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Biochemistry

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Published: April 17, 2017 doi: 10.3791/55464
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Chemistry, York University, 2The Centre for Research in Mass Spectrometry, York University, 3The Centre for Research on Biomolecular Interactions, York University

Summary

Konformationsänderungen Flexibilität spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinfunktion. Hier beschreiben wir die Verwendung von zeitaufgelöster Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie gekoppelt Wasserstoff-Deuterium-Austausch für die schnellen Strukturveränderungen Sondieren, die Funktion in geordneten und ungeordneten Proteinen treiben.

Abstract

Intrinsisch ungeordneten Proteine ​​(IDPs) sind seit langem eine Herausforderung an Strukturbiologen gewesen aufgrund ihres Mangels an stabilen Sekundärstrukturelemente. Wasserstoff-Deuterium-Austausch (HDX) bei schnellen Zeitskalen gemessen ist einzigartig geeignet Strukturen und Wasserstoffbindungsnetzwerke zu detektieren, die kurz aufgefüllt werden, so dass für die Charakterisierung von transienten Konformeren in nativer Ensembles. Die Kopplung von HDX Massenspektrometrie bietet mehrere Vorteile, darunter eine hohe Empfindlichkeit, geringe Probenverbrauch und ohne Beschränkung auf Proteingröße. Diese Technik hat sich stark in den letzten Jahrzehnten fortgeschritten, einschließlich der Fähigkeit HDX Kennzeichnungszeiten auf der Millisekunden-Zeitskala zu überwachen. Zusätzlich wird durch den HDX Workflow auf einer mikrofluidischen Plattform enthält eine saure Protease Mikroreaktor-Gehäuse, sind wir dynamischen Eigenschaften bei der Peptidebene lokalisieren können. In dieser Studie, zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (Tresi-MS), die mit HDX was verwendet, um ein detailliertes Bild von Reststruktur in dem Tau-Protein zur Verfügung zu stellen, sowie die Konformationsänderung auf Hyperphosphorylierung induzierten Verschiebungen.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten haben bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung von analytischen Techniken entworfen worden , um die Proteinstruktur und Dynamik 1, 2, 3, 4 zu messen. Während Röntgenkristallographie das Prinzip Werkzeug zur Bestimmung der Proteinstruktur, hohe Konzentrationen an Protein bleibt benötigt werden und umfangreiche Optimierung erforderlich Diffraktionsqualität Kristalle zu erzeugen. Proteine , die schwer zu kristallisieren, wie beispielsweise membranassoziiertes und intrinsisch ungeordneten Proteine klassisch durch Wasserstoff-Deuterium - Austausch (HDX) NMR 5 untersucht worden. Doch in den letzten Jahrzehnten Kopplung von Elektrospray - Ionisations - Massenspektrometrie (ESI-MS) zu HDX hat sich schnell an Popularität gewann 6, 7.

Die Massenspektrometrie bietet eine Lösungzu viele der durch Röntgenkristallographie und NMR gestellt Einschränkungen. Insbesondere MS ist sehr empfindlich (nM bis uM Konzentrationen erforderlich), und es gibt praktisch keine Begrenzung für Proteingröße. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Tastgrad von MS-Analyse der Möglichkeit von Proteinen zu studieren, wie sie enzymatischen Umsatz, misfolding, Komplexierung und andere biologisch relevante Prozesse unterzogen werden. Diese Prozesse treten häufig auf den von Millisekunden bis Sekunden Zeitskala und erfordern eine schnelle Vermischung von Reagenzien vor der Analyse.

Die Entwicklung des Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisation (Tresi) von Wilson und Konermann 2003 erlaubten Reaktionen in pseudo-Echtzeit durch ESI-MS überwacht werden. Ihre Einrichtung einen kapillaren Mischer mit einem stufenlos einstellbaren Reaktionskammervolumen 8 eingebaut. Die Vorrichtung besteht aus zwei konzentrischen Kapillaren, mit der inneren Kapillare abgedichtet und einer Kerbe in die Seite geschnitten zum Mischen innerhalb des engen inter Kapillarsystem zu ermöglicheny Raum von der Kerbe zu dem Ende der inneren Kapillare (typischerweise 2 mm). Wenn auf HDX Experimente angewandt, wobei die innere Kapillare das Protein von Interesse trägt, trägt die äußerte Kapillare die Kennzeichnung D 2 O - Lösung, die dann mit dem Protein erfährt vermischt , bevor das einstellbare Reaktionskammer eintretenden zum Etikettieren von HDX ermöglicht vor dem direkten Transfer in die ESI Quelle.

Kurz gesagt, verlässt sich HDX auf Wasserstoffe Rückgrat Amid mit Deuteriumatomen in Lösung 9, 10 unterzogen Austausch. Der Austausch ist basenkatalysierte bei physiologischem pH-Wert, mit Säure-Katalyse bei pH 2,6 unter etwa verbreitet zu werden. Der Wechselkurs basiert auf vier Hauptfaktoren: pH, Temperatur, Lösungsmittelzugänglichkeit und intramolekulare Wasserstoffbindung. Da die ersten beiden Faktoren konstant während des gesamten Versuchs gehalten werden, ist der Wechselkurs, insbesondere bei Peptidgerüst Amid Positionen, in erster Linie dependent auf die Proteinstruktur 11. Dicht Regionen gefaltet mit umfangreichen, stabilen Wasserstoffbrücken - Netzwerken in α-Helices und β-Faltblätter werden Deuterium bei wesentlich geringeren Geschwindigkeiten im Vergleich zu Schleifen und ungeordneten Bereiche (und manchmal gar nicht) 12 aufzunehmen. Dies ermöglicht eine globale Proteinanalyse, in den Störungen in der Struktur (z. B. bei der Aggregation oder Substratbindung) führen zu unterschiedlicher Deuterium Aufnahme (Abbildung 1).

Die kinetischen kapillaren Mischer können in eine Mikrofluidik-Plattform integriert werden, um eine proteolytische Kammer für die Lokalisierung der Deuterium-Aufnahme enthält. Diese proteolytische Kammer wird bei niedrigem pH - Wert gehalten , um effektiv die Austauschreaktion zu auslöschen, und erfordert eine immobilisierte Säure - Protease, um das Protein in lokalisierte Peptide (Abbildung 2) zu verdauen. Überwachung Backbone Austausch in Millisekunden bis Sekunden Zeitskalen ist besonders wichtig für dieCharakterisierung von Konformationsänderungen innerhalb schwierig Schleifenregionen, geschmolzene Kügelchen und intrinsisch ungeordnete Proteine (IDPs) 13, 14 zu charakterisieren. Alternativ kann Tresi-HDX auch Proteine verwendet werden , zu charakterisieren , die derzeit keine gelöste Atomstruktur durch die Verfahren der Röntgenkristallographie und NMR haben, Deuterium - Austausch mit dem COREX - Algorithmus gekoppelt unter Verwendung von (DX-COREX) Ansatz 15, 16. Dieses detaillierte Protokoll Tresi-HDX gilt tau zu studieren, ein IDP, sowohl sie als auch nativer Form ist, wie es pathogen hyperphosphorylated Zustand. Während einheimischer tau eine der gut untersucht IDPs ist, ist nur wenig über sein amyloidogenen Gegenstück 13 bekannt.

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Protocol

HINWEIS: Wenden Sie sich alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Fumes hergestellt durch Laserablation von Poly (methylmethacrylat) (PMMA) können toxisch sein. Achten Sie darauf, dass der Laser-Graveur an eine funktionierende Lüftungsanlage angeschlossen ist. Verwenden Sie alle geeigneten Praktiken Sicherheit bei der Mikrofluidik-Vorrichtung des Aufbau einschließlich der Verwendung von technischen Kontrollen (Dunstabzug, Behälter für spitze Gegenstände) und persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Gesichtsmaske, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe). Es ist von größter Bedeutung High Performance Liquid Chromatography (HPLC) grade Reagenzien, wann immer möglich zu verwenden, mit allen Sein von ACS-Qualität oder höherer störende Verunreinigungen während der Analyse zu verringern.

1. Herstellung der mikrofluidischen Vorrichtung

  1. Der Bau der PMMA Mikrofluidik-Plattform
    1. Erhalten, die einen Standard-PMMA-Block (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) und Laser-Ablatieren einen Eingangskanal zum Einführen des Reaktionsteilnehmers, ein proteoLysekammer und ein Ausgangskanal mit einem Laser-Graveur 17, 18 verwendet wird .
      HINWEIS: Ätzen der Proteolyse Kammer in einer länglichen ovalen Form (30 x 5 x 0,05 mm). Der Eingangs- und Ausgangskanal zu dem Ende der PMMA-Blöcke erstrecken muss und nicht größer als 75 & mgr; m sowohl in der Breite und Tiefe, um eine 30 ga Kapillare aufzunehmen.
    2. Geschnitten, um ein 30 GA Edelstahlmetall Kapillare in zwei Stücke von etwa 10 cm je ein Drehwerkzeug mit einer 1/64" dick abgeschnittenen Scheibe zu ermitteln. Ein Schleifpapier um die Ende der Kapillaren zu glätten (dies kann durch Betrachten unter a erleichtert werden, Lichtmikroskop).
    3. Schmelzen die Kapillaren in die geätzten Poly (methylmethacrylat) block mit einem Lötkolben verwendet wird. Der Eingangskanal wird auf automatisierte Spritzenpumpen angeschlossen werden, und der Ausgabekanal wird zur Kopplung in die MS verwendet werden.
  2. Der Bau der Durchlaufzeitaufgelöste Kinetic Mixer
    1. Besorgen Sie sich einen fusioniertenQuarzglas-Kapillare (ID: 75 & mgr; OD: 150 & mgr; m) von etwa 40 cm, und sie in eine Edelstahlmetall Kapillare 28 GA von etwa 15 cm ein. In Abhängigkeit von der Reaktionszeit erforderlich ist, verwenden Sie einen längeren äußeren Metall Kapillare oder eines mit einer größeren ID.
      HINWEIS: Die Ermittlung der ‚wahre‘ Innendurchmesser der Metallkapillare ist entscheidend für eine genaue Reaktionszeiten zu erhalten. Dies kann durch Anbringen der Metallkapillare an eine HPLC durchgeführt werden, fließt Lösungsmittel obwohl die Kapillare, und Aufzeichnen der Rückdruck. Ein Gegendruck zu Innendurchmesser Berechnung kann gemacht werden, und das wahre Innendurchmesser des Metall Kapillare bestimmt. Dies kann die Molecular Weight Calculator Software berechnet werden (für Windows Version 6.49).
    2. Erzeugt eine 2 mm Kerbe unter Verwendung niedrigen Strom Laserengraver Einstellungen an einem Ende des inneren Glaskapillare und verschließen dieses Ende der inneren Glaskapillare (Abbildung 2). Alternativ macht die Kerbe eine Glaskeramik Kapillarsystem mity Schneidwerkzeug oder ein Rotationsschleifer mit einem feinen Schneidklinge.
    3. Aufstellung der innere Glaskapillare mit dem Ende des Metall Kapillare (dies kann durch Betrachten unter einem Lichtmikroskop erleichtert werden).
    4. Befestigen diesen kinetischen Mischer an ein Ende der Misch - T (Abbildung 2).
    5. Anhänge einen Quarzglas-Kapillare (ID: 75 & mgr; OD: 150 & mgr; m) von etwa 40 cm zu dem gegenüberliegenden Ende des kinetischen Mischer auf dem Misch-T. Dies wird verwendet, Säure (5% Essigsäure, pH 2,4) zu liefern, um die Reaktion abzuschrecken.
      HINWEIS: mit automatisierten Infusionspumpen Reaktanten werden auf das Gerät mit gasdichten Spritzen durch Polytetrafluorethylen (PTFE) -Schlauch geliefert.
  3. Pepsin-Aktivierung
    1. Abwiegen 20 mg Pepsin aus Schweine Magenschleimhaut und suspendieren sie in 1 ml Kopplungspuffer (0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 6,0).
    2. Man wiegt 50 mg N - Hydroxysuccinimid (NHS) -aktivierten Agaroseperlen, fügt die Re-suspended Protease und dreht sanft über Nacht bei 4 ° C.
    3. Spin down bei 1000 × g für 2 min bei Raumtemperatur um das Harz zu sammeln.
    4. Absaugen ungebundene Protease.
    5. Inkubiere die Agarose in 1 ml Blockierungspuffer (1 M Tris-HCl, pH 6,0) und drehen sich sanft bei Raumtemperatur für 1 h.
    6. Spin down bei 1000 × g für 2 min bei Raumtemperatur um das Harz zu sammeln.
    7. Absaugen Blockierungspuffer.
    8. Inkubiere die Pepsin-Agarose mit 1 ml 5% Essigsäure, pH 2,4 für 5 min.
    9. Spin down bei 1000 × g für 2 min, um das Harz zu sammeln.
    10. Den Überstand aspirieren.
    11. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.8 - 1.3.10 für insgesamt drei Wäschen.
    12. Lagern Sie die Beads in 1 ml Essigsäure bei 4 ° C für die langfristige Nutzung.
  4. Vorrichtungsaufbau
    1. Füllen der Proteolyse Kammer mit der Aufschlämmung aus aktiviertem Pepsin-Agarosekügelchen in 5% Essigsäure einen sterilen Spatel verwendet wird.
    2. Legen Sie die PMMA mikrofluidischen platform zwischen zwei Leer PMMA-Blöcke als Abdeckung der Vorrichtung abzudichten, gefüttert mit Silikonkautschuk eine flüssigkeitsdichte Abdichtung zu schaffen.
    3. Verwenden metallische Klemmplatten zu Druckdichtung der Vorrichtung.
      HINWEIS: Die Klemme wurde speziell hergestellt, um die mikrofluidische Plattform zu passen, und besteht aus zwei Platten messen 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm.
    4. Strom 5% Essigsäure, pH 2,4 bei einer Rate von 10 & mgr; l / min. Fließ 50 mM Ammoniumacetat-Puffer (pH 6,9), obwohl die Protein-Linie mit einer Rate von 1 & mgr; l / min.
      HINWEIS: Es ist äußerst wichtig, dass die Essigsäure in der Gesamtheit des Experiments durch die Vorrichtung kontinuierlich fließen. Sicherzustellen, dass keine Leckagen sind und daß die Fluid austritt nur aus dem Ausgangskanal, die als die ESI-Quelle dienen.
    5. Koppel die Vorrichtung mit dem vorderen Ende eines modifizierten Quadrupol-Time-of-Flight (Q-TOF) Massenspektrometers einer einstellbare isolierte Stufe unter Verwendung Elektrosprüh optimale Bedingungen zu erreichen.
      HINWEIS: Ein Bypass-Schalterwird eingeführt, um das Vorhandensein einer kommerziellen ESI-Quelle zu simulieren. 17

2. Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch

  1. Erwerb von Pepsin und Protein nur Spectra
    HINWEIS: ESI-MS Erfassung wird in positivem Ionen-Modus mit einer Spannung von 4500 bis 5000, 60-V Declustering Potential und 250 V-Fokussierungspotential durchgeführt. Spektren werden über einen Bereich von 350-1,500 m / z mit einer Abtastrate von 1 s -1 erworben.
    1. Erwerben Sie ein Pepsin nur Spektrum. Etwaige Spitzen in diesem Spektrum erscheinen, werden abgezogen, sobald das Protein zugegeben wird.
    2. Einführung von 50-100 uM tau / phospho-tau - Protein (reinigen und vorzubereiten , wie zuvor beschrieben , 13, 19) mit einer Rate von 1 & mgr; l / min , wo die 50 mM Ammoniumacetat - Puffer zuvor fließt wurden.
    3. Erwerben Sie ein Protein nur Spektrum.
  2. Acquisition of Zeitpunkte
    1. Während 100 uM tau / phospho-tau - Protein fließt bei 1 & mgr; l / min, D 2 O mit einer Rate von 3 & mgr; l / min über einen T - Verbinder einzuführen und ermöglichen , in dem kinetischen Mischer zu reagieren. Man läßt das System für mindestens 10 min vor dem Erwerb des Spektrums äquilibrieren.
      HINWEIS: Nach dem Austausch wird die Markierungsreaktion durch die Strömung von Essigsäure pH 2,4 bei 10 & mgr; l / min und der Verdauung des markierten Proteins erfolgt in der proteolytischen Kammer abgeschreckt wird.
    2. Um die Markierung der Zeit zu erhöhen, ziehen manuell die Position der inneren Glaskapillare zurück zu erreichen Zeiten von 42 ms bis 8 s zu mischen. Man lässt das System für mindestens 10 min äquilibrieren zwischen jedem pull-back.

3. Daten und statistische Analyse

  1. Identifizierung von Peptiden und Berechnung der Prozentsatz der Deuterium-Austausch
    1. Führen Sie MS - Spektren analysiert mit mMass Software, Version 5.5.0 20
    2. Peptide , die die Identifizierung ExPASy Proteomics - Server FindPept und bestätigen durch kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) , wenn 21 erforderlich.
      HINWEIS: Hier wurde Deuterium Aufnahme Inkorporation gemessen , um eine in-house entwickelte Fortran - Software für die Isotopenverteilungsanalyse 22, 23 verwendet wird .
    3. Berechne die theoretischen intrinsischen Raten auf der Grundlage der Primärsequenz des Web - Tool unter Verwendung KUGEL 22, 24.
    4. Passen , die Daten einzelne exponentielle nichtlineare Regression unter Verwendung von und normalisieren eine Visualisierungs- und statistische Software (zB SigmaPlot).
      HINWEIS: Das Verhältnis von k int / k obs ergibt den Schutzfaktor (PF), ein semi-quantitatives Maß für den Grad , dass eine bestimmte Region innerhalb des Konformationsensembles strukturiert ist.

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Representative Results

Verdauung Profile von nativen und Phospho-tau waren ähnlich, die jeweils eine Sequenz von 77,1 Abdeckung und 71,7% erhalten wird. Deuterium Aufnahmewerte jedes Peptids wurde durch Anpassen der beobachteten Isotopenverteilungen mit den theoretischen Verteilungen unter Verwendung einer Software im Hause entwickelten FORTRAN erzeugt wird, bestimmt. Die am besten passenden Verteilungen werden (Abbildung 3a) gezeigt , zusammen mit den zugehörigen Deuterium Aufnahmewerten. Uptake kinetische Profile werden dann erzeugt und wurden auch durch einfache exponentielle Ausdrücke beschrieben. Kinetische Profile für alle Peptide bei 3 oder mehr Kennzeichnungszeiten beobachtet (n = 3) wurden analysiert. Diese einzelnen exponentiellen Anpassungen an die beobachtete Aufnahmewerte ergeben die Austauschgeschwindigkeitskonstante k obs für jedes Peptid. Dies ist im Vergleich zu dem primärsequenzabhängig „random coil“ intrinsischen Geschwindigkeitskonstanten k Int. Der berechnete PF (k int / k </ em> obs) bei 1,52 s wird auf repräsentative Strukturen von nativen und hyperphosphoryliertem Tau (4) abgebildet.

Wie erwartet, wurden keine PFs in dem Bereich, der normalerweise in Verbindung mit Sekundärstrukturelementen beobachtet bestätigt, dass natives tau schwache interne Wasserstoffbindung aufweist. Signifikanter Schutz wird an der N- und C-Termini, die zentralen Domäne , und die Aggregation neigende (Hexapeptide I und II) Bereiche (4) beobachtet. Nach 1,52 s, ist, 90% des Proteins deuteriert, mit vollem Austausch unter 2 min in auftreten.

Das native Protein kann zu einem veränderten Zustand verglichen werden, in diesem Fall den amyloidogenen hyperphosphorylated Zustand, wo wir einen allgemeinen Anstieg der Deuterium-Aufnahme über das Protein zu beobachten. Es gibt signifikante Anstiege an den N- und C-Termini und in der H2-Region. Der allgemeine Anstieg der Aufnahme unterstützt die current Hypothese, dass die Protein-Hyperphosphorylierung verursacht eine ausgedehnte Struktur anzunehmen. im nativen Zustand zu fast keinen Schutz im hyperphosphorylated Zustand der beiden Hexapeptide, zeigt H2 die größte Zunahme der Deuterium-Aufnahme von einem der am stärksten geschützten Bereichen zu sein. Dies deutet darauf hin, dass die Exposition der H2-Domäne für amyloidogenesis entscheidend ist. Auf der anderen Seite, sind einige der Bereiche, eine Verringerung der Aufnahme ausstellenden Regionen L114 bis Q124 Spanning und G326 bis S352. Der letztere Bereich entspricht die Mikrotubuli-assoziierte R3 und R4 Regionen in der Wiederholungsdomäne. Diese Strecke von neu gebildeter Reststruktur stimmt mit früheren Studien , die zeigen , dass hyperphosphoryliertem Tau eine verringerte Affinität für Mikrotubuli - 25 zu binden. Die Region L114 bis Q124 Spanning wird im nativen Zustand als mit einer erheblichen Neigung zur helikale Struktur, und die Abnahme der Aufnahme identifiziert wird, kann zu einer höheren Häufigkeit von seco zurückzuführen Ndary Struktur im hyperphosphorylierten Zustand.

Abbildung 1
Abbildung 1 : Schematische Darstellung eines Proteins unterzogen HDX vor der massenspektrometrischen Analyse. Das Protein von Interesse wird in eine Lösung von Deuteriumoxid (D 2 O) verdünnt, was einen labiler Wasserstoff durch Deuterium Rückgrat über die Zeit auszutauschen. Hochdynamische Regionen schnell austauschen und müssen auf die Millisekunde auf den zweiten Zeitskala überwacht werden. Andere Regionen starre Sekundärstrukturen enthalten, werden langsamer auszutauschen. Die Austauschreaktion wird durch Abschrecken mit Säure (pH 2,4), beendet die auch das Protein für die Digestion mit einer Säure - Protease ermöglicht entfalten (zB Pepsin). Verdauung lokalisiert das Niveau der Deuterium-Aufnahme über verschiedene Bereiche des Proteins. lank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Versuchsaufbau für Tresi-HDX-MS. Eine Detailansicht des kinetischen Mischer wird unten gezeigt. Der Mischer besteht aus zwei konzentrischen Kapillaren, ein inneren Quarzgut Glaskapillare in einem äußeren Metall Kapillare. Eine Kerbe ist 2 mm von dem Ende der inneren Kapillare mit einem verstopften Ende gemacht, für Protein so dass die Kerbe schließen und mit dem eingehenden Deuterium mischte. Dieser kinetische Mischer ist mit einem Misch-T angebracht. Auf der gegenüberliegenden Seite des Mischers, ein Kanal 5% Essigsäure (pH 2,4) zu liefern ist, angebracht ist. Nach dem Abschrecken der Reaktion gelangt das deuterierte Protein durch die Proteolyse mit Pepsin Kammer-Agarosekügelchen, um zu verpackende peptische Peptide herzustellen. Das distale Kapillare wird als eine ESI-Quelle verwendet.es / ftp_upload / 55464 / 55464fig2large.jpg“target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3. Typische Workflow von Rohdaten in kinetische Diagramme für ausgewählte Peptide aus dem nativen und hyperphosphorylated Protein. (A) Rohspektrum für vier Peptide (Spalten) sind vorhergesagt Isotopenverteilungen ausgerüstet% der Deuterium - Aufnahme bei drei verschiedenen Zeitpunkten (Zeilen) zu bestimmen. (B) Beobachten kinetische Grund% Deuterium Aufnahme über die Zeit für jedes Peptid ( durchgezogene Linie) verwendet , k obs zu extrahieren. Kinetic Plots für alle Peptide wurden bei 3 oder mehr Kennzeichnungszeiten beobachtet (n = 3), Fehlerbalken stellen SE Die berechnete „random coil“ Profil (gestrichelte Linie) ist zum Vergleich gezeigt. Übernommen aus Zhu et al. 8 mit freundlicher Genehmigung.Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. HDX Schutzfaktordaten gemappt repräsentative Strukturen von (a) Natives Volllängen - Tau und (b) hyperphosphoryliertem Tau. Struktur von hyperphosphorylated tau wurde mit FRODAN Simulation mit anschließender Verfeinerung mit Vadar erzeugt. Schutzart Faktoren wie ein Regenbogen Schema gefärbt wie in der Legende (links) gezeigt. Übernommen aus Zhu et al. 8 mit freundlicher Genehmigung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Während der Strukturbiologie Methoden wie die Röntgenkristallographie und NMR vorteilhaft sind, weil sie äußerst detaillierte Strukturen von Proteinen liefern, sind diese Bilder oft statisch. Die Charakterisierung von transienter Spezies und schwach strukturierter Domänen weiterhin schwer sein, wenn sie von diesen herkömmlichen Verfahren untersucht. Deshalb, um dynamische Erkenntnisse über diese Art von Systemen zu gewinnen, ist es wichtig, bei schnellen Zeitskalen zu arbeiten. Wir haben erfolgreich angewandt Tresi-HDX-MS detaillierte Erkenntnisse über die Konformationsänderungen zu erhalten innerhalb eines gut erforschten IDP auf einer lokalisierten peptidischen Ebene auftreten. Eine der wichtigsten Einschränkungen dieser Technik ist, dass Pepsin ist eine unspezifische Protease und, auf seine eigene, produziert selten eine vollständige Abdeckung Sequenz. Eine Möglichkeit zu helfen , Sequenzabdeckung und Spezifität zu verbessern , ist zu Protease Typ XIII von Aspergillus saitoi zu der Digestionskammer 26 zu verbinden.

Es ist wichtig, dassdie Digestionskammer wird bei einem pH - Wert von 2,4 während der Gesamtheit des Experiments, um wirksam abzuschrecken die Austauschreaktion und zur Verringerung der Menge an rückAustausch 11 gehalten. Es ist zwingend notwendig, dass alle Proteolyse Schritte und die anschließende Analyse so schnell wie möglich durchgeführt werden. Frühere Studien haben die Größe der Digestionskammer optimiert und Strömungs vorgeschlagen Raten um 22 , um die Höhe der Rückaustausch auf ein vernachlässigbares Niveau (≤5%) bei Raumtemperatur zu halten. Es wird dringend empfohlen, dass die Größe der Kammer ist nicht größer als die Abmessungen innerhalb dieses Protokolls aufgeführt. Ein hochstrukturierte Protein nicht signifikante Mengen an Deuterium auf der Millisekunde genau zu zweiter Zeitskala einnehmen und wird schwierig sein, in der Zeit von der Proteolyse Kammer erlaubt zu verdauen. Solche Proteine ​​sind nicht für die Studie mit dieser Technik empfohlen.

Während wir die Verwendung von 50 mM Ammoniumacetat-Puffer (pH 6,9) für t empfehlener Proteinprobe, nicht alle Proteine ​​werden mit dieser Konzentration oder pH-Wert kompatibel sein. Es ist wichtig, das pI des Proteins zu beachten, und stellen Sie die Puffer entsprechend mindestens 1 pH-Einheit über oder unter sein. Dadurch wird sichergestellt, dass das Protein die erforderliche Oberflächenladung für eine korrekte Faltung und Aggregation verhindern benötigt hat. Eine Erhöhung der Konzentration von Ammoniumacetat zur Aggregation neigen Proteine ​​empfohlen, um die Löslichkeit zu erhöhen, jedoch oberhalb von 500 mM-Konzentrationen vermieden werden soll.

Tresi-HDX-MS wird am besten auf Systeme angewendet besteht aus großen Schleifenregionen, geschmolzenen Kügelchen oder transient Sekundärstrukturelemente 22. Darüber hinaus gibt es verschiedene wirtschaftliche Vorteile dieser Technik, da es einfach und relativ kostengünstig zu implementieren ist. Vor kurzem gibt es 27 in der pharmazeutischen Industrie für Wirkstoffforschung und Entwicklung ein Anstieg bei der Verwendung von HDX-MS gewesen. Im Laufe der letzten zehn Jahres hat es ein schnelles Wachstum von biologischen Makromolekülen gewesen, insbesondere monoklonale Antikörper (mAb), wobei von der FDA zugelassen. Im Vergleich zu niedermolekularen Wirkstoffen, Strukturen höherer Ordnung von Proteinen und ihre Konformationsdynamik spielen eine große Rolle bei der Bestimmung der Wirksamkeit von Medikamenten. HDX-MS erfolgreich als Bestätigung Werkzeug für die Herstellung von Antikörpern biosimilar 28 sowie die Charakterisierung von Antikörper-Antigen - 29, 30, 31 und Protein-Ligand - Wechselwirkungen 32 verwendet. Die Fortschritte in der Software-Entwicklung und Automatisierung von Experimenten beschleunigt Analysezeiten für die weiteren Ausbau dieser Technik in naher Zukunft möglich ist.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(methyl methacrylate) or PMMA Professional Plastics SACR.250CCP 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm
Fused Silica Glass Capillary Polymicro Technologies 106815-0018 ID: 75 µm, OD: 150 µm
Metal Capillaries McMaster-Carr 28 ga – 89875K97
30 ga  - 89875K99
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing IDEX 1477
1548		 ID: 0.007”, OD: 1/16”
ID: 0.020”, OD: 1/16”
Standard Polymer Tubing Cutter IDEX A-327 for 1/16” and 1/8” OD tubing
Micro Static Mixing Tee IDEX M-540 for 1/16” OD tubing
or
Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore Valco Instruments Co., Inc. (VICI) ZT1C for 1/16” OD tubing
PEEK Tee for 1/16” OD Tubing IDEX P-727
10-32 Female to Female Luer IDEX P-659
10-32 PEEK Double-Winged Nut IDEX F-300
Ferrule for 1/16” OD Tubing IDEX F-142
100 Series Rotary Tool Dremel F013010001
Cut-Off Discs Jobmate 1/64” thickness
Stereomaster Digital Zoom Microscope Fisher Scientific 12-563-411
Soldering Iron Mastercraft 58-6301-2
VersaLaser Universal Laser
Syringes Hamilton 81220 500 µL capacity
Syringe Pumps Harvard Apparatus 70-4501
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
NHS-Activated Agarose Fisher Scientific 26196
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa Sigma-Aldrich P6887-250MG
Deuterium Oxide Sigma-Aldrich 151882-10X0.6ML
Acetic Acid Sigma-Aldrich 695092-100ML
HPLC Grade Water Fisher Scientific W5-4
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich A7330-500G
Sodium Phosphate Fisher Scientific S369-500
Sodium Chloride Fisher Scientific S671-3
Name Company Catalog Number Comments
Software/Online Tools
CorelDraw X3 Corel
Molecular Weight Calculator Version 6.49 Open Source MS Tool
mMass Version 5.5.0 Open Source MS Tool
ExPASy FindPept Swiss Institute of Bioinformatics
SigmaPlot Systat Software Version 11.0
PyMOL Schrödinger Version 1.5.0.4
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer AB SCIEX

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References

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Biochemistry Heft 122 zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisation Massenspektrometrie Wasserstoff-Deuterium-Austausch Proteindynamik intrinsisch ungeordnete Proteine Mikrofluidik
Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik
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Lento, C., Zhu, S., Brown, K. A., Knox, R., Liuni, P., Wilson, D. J. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. J. Vis. Exp. (122), e55464, doi:10.3791/55464 (2017).

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