース中のガス状のClO 2の1の測定
- 材料を得る：のClO 2ポーチ（その放出速度（6 cm 2の総表面積）のために選択されたポリマーフィルム中のClO 2スラリー（9.5％AI）0.5gの、正確なコンポーネントが独自のもの）、ガラスチャンバー（19.14 L）、及び切り替え可能ガスの入口と出口を有する蓋。
- 両面テープを使用して蓋へのClO 2ポーチを取り付けます。
- ワセリンで蓋を密封することにより、チャンバを閉じます。
- チャンバへのClO 2ガス検知器の入口と出口を接続します。
注：これはガス循環システムであり、測定を行う際に何のガス損失が発生していません。 - インキュベートした後、入口および出口ガス流をオンにし、チャンバ中のClO 2濃度を測定0、1、2、3、4、24、26、28、及び48時間。
- 気性で室内の温度と相対湿度（RH）を監視atureとRHデータロガー。
2.フルーツ調製および保存
- 地元の小売店からの新鮮なブドウのトマト（ ナスリコペルシカム VAR。cerasiforme）の15キロを取得します。果物は健康的であり、視覚的な欠陥を持っていないことを確認してください。
- 接種材料の調製
- 接種のために柑橘類果実の表面27からの大腸菌 （野生型） およびA. alternataの株を使用します。
- その後、1日27及び再培養1日の新たなプレート上の生物の35℃での大腸菌寒天 （ECA）で培養大腸菌 。 、BAC-ループとECAプレートをサンプリングLevineのエオシンメチレンブルー（EMB）寒天上で細菌を画線し、35℃で24時間インキュベートすることによって生物を確認します。反射金属緑色を入れた培養物は、大腸菌に対して陽性です。
- 25℃でポテトデキストロース寒天（PDA）上の文化のA. alternata; Cは、胞子が表示されるまで。
- 推定された濃度は、マクファーランド等価濁度標準との比較を用いて、9ログCFU / mLに達するまで滅菌蒸留水50mlに、寒天プレートから大腸菌細胞を掻き取ります。最終接種の2 Lの合計を作るために、0.1％のTween-20を含有する滅菌水1,950ミリリットルを加えます。
- エック・エイガープレート上の希釈メッキによって細胞濃度を確認してください。培養培地からのA. alternata胞子をこすり、0.1％のTween-20を含有する滅菌蒸留水2Lにそれらを停止します。
注：最終的な大腸菌集団は7.5対数CFU / gであり、 およびA. alternata集団は5.5対数CFU / gでした。
- 完全にオートクレーブ袋で覆われている10リットルのステンレス鋼パンにトマトの7キロを置きます。安全フード内袋とパンを置きます。穏やかに攪拌しながら、上から適用トリガー噴霧器を使用して、果実に接種溶液（2L）を適用手袋をはめた手で果物。
- 5分後、滅菌シート上の単層でトマトを配置し、それらを2時間空気乾燥することを可能にします。 twent個の1ポンド（1.14〜L）有孔クラムシェルに各果実の約200gを入れました。
- 慎重に汚染されたホイルを折り畳むとスチールパンに入れます。手袋を外して、鍋に入れます。オートクレーブ袋をラップし、25分間121℃で、すべての汚染物資をオートクレーブ。
- 12のクラムシェルの蓋にのClO 2袋を取り付けます。コントロールとして、他の12のクラムシェルを使用してください。それぞれ全体のクラムシェルを秤量します。 14日間20℃で果物を保管してください。
- 一日あたりの処理ごとに、3回の反復を表す、日3、7、10でサンプルを取り、そして14サンプル3つのクラムシェル。
クラムシェル中のClO 2濃度の3モニタリング
- クラムシェルの中心へのClO 2ガス検知器の入口と出口チューブを挿入し、WI両端の2cmの距離目、および3日目、7、10、および14上のClO 2測定を行います。
微生物集団と果実品質属性の4決意
- それぞれから5つの果実（約60 g）を攪拌をオービタルシェーカー上で滅菌リン酸カリウム緩衝液（0.01M、pH7.2）中の99ミリリットルと共に滅菌サンプリングバッグで1時間、100rpmで複製します。
- バッファー洗浄のプレート連続希釈（1-、10-、および100倍）、50μLそれぞれ、ECAにスパイラルプレーターを使用して（A. alternataのため）、PDA（E. coliについて）。
- 3日間、25℃で24時間、35℃でECAプレート及びPDAプレートをインキュベートします。光学プレートリーダーを用いて微生物のコロニー数をお読みください。使用後に汚染された果物と接触し、すべての機器をサニタイズ。
- 製造業者のプロトコルを使用して果実の硬さ試験機で果実の硬さを測定します。前にテスターを校正各使用。各複製のための20果物を測定し、1mmだけ果実を圧縮するために必要な圧力の力、ニュートン（N）として結果を表す（Nに変換・M - 1）。
- 開始時および保管時のフルーツと全体のクラムシェルを秤量し、初期重量と比較して減量を計算します。
5.統計解析
- 三重ですべての実験を複製します。分散分析（ANOVA）を使用してデータを分析します。ダンカンの多重範囲検定による平均分離を決定します。重要性は、p <0.05で定義されています。
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Representative Results
ClO 2のリリースでは、最初の数時間にわたる直線状のパターンを示しました。濃度は、最初の4時間にわたって約2.38 ppmの/ hに増加しました。放出速度は、インキュベーションの24時間後に鈍化、及びのClO 2濃度は25.4 ppmで達しました。しかし、濃度はインキュベーションの24時間（ 図1）の後に安定である傾向がありました。
グレープトマトクラムシェルにおけるヘッドスペースのClO 2濃度は3日目と10日目の間に約4 ppmであった、それは貯蔵の10日後に減少し、それは14日目（ 図2）に約2 ppmでした。果物で、大腸菌 およびA. alternataの初期集団 接種後にそれぞれ4.3及び3.4対数CFU / gを、（ 図3）でした。 3.08によって大腸菌 およびA. alternataの集団を減少のClO 2パウチを用いた治療と2.85対数CFU / gを、それぞれ、貯蔵の14日後（ 図3）。
果実の堅さおよび体重減少でのClO 2処理の効果は、 図4および図 5に示されています。 ClO 2は、果実に堅さと体重の損失を防止し、そしてこれらの効果は、長期保存の時間（ 図4及び5）で成長しました。
図1：20℃、相対湿度91％で密封し、空19.14-Lガラス容器に0.5グラムのClO 2のパウチのClO 2放出プロファイル。
図2と1ポンド穿孔クラムシェル包装中のClO 2の濃度20℃でのグレープトマト200gの。値は平均±SDです。
図3： 大腸菌 およびA. alternata集団でのClO 2処理の効果 接種グレープトマトの表面に20°Cで14日間保存しました。値は平均±SDです。
図4：20℃で14日間保存グレープトマトの堅さでのClO 2処置の効果。値は平均±SDです。
図5：ブドウのトマトの減量にのClO 2処理の効果ESは、20°Cで14日間保存します。値は平均±SDです。
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Discussion
二酸化塩素は、食品の腐敗を防止するための理想的な殺生物剤です。しかし、高価なジェネレータ又は非効率的な二部粉末混合を必要とする、高濃度及び非輸送性で不安定です。この研究は、食品の腐敗や食中毒の発生率を低減するための二酸化塩素の安定した、すぐに使用できる形式の適用を検討しました。現在使用されている他の二酸化塩素の応用技術とは対照的に、ここで使用される市販のClO 2は 、費用対効果のある長い貯蔵寿命を持っており、大規模な発電機や予備混合を必要としません。しかし、のClO 2の強い酸化特性のために、のClO 2のガス放出特性は測定が困難であるため、稀に報告されていません。以前の研究では、滴定法は、放出速度28を測定するために使用されました。しかし、この方法は、より正確で、より複雑です。いくつかの研究では吸収することでのClO 2の濃度を評価しましたその水で、その後は、質量分析（GC-MS）検出29をガスクロマトグラフィーを使用して測定しました。しかし、このGC-MS機器は、複雑かつ高価である30。私たちの研究では、二酸化塩素2ガス検知器は、二酸化塩素2の濃度を測定しました。この検出器は、より短い時間でより正確な結果を提供する複数のセンサーを持っています。
我々のプロトコルでは、接種材料の調製のために、接種材料を適用するための流域深い両面、10 Lのスチールパンの使用は、それ自体がオートクレーブバッグ内に配置され、並びに果実を乾燥させるために無菌箔、迅速なクリーンアップを可能にし、偶発的な接触を通じて、おそらく病原生物に対する人間の曝露を回避するのに役立ちます。オートクレーブバッグの範囲内で実を噴霧は、微生物エアロゾルの分散を減少しました。完全に除去すると、すべての面のその後の滅菌のために許さ箔上にフルーツを乾燥これで汚染された果物は接触していました。
二酸化塩素は、 大腸菌およびブドウトマトでのA. alternata（ 図3）に対して強い抗菌活性を示しました。 ClO 2溶液は、果物や野菜を洗うために使用されています。 、新鮮なカットレタス、キャベツ、ニンジン上H7、およびリステリア・モノサイトゲネス ：23℃で20分間、4.1 MG / L（1,484 PPM）でのClO 2ガスを用いた治療は有意サルモネラ 、 大腸菌 O157の集団を減少しました感覚的特性31に悪影響を引き起こすことなく。 大腸菌 O157の3対数減少よりも高い：H7は32リンゴ表面に21℃、90％RHで10分間後に4mg / L（1,448 ppm）でのClO 2つのガス処理を達成しました。果実の堅さおよび体重減少でのClO 2処理の効果は、 図4および図 5に示されています。ハリ二酸化塩素の2個の処理トマトは、制御果実（ 図4）と比較して増加します。 ClO 2が果実軟化工程33において重要な役割、または阻害呼吸速度とエチレン生産34、35に起因したペルオキシダーゼおよびポリフェノールオキシダーゼ、を含め、阻害された酵素活性を示した-処理しました。軟化及び体重減少の間の線形関係は、ブルーベリー36で実証されました。それはのClO 2は、減量を防止し、硬さ37の保持に加えて、果実の代謝を減らすことが示唆されました。これは、二酸化塩素2袋は新鮮な果物や野菜のための有望な、非熱、病原体低減技術であると結論しました。これは、硬さを維持し、グレープトマトの減量を削減しました。
sanitatのこの方法の限界特性イオンは、こののClO 2の技術は、この菌によって新しい収穫後の感染のリスクを低減させる、 のA. alternataのトマト表面接種を低減することができるが、A.代替 38の確立され、潜伏感染を制御することができないということです。設立の感染症は通常、収穫前のフィールドで生産され、業界に多大な経済的損失を引き起こす収穫後のトマト黒い斑点、の主な原因であるされています。別の限定的特性を効果的に深く水が豊富な環境又は高密度有機材料39内に埋め込まれた微生物を駆除から製品を防ぐのClO 2、の迅速な反応です。典型的には、低濃度で製品の消毒電位はすぐ十分に大きな果実の内部に浸透することができる前に有効性を失います。この問題を解決するには、製品の高濃度は、それを運びますphytopathic効果や植物組織の漂白を含め、独自の問題、。したがって、病原体に対して、商品の各固有のアプリケーションのために、許容可能な商品の損傷と抗菌効果のバランスをとる消毒剤の濃度を求める必要があります。
要約すると、のClO 2は、果実に食品媒介性病原体、酵母、およびカビを制御するために消毒剤として使用することができます。本研究での所見は、アクティブなパッケージに長い持続時間のために低濃度でのClO 2は、微生物の安全性を改善し、果実の物理的特性を損なうことなく貯蔵中の腐敗を低減するために有用であることを示唆しています。このプロトコルの将来のアプリケーションは、果物、野菜、肉、およびパンなどの生鮮食品の任意の数の食品媒介病原体および腐敗生物に対する既存の商用パッケージに加えて、徐放性のClO 2袋の有効性をテストしています。
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Acknowledgments
私たちは、ウォーレルウォーター・テクノロジーズ、LLCが提供する財政支援に感謝したいと思います。商標または専有物の言及は、識別のみのためのものであり、米国農務省による製品の保証または保証を意味するものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curoxin® chlorine dioxide pouch | Worrell Water Technologies | Slurry, a.i. 9.5% in sealed semi-permeable polymer film | |
| Grape tomato | Santa Sweets, Inc | Santa Sweets Authentic | |
| ClO2 gas detector | Analytical Technology, Inc., Collegeville, PA | PortaSens II | |
| Perforated clamshell | Packaging Plus LLC, Yakima, WA | OSU #1, 1 lb | |
| Escherichia coli | Wild Type (WT) from fruit surface | ||
| Alternaria alternata | from fruit surface | ||
| E. coli agar | EC Broth, Oxoid, UK | EC Broth with 1.5% agar | |
| Potato dextrose agar | BD Difco, Sparks, MD | ||
| Levine eosin methylene blue agar | BD Difco, Sparks, MD | ||
| Trigger spray bottle | Impact Products, LLC., Toledo, OH | ||
| Sterilized sampling bag | Fisherbrand, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Orbit shaker | New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ | Innova 2100 | |
| IUL Instruments Neutec Eddy jet spiral plater inoculation plating system | Neutec Group Inc., Farmingdale, NY | ||
| EZ micro optical plate reader | Synoptics, Ltd., Cambridge, UK | ProtoCOL | |
| Fruit firmness tester | Bioworks Inc, Wamego, KS | FirmTech 2 | |
| Tinytag temperature and RH data logger | Gemini Data Loggers, West Sussex, UK | ||
| McFarland equivalence turbidity standard | Fisherbrand, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA |
References
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