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Immunology and Infection

प्रेसिजन कटौती माउस फेफड़े स्लाइस लाइव फेफड़े वृक्ष के समान कोशिकाओं कल्पना करने के लिए

doi: 10.3791/55465 Published: April 5, 2017

Summary

हम प्रेसिजन कटौती फेफड़े स्लाइस (PCLS) पैदा करने और उन्हें immunostaining फेफड़ों में विभिन्न प्रतिरक्षा सेल प्रकार का स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए के लिए एक विधि का वर्णन। हमारे प्रोटोकॉल स्थिति की एक किस्म के तहत स्थान और कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं के समारोह कल्पना करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

Abstract

एलर्जी और रोगाणुओं की साँस लेना फेफड़े में प्रतिरक्षा प्रकार की कोशिकाओं की एक किस्म में अनेक परिवर्तन elicits। प्रवाह cytometry प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर कोशिका की सतह प्रोटीन के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, लेकिन यह फेफड़ों के भीतर इन कोशिकाओं का स्थानीयकरण और प्रवास पैटर्न पर कोई जानकारी नहीं प्रदान करता है। इसी तरह, कीमोटैक्सिस assays कोशिकाओं की क्षमता का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो में कीमोटैक्टिक कारकों पर प्रतिक्रिया के लिए किया जा सकता है, लेकिन इन assays बरकरार फेफड़ों के जटिल वातावरण पुन: पेश नहीं करते। इन उपर्युक्त तकनीक के विपरीत, फेफड़ों के भीतर अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं के स्थान आसानी से प्रेसिजन कटौती फेफड़े स्लाइस (PCLS) पैदा करने, उन्हें व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, fluorescently टैग एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना, और कोंफोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा वर्गों visualizing द्वारा देखे जा सकते हैं। PCLS दोनों रहते हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और फेफड़े के ऊतकों को ठीक किया और स्लाइस बड़े जैसे क्षेत्रों धरना कर सकते हैं एक पूरी लोब के एक क्रॉस सेक्शन के रूप में। हम इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक फेफड़ों में प्रकार की कोशिकाओं, वृक्ष के समान कोशिकाओं की अलग-अलग प्रकार, मैक्रोफेज, neutrophils, टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं है, साथ ही इस तरह के लसीका, endothelial के रूप में संरचनात्मक कोशिकाओं सहित की एक विस्तृत विविधता के स्थान कल्पना करने के लिए, और उपकला कोशिकाएं। इस तरह के वृक्ष के समान कोशिकाओं और टी कोशिकाओं, लाइव, तीन आयामी फेफड़े के ऊतकों में के बीच उन लोगों के रूप में सेलुलर बातचीत, कल्पना करने के लिए की क्षमता है, पता चलता है कि कोशिकाओं फेफड़ों के भीतर ले जाने और स्थिर अवस्था में और सूजन के दौरान एक दूसरे के साथ बातचीत कर सकते हैं। इस प्रकार, जब इस तरह के फ्लो और मात्रात्मक पीसीआर के रूप में अन्य प्रक्रियाओं, के साथ संयोजन में उपयोग किया, PCLS सेलुलर घटनाओं आबाद फेफड़ों की एलर्जी और भड़काऊ रोगों की एक व्यापक समझ के लिए योगदान कर सकते हैं।

Introduction

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इस तरह के lipopolysaccharide (LPS) के रूप में पूर्व-शोथ उत्तेजनाओं की साँस लेना के बाद, वहाँ, में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के एक समन्वित आंदोलन है के भीतर, और फेफड़ों से। उदाहरण के लिए, न्यूट्रोफिल तेजी से फेफड़ों पैरेन्काइमा और वायु-मार्ग के लिए भर्ती कर रहे हैं। इसके अलावा, कुछ पेशेवर प्रतिजन पेश पारंपरिक वृक्ष के समान कोशिकाओं (CDCs) के रूप में जाना कोशिकाओं एक अपेक्षाकृत जटिल प्रवास पैटर्न 1, 2 गुज़रना पड़ता है। CDCs सतह मार्कर के अपने प्रदर्शन, CD11c पर, प्रवाह cytometry का उपयोग पहचाना जा सकता है भाग में स्थित है। डीसी के विशिष्ट सबसेट CD103 और CD11b 3 के अंतर सतह अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता। साँस प्रतिजन प्राप्त करने पर, कुछ CDCs फेफड़ों से बाहर निकलें और फेफड़ों-खाली करने लिम्फ नोड्स (LNS) जहाँ वे पेप्टाइड्स पेश विशिष्ट प्रतिजन के लिए टी कोशिकाओं से 4 लसीका वाहिकाओं के माध्यम से विस्थापित। इस अनुकूली प्रतिरक्षा r की दीक्षा में एक महत्वपूर्ण घटना है जल्दीesponses। अज्ञात कारणों के लिए, तथापि, नहीं सभी CDCs कि साँस एंटीजन प्राप्त फेफड़ों छोड़ देते हैं, और इन कोशिकाओं के कई कई महीनों 5 के लिए उस अंग में रहते हैं 6। इस अवलोकन आंशिक रूप से इन कोशिकाओं के विकास वंश से समझाया जा सकता है क्योंकि monocyte व्युत्पन्न CD11c + केमोकाइन रिसेप्टर, CCR7 कमी कोशिकाओं, क्षेत्रीय LNS 7, 8 में माइग्रेट करने में असमर्थ हैं। यह संभावना है कि CDCs के प्रवास संभावित भी निर्धारित किया जाता है कम से कम हिस्से में, फेफड़ों के भीतर अपनी शारीरिक स्थिति के द्वारा। हालांकि, फेफड़ों में CDCs के इन अलग अलग आबादी के सटीक स्थानीयकरण विशेषता पूरी तरह से नहीं है। प्रतिरक्षा सेल स्थानीयकरण फेफड़ों के भीतर, और अणुओं है कि यह प्रत्यक्ष की के एक उन्नत ज्ञान, कैसे फेफड़ों की प्रतिरक्षा प्रणाली सक्रिय हो जाता है की एक बेहतर समझ के लिए आवश्यक है।

PCLS जा रहा है बढ़ रही हैंजबकि फेफड़ों वास्तुकला 9, 10 के संरचनात्मक अखंडता बनाए रखने ly, एक पूर्व vivo दृष्टिकोण सेलुलर स्थिति और सेल सेल बातचीत कल्पना करने के लिए के रूप में इस्तेमाल किया। PCLS चूहों, पशु, बंदरों, भेड़, घोड़े, और मनुष्यों 11 सहित कई प्रजातियों, के फेफड़ों अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ यह है कि लगभग 20 स्लाइस एक माउस फेफड़ों की एक एकल पालि से तैयार किया जा सकता है, जिससे अलग-अलग प्रयोगों के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या कम है। लगभग सभी प्रतिरक्षा डीसी, मैक्रोफेज, neutrophils, और टी कोशिकाओं सहित प्रकार की कोशिकाओं,, PCLS में मौजूद हैं और अपने सामान्य संरचनाओं बनाए रखें।

PCLS भी acetylcholine 12 या methacholine 13 से इलाज के बाद कैल्शियम संकेतन और वायु-मार्ग और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की सिकुड़ना अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इस दृष्टिकोण में, केवल फेफड़ों के एक छोटे से हिस्से एक हैमाइक्रोस्कोप alyzed, लेकिन एक शोध बताता है कि PCLS में वायु-मार्ग संकुचन की माप काट करने के लिए टुकड़ा से केवल 10% भिन्नता है, और इस विचरण बरकरार जानवरों 14 में फेफड़े की कार्यक्षमता परीक्षण का उपयोग कर देखा कि के बराबर है। अन्य जांचकर्ताओं एक पूर्व vivo दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया है PCLS LPS 15 के साथ ऊष्मायन के बाद साइटोकाइन अभिव्यक्ति और कोशिका की सतह मार्करों में परिवर्तन का अध्ययन करने के। PCLS भी छोटे इंट्रा-कोष्ठकी धमनियों में कमी वाली फेफड़े वाहिकासंकीर्णन के एक पूर्व vivo मॉडल में इस्तेमाल किया गया है। ये पोत फेफड़ों कि विच्छेदित धमनी क्षेत्रों या subpleural वाहिकाओं 16 के विश्लेषण से रिकॉर्डिंग सहित अन्य प्रक्रियाओं का उपयोग करते हुए नहीं पहुँचा जा सकता के हिस्से में स्थित हैं। हमारी प्रयोगशाला में मुख्य रूप से इस्तेमाल किया गया है PCLS स्थिर अवस्था में रहते हैं फेफड़े के ऊतकों में प्रतिरक्षा सेल स्थानीयकरण और एक इन विवो भड़काऊ प्रोत्साहन निम्नलिखित कल्पना करने के लिए। प्रक्रियाओं हम इस बात के लिए विकसित किया है इस प्रकार हैं।

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Protocol

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पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं इस पत्र में वर्णित NIEHS पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. फेफड़े तैयारी

  1. संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा प्रदान की दिशा निर्देशों के अनुसार विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में उम्र के 6 और 12 सप्ताह के बीच हाउस चूहों।
    नोट: Imaged चूहों, या तो भोली, या इलाज किया जा सकता है प्रत्येक शोधकर्ता विशिष्ट रुचियों के आधार पर। यहाँ, हम भोली चूहों में और 100 माइक्रोग्राम ovalbumin (ओवीए) और 0.1 माइक्रोग्राम lipopolysaccharide (LPS) के साथ इलाज चूहों में प्रतिरक्षा सेल स्थानीयकरण का वर्णन है, 50 μL की कुल मात्रा में एक वाहन के रूप फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) का उपयोग कर। oropharyngeally वायुमार्ग में ओवीए / LPS टपकाना करने के लिए, जानवरों isoflurane साँस लेना के साथ संज्ञाहरण कर रहे थे और खड़ी एक रबर बैंड के साथ उनके दांत से निलंबित कर दिया। जीभ धीरे संदंश के साथ समझा और निगलने को रोकने के लिए एक तरफ का आयोजन किया गया, और 50 & #181; ओवीए / LPS समाधान मौखिक गुहा के पीछे जमा की एल के रूप में पहले से 17 का वर्णन किया।
  2. सोडियम pentobarbital (100 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ माउस euthanize, और एक polystyrene आधार के लिए पशु पिन करें।
  3. जबड़े के पेट के ऊपर के मध्य से त्वचा और पेरिटोनियम कटौती करके कैंची के साथ उदर गुहा खोलें। संदंश या कैंची की सुस्त बढ़त के साथ एक तरफ आंतों खींचो, और रक्त फेफड़ों से दूर निकास के लिए निम्न वेना कावा धज्जी। कैंची की तेज टिप के साथ डायाफ्राम पंचर रिब पिंजरे के विस्तार की अनुमति, फेफड़ों में कटौती नहीं सावधान किया जा रहा है।
  4. साफ लार ग्रंथियों और ऊतक हथियाने और मैन्युअल रूप से संदंश के साथ अंतर्निहित श्वासनली से दूर यह खींच कर श्वासनली से दूर अन्य ऊतकों। ठीक संदंश या कैंची का उपयोग कर उपास्थि की सबसे मोटी बैंड के पूर्वकाल पक्ष पर श्वासनली में एक छोटा सा चीरा बनाने, सावधान किया जा रहा है, हालांकि tra सभी तरह काटने के लिए नहींchea। चीरा सिर्फ इतना बड़ा एक 20 जी सुई के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देने के लिए किया जाएगा।
  5. polyethylene टयूबिंग के एक हिस्से पर एक 1.5 इंच, 20 जी सुई स्लाइड, सुई की समाप्ति के बाद टयूबिंग के लगभग 1 सेमी हो जाता है। लगभग 45 डिग्री के कोण पर टयूबिंग कट गर्म का 0.8 एमएल (40 डिग्री सेल्सियस) 2% कम पिघलने बिंदु ड्राइंग agarose सुई के माध्यम से ऊपर से अंत बेवल करने के लिए, एक 1 एमएल सिरिंज के लिए सुई देते हैं, और लोड सिरिंज।
  6. श्वासनली के चीरा में ट्यूबिंग के अंत रखें और धीरे से फेफड़ों में agarose इंजेक्षन। सुई या सिरिंज ले जाए बिना, polystyrene आधार के लिए सिरिंज टेप सुनिश्चित करने के लिए सुई श्वासनली में रहता है।
    नोट: इंजेक्शन के बाद, फेफड़े बड़ा और फुलाया सीने के भीतर हो जाएगा। सही पालियों पहले विस्तार, फिर बाएं पालि। केवल एक ही पालि फैलता है, तो सुई भी गहरा डाला गया है (श्वसनी अतीत), और यह आगे बढ़ने से पहले थोड़ा इसे बाहर खींच करने के लिए आवश्यक हो जाएगा। के इस भाग कोप्रक्रिया अपेक्षाकृत जल्दी किया जाना है, इससे पहले कि Agarose जमना शुरू होता है की जरूरत है।
  7. माउस रखें, आधार और सिरिंज अभी भी श्वासनली में डाला, एक ठंडा कमरे में या कम से कम 10 मिनट के लिए फ्रिज के साथ। यदि आवश्यक हो, पशु में कई घंटे तक, यहां तक ​​कि वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि कोशिका प्रवास के लिए आगे बढ़ने के लिए वहाँ अगर रखा जा सकता है।
  8. एक बार जब माउस ठंडा है, ध्यान से agarose-फुलाया फेफड़ों कैंची का उपयोग कर आबकारी, और उन्हें बर्फ जैसी ठंडी पीबीएस के साथ एक 3 सेमी डिश में रखें। बर्फ पर रखें।
  9. ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया के लिए वांछित पालि (जैसे, सही बेहतर पालि) चुनें। यकीन है कि फेफड़ों (जहां यह श्वासनली को जोड़ता है) के इंटीरियर हिस्सा पकवान के अंदर चेहरे की हुई है।
    नोट: पालि का इस्तेमाल किया और सवार पर अपने उन्मुखीकरण वाहिकाओं और वायुमार्ग कि दिखाई जाएगी के आकार का निर्धारण करेगा। उन्मुखीकरण यहाँ वर्णित बड़े वायुमार्ग के दृश्य, और पैरेन्काइमा लिए आदर्श है। चूहे एक बड़ी बाईं पालि और दाईं तरफ चार छोटे खण्डों की है। के लियेPCLS इमेजिंग oropharyngeal या intranasal आकांक्षा के माध्यम से फेफड़ों में एलर्जी की शुरूआत के बाद, सही बेहतर पालि आम तौर पर भाग में, sectioned क्योंकि यह एक सुविधाजनक आकार है, बल्कि इसलिए भी कि साँस एजेंटों के भीतर समान रूप से फैलाने है। हालांकि, अन्य पालियों, विशेष रूप से बाईं पालि, का भी अध्ययन किया जा सकता है। जब माउस उपभेदों या उपचार की तुलना करें, यह एक ही पालि तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण है।

2. फेफड़े स्लाइसिंग

नोट: एक स्वचालित स्लाइसर का उपयोग कर, धातु ठंडा ब्लॉक, सवार और धातु सिरिंज स्लाइस बनाने निर्माता के निर्देशों के अनुसार।

  1. सवार पर सभी उद्देश्य के एक छोटे से ड्रॉप, कोई रन जेल superglue रखो और एक परिपत्र गति में गोंद का प्रसार, देखभाल करने के गोंद धातु सिरिंज के पक्षों को छूने मत करने के लिए। गोंद सिरिंज के पक्षों को छू लेती है, तो यह सिरिंज गोंद और एक साथ सवार होगा।
  2. इसके तत्काल बाद गोंद के साथ सवार तय करने के बाद, धीरे समझनीचे श्वासनली पक्ष के साथ संदंश के साथ excised पालि, एक ऊतक पर चोंच मारना अतिरिक्त तरल निकालने के लिए, और ध्यान से सवार के शीर्ष पर रखने का। किसी भी अतिरिक्त ऊतक सवार के किनारे से परे का विस्तार बंद ट्रिम।
  3. सवार नीचे इतना है कि धातु सिरिंज की तरफ ऊपर ले जाएँ और ऊतक पर, बनाने हटो एक अच्छी तरह से फेफड़ों गहरी कई सेंटीमीटर से तल पर चिपके, कोई और अधिक। धातु सिरिंज के नीचे चारों ओर टेप स्थान पर इस पद सँभालने।
  4. ध्यान से अच्छी तरह से में 40 डिग्री सेल्सियस पर 2% कम पिघल agarose डालना तो यह सिर्फ पालि के शीर्ष को शामिल किया गया।
  5. बहुत ठंडा द्रुतशीतन ब्लॉक के साथ धातु सिरिंज के चारों ओर और 1 के लिए पालि और agarose शांत - 2 मिनट।
    नोट: ऊतक आसपास agarose के एक छोटे समय ठंडा करने की क्रिया, एक असमान कटौती PCLS में परिणाम हो सकता है के दौरान agarose के विघटन का कारण बन सकता।
  6. स्वचालित स्लाइसर में नमूना सिरिंज लोड और बर्फ ठंड पीबीएस के साथ बफर टैंक भरें। संरेखित नमूना सिरिंज के साथ मोटर ड्राइव कदम और नीचे से टेप का टुकड़ा हटा दें। तेजी से आगे (एफएफ) की स्थिति स्विच को बंद करें जब तक कदम मोटर ड्राइव बस सवार की पीठ को छू लेती है।
  7. नमूना सिरिंज के साथ नए सिरे ब्लेड संरेखित करें। सेट ऊतक मोटाई, सतत / एकल टुकड़ा, दोलन और गति स्लाइसर में। उदाहरण के लिए, ऊतक मोटाई: 150 सुक्ष्ममापी, निरंतर काटने (शेष भाग।), दोलन: 9, और गति: 3 - 4. प्रेस शुरू। ऊपर दी गई सेटिंग विशिष्ट स्वचालित स्लाइसर विनिर्देशों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता।
  8. एक पतली लेपनी या तूलिका का उपयोग करना, के रूप में वे बफर टैंक में गिर जाते हैं और उन्हें एक 24 अच्छी तरह से थाली बर्फ जैसी ठंडी पीबीएस युक्त जगह एक समय में PCLS एक एकत्रित करते हैं।
    ध्यान दें: यह आदेश प्रयोगों के बीच सामंजस्य बनाए रखने में स्लाइस रखने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि हर फेफड़ों अलग उम्र, लिंग और वजन के आधार पर है, 10 वीं टुकड़ा, उदाहरण के लिए, आम तौर पर इसी तरह वायुमार्ग आकार अर्जित करता है।
ove_title "> 3। एंटीबॉडी धुंधला

  1. fluorescently टैग ब्याज की सेल प्रकार के आधार पर एंटीबॉडी के एक पैनल डिजाइन, खाते में संभावित फ्लोरोसेंट वर्णक्रमीय ओवरलैप और माइक्रोस्कोप के पहचान क्षमता लेने।
    नोट: उदाहरण के लिए, डीसी सबसेट पता लगाने के लिए एक पैनल इस प्रकार है: CD11c / अल्फा एक्स इंटीग्रिन - BrilliantViolet (BV) 605 (उत्तेजना: 405 एनएम, पीक उत्सर्जन: 605 एनएम), CD324 / ई cadherin - एलेक्सा 488 (AF488 ) (उत्तेजना: 488 एनएम, पीक उत्सर्जन: 519 एनएम), CD88 / C5Ra1 - phycoerythrin (पीई) (उत्तेजना: 561 एनएम, पीक उत्सर्जन: 578 एनएम), CD103 / अल्फा ई इंटीग्रिन - Allophycocyanin (APC) (उत्तेजना: 633 एनएम , पीक उत्सर्जन: 660 एनएम)। प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय दर्शक उपकरण (देखें सामग्री सूची) पैनल डिजाइन करने के लिए उपयोगी होते हैं।
  2. एंटीबॉडी वांछित एंटीबॉडी युक्त कॉकटेल बनाओ।
    1. स्थिर PCLS इमेजिंग के लिए, एक 1.5 एमएल microcentrifu 800 μL धुंधला बफर, 100 μL फ्की ब्लॉकर, 50 μL सामान्य माउस सीरम, और 50 μL सामान्य चूहे सीरम जोड़ने1 एमएल की कुल मात्रा के लिए gation ट्यूब। लाइव सेल इमेजिंग के लिए, 800 μL लेबोविट्ज़ के मध्यम (1x) धुंधला बफर के बजाय युक्त 10% एफबीएस (लेबोविट्ज़ -10) का उपयोग करें।
    2. एंटीबॉडी प्रत्येक एंटीबॉडी के एक वांछित अंतिम एकाग्रता समायोजित करने के लिए जोड़ें। एक 3 सेमी पकवान के लिए एंटीबॉडी समाधान स्थानांतरण, और उपयोग के लिए तैयार है जब तक अंधेरे में रहते हैं।
      नोट: (- 5 माइक्रोग्राम / एमएल आम तौर पर 1) अंतिम सांद्रता की जरूरत है प्रत्येक व्यक्ति के एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जाना है।
  3. इतनी बड़ी वायुमार्ग या फेफड़ों की परिधि के रूप में ब्याज की संरचनात्मक क्षेत्र के साथ एक PCLS चुनें, और 1 एमएल एंटीबॉडी समाधान युक्त 3-सेमी डिश में रखें।
  4. अंधेरे में दाग PCLS, बर्फ पर, 30 या 60 मिनट के लिए धीरे-धीरे कमाल।
  5. स्थिर PCLS इमेजिंग के लिए, अनुभाग 4. लाइव सेल इमेजिंग के लिए के लिए आगे बढ़ना खंड 5 के लिए आगे बढ़ें।

4. PCLS की स्टेटिक इमेजिंग

  1. एंटीबॉडी के साथ PCLS के 60 मिनट ऊष्मायन के बाद, पकवान से एंटीबॉडी समाधान निकालें और कुल्ला टीवह 1 एमएल बर्फ ठंड पीबीएस के साथ दो बार स्लाइस।
  2. एक 3 सेमी दौर गिलास नीचे पकवान पर पिपेट 50 μL पीबीएस। एक लेपनी या तूलिका का उपयोग करना,, ड्रॉप करने के लिए दाग PCLS हस्तांतरण धीरे टुकड़ा जोड़ तोड़ जब तक यह सपाट है और बाहर फैल गया। एक विंदुक के साथ पीबीएस निकालें। टुकड़ा संभव के रूप में फ्लैट होना चाहिए। उपरोक्त प्रक्रिया जल्दी से प्रदर्शन किया जा करने के लिए photobleaching से बचने की जरूरत है।
  3. कमरे के तापमान बढ़ते मध्यम की 1 बूंद टुकड़ा पर रखें और धीरे थाली के कुएं में एक गिलास coverslip छोड़ देते हैं। इमेजिंग से पहले एक घंटे तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में PCLS रखें।
  4. जब एक कोंफोकल खुर्दबीन के नीचे देखने, एक 20X उद्देश्य (देखें सामग्री सूची) का उपयोग करें। "उत्तल पतवार" सेटिंग में पता लगाने और ऊतक के किनारों को चिह्नित करने के "टाइल" उपकरण का उपयोग करें। यह टाइल स्कैन के समय को कम करने में मदद करेगा।
  5. z के ढेर सीमा निर्धारित करते हैं,,, टुकड़ा के कई क्षेत्रों पर सत्यापित विशेष रूप से किनारों के साथ कि सेट सीमाओंउपयुक्त हैं।
    ध्यान दें: z दूरी ऊतक खुद की मोटाई से अधिक होना है क्योंकि यह बहुत मुश्किल है ऊतक पूरी तरह से फ्लैट बिछाने के लिए प्राप्त करने की आवश्यकता होने की संभावना होगी। टुकड़ा में धक्कों और घटता समायोजित करने के लिए 250 सुक्ष्ममापी - उदाहरण के लिए, एक 150 सुक्ष्ममापी मोटी PCLS के साथ, z के ढेर रेंज की संभावना 200 करने के लिए सेट करने की आवश्यकता होगी। एक 20X उद्देश्य के साथ 12 घंटे - z के ढेर रेंज और ऊतक के आकार पर निर्भर करता है, प्रत्येक पूर्ण फेफड़ों स्कैन 7 के बीच ले जाएगा। प्रत्येक फेफड़ों अद्वितीय है और सेटिंग्स हर प्रयोग के लिए समायोजित किया जाना चाहिए।

5. PCLS की लाइव सेल इमेजिंग

  1. बाद एंटीबॉडी के साथ PCLS के 30 मिनट ऊष्मायन, पकवान से एंटीबॉडी समाधान निकालें और स्लाइस 1 एमएल ठंड लेबोविट्ज़-10 के साथ दो बार कुल्ला।
  2. पिपेट ताजा 50 μL लेबोविट्ज़ -10 एक एक संभाग coverglass (8 स्लॉट्स) की स्लॉट में। मध्यम करने के लिए PCLS हस्तांतरण करने के लिए एक लेपनी का प्रयोग करें, धीरे इसे जोड़ तोड़ जब तक टुकड़ा सपाट है और बाहर फैल गया। उपरोक्त प्रक्रियाphotobleaching से बचने के लिए जल्दी से प्रदर्शन किया जा करने की जरूरत है।
  3. एक विंदुक का उपयोग 50 μL मध्यम निकालें। टुकड़ा संभव के रूप में फ्लैट झूठ बोल रही किया जाना है।
    नोट: यह स्वीकार्य है अगर टुकड़ा के किनारों कक्ष की दीवार के खिलाफ खड़ी ऊपर फ़्लिप कर रहे हैं। इसके अलावा, यदि उपलब्ध हो, एक धातु प्लैटिनम वजन अगले चरण पर जाने से पहले टुकड़ा लंगर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्लैटिनम तार का एक उदाहरण है कि कटौती और छोटे वजन में तुला किया जा सकता है के लिए संलग्न सामग्री सूची देखें।
  4. एक 4 डिग्री सेल्सियस ठंड कमरे में, वृद्धि कारक कम, 100 μL लेबोविट्ज़-10 के साथ फिनोल लाल मुक्त बाह्य मैट्रिक्स के 100 μL मिश्रण। इस के लिए precooled पिपेट युक्तियों का उपयोग करें, या बाह्य मैट्रिक्स टिप में जमना होगा।
    नोट: मैट्रिक्स और मध्यम के इस अनुपात (1: 1) एक जेल पर्याप्त घने ऊतक संस्कृति की स्थिति में PCLS नीचे पकड़ बनाता है।
  5. धीरे मैट्रिक्स मिश्रण पिपेट, और ध्यान से PCLS के शीर्ष पर पिपेट, यह सुनिश्चित करें कि जेल लू के शीर्ष पर चला जाता है बना रही हैएनजी टुकड़ा है, और उस टुकड़ा जेल के शीर्ष पर बदलाव नहीं होता। जेल एक वजन के रूप में काम करना चाहिए, PCLS प्लेट के नीचे पर नीचे प्रस्तोता।
  6. ध्यान से एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर करने के लिए संभाग coverglass हस्तांतरण और मैट्रिक्स ~ 5 मिनट के लिए जमना करते हैं।
  7. एक कोंफोकल माइक्रोस्कोप के पूर्व गर्म मंच पर पूरे संभाग coverglass स्थानांतरित करें। इमेजिंग के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर चैम्बर बनाए रखें। जब लेबोविट्ज़ के माध्यम का उपयोग सीओ 2 की आपूर्ति सेल गर्मी के दौरान की आवश्यकता नहीं है।
  8. फ्रेम के बीच इच्छित अंतराल के आधार पर z के ढेर रेंज और टाइल सीमा निर्धारित करें। जब एक कोंफोकल खुर्दबीन के नीचे देखने, एक 20X उद्देश्य (देखें सामग्री सूची) का उपयोग करें। ऊतक में रुचि के क्षेत्र को निरूपित करने के "टाइल" उपकरण का उपयोग करें, "केंद्रित ग्रिड" सेटिंग (जैसे, एक 2x2 केंद्रित ग्रिड) का उपयोग कर।
  9. z के ढेर सीमा निर्धारित करते हैं, टुकड़ा है कि सेट सीमाओं उपयुक्त हैं के कई क्षेत्रों में सत्यापित करें।
    नोट: zrAnge ऊतक की मोटाई के बराबर होने की संभावना होगी। प्रत्येक फेफड़ों अद्वितीय है और सेटिंग्स हर प्रयोग के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। 2x2 टाइल्स और 10 z के ढेर आम तौर पर ~ 1 फ्रेम / 2 मिनट का परिणाम देगा। सुनिश्चित करें ऑटो फोकस समारोह इमेजिंग अवधि के दौरान xy और z-बहाव कम करने के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले सक्रिय है।

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Representative Results

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C57BL / 6 चूहों से दो डीसी सबसेट के स्थान, CD11b हाय CDCs और CD103 + CDCs, PCLS पहचान करने के लिए कट और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (MABS) CD11c के लिए विशिष्ट साथ दाग रहे थे, CD88, CD103, और CD324 (ई cadherin)। CD324 दाग एयरवे उपकला कोशिकाओं के लिए एंटीबॉडी, और CD88 मैक्रोफेज और neutrophils, लेकिन CDCs नहीं 8 पर प्रदर्शित होता है। यह हमें CD11c + मैक्रोफेज से CDCs भेद करने के लिए, और वायुमार्ग (चित्रा 1) के लिए प्रत्येक कोशिका प्रकार के स्थानिक संबंध निरीक्षण करने के लिए अनुमति दी। हमने पाया है कि CD11b हाय CDCs, पैरेन्काइमा में स्थानीयकरण जबकि CD103 + CDCs मुख्य रूप से वायुमार्ग और subpleural क्षेत्र के आसपास रहते हैं। CD103 + CDCs आसानी से इस प्रयोग में कोशिका की सतह CD103 के प्रत्यक्ष धुंधला द्वारा पता लगाए गए हैं, CD11b का पता लगाने हाय CDCs CD88 और CD103 धुंधला के अभाव पर भरोसा किया। सीधे CD11b पहचान करने के लिएहाय CDCs, हम पहले दाग PCLS के लिए एक विरोधी CD11b mAb (क्लोन एम 1/70) है, जो व्यापक रूप से इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री में इस्तेमाल किया और प्रवाह cytometry का उपयोग का प्रयास किया। हालांकि, इस mAb एक उच्च पृष्ठभूमि और इस आवेदन में कम विशिष्टता था, जो की परवाह किए बिना fluorochromes mAb को संयुग्मित गया (चित्रा 2A, और नहीं दिखाया डेटा)। इसके विपरीत, CD172a (SIRP1α) के लिए एंटीबॉडी CD11b हाय CDCs 18 सना हुआ, लेकिन संरचनात्मक नहीं कोशिकाओं या CD103 + CDCs (चित्रा 2 बी, और डेटा नहीं दिखाया गया है)। अपने दम पर, CD172a एंटीबॉडी CDCs और monocytes या मैक्रोफेज के बीच भेद नहीं कर सका। बीचवाला मैक्रोफेज से (CD172a + CD88 +), और CD11b हाय CDCs (CD172a + CD88 -) - हालांकि, CD88 और CD172a के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ सह-धुंधला द्वारा, हम वायुकोशीय मैक्रोफेज (CD88 + CD172a) भेद करने में सक्षम थे, और बताते हैं कि बाद कोशिकाओं को प्राथमिकता में स्थानीय बनानापैरेन्काइमा, नहीं उप उपकला क्षेत्र (चित्रा 2C - एफ) समझौते में, हमारे परिणाम इन कोशिकाओं के अप्रत्यक्ष धुंधला द्वारा प्राप्त के साथ।

ल्यूकोसाइट्स का इंट्रा-ऊतक प्रवास के अध्ययन जो परिधीय ऊतकों से डीसी यातायात के माध्यम से क्षेत्रीय LNS को lymphatics के उन लोगों, सहित संरचनात्मक कोशिकाओं, के दृश्य की आवश्यकता है। त्वचा और LNS में, लसीका वाहिकाओं अक्सर LYVE -1 या Podoplanin को Mabs का उपयोग कर पहचाने जाते हैं। हालांकि, हमने पाया कि PCLS में, MABS LYVE -1 और Podoplanin संवहनी अन्तःचूचुक और वायुकोशीय उपकला (डेटा नहीं दिखाया गया है) सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं, की एक किस्म के दाग। ये MABS सीमित व्यावहारिक उपयोग की इसलिए विशेष रूप से PCLS में लसीका वाहिकाओं की पहचान करने के लिए कर रहे हैं। हालांकि, CD90.2 (Thy1.2), एक प्रसिद्ध टी सेल मार्कर, लेबल लसीका संरचनाओं, के लिए MABS अन्य ऊतकों 19, 20 (आंकड़े 3 ए, बी में पहले से दिखाया गया है Prox1 प्रमोटर 21 (चित्रा 3 ए, सी) के ट्रांस्क्रिप्शनल नियंत्रण में एक ट्रांस्जीन द्वारा कूटबद्ध किया था। PROX1 एक मास्टर प्रतिलेखन कारक lymphangiogenesis 22 के लिए आवश्यक है कि है। Prox1 tdTomato ट्रांसजेनिक चूहों फेफड़ों और इस तरह के अधिवृक्क मज्जा 21 के जिगर, लेंस, देंताते जाइरस और neuroendocrine कोशिकाओं के रूप में अन्य ऊतकों में चमकीले फ्लोरोसेंट लसीका वाहिकाओं दिखा रहे हैं। दरअसल, इन दोनों लेबलिंग तरीकों अतिव्यापी धुंधला पैटर्न (चित्रा 3 डी) दे दी है। इन लेबलिंग दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम यह निर्धारित करने कि CD103 + CDCs CD324-व्यक्त एयरवे उपकला, lymphatics, और subpleural क्षेत्र (चित्रा 3 ए, ई) सहित कई संरचनात्मक क्षेत्रों, में उपस्थित थे सक्षम थे।

स्थिर इमेजिंग, सेल आंदोलन और सेल के अलावा cel के लिएएल बातचीत PCLS (मूवी 1) का लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग दर्ज किया जा सकता। PCLS हाल में चूहों कि GFP-व्यक्त OT-दो टी कोशिकाओं और ओवीए और LPS के टपकाना के इंजेक्शन प्राप्त किया था से तैयार किए गए, CD103 (लाल) और वायु-मार्ग उपकला (CD324, नीला) के खिलाफ Mabs के साथ दाग, और ट्रैक करने के लिए imaged थे CD103 + CDCs और टी कोशिकाओं के आंदोलन को 16 घंटे ओवीए / LPS टपकाना के बाद। वीडियो (4 ज) के दौरान, CD103 + डीसी (लाल) और adoptively हस्तांतरित ओवीए विशेष टी कोशिकाओं (हरा) और उनकी बातचीत के गतिशील आंदोलन स्पष्ट रूप से दिखाई (मूवी 1) कर रहे हैं।

आकृति 1
चित्र सीडीसी सबसेट की 1. विशिष्ट शारीरिक स्थान के रूप में PCLS धुंधला और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा खुलासा। ए) एक अनुपचारित C57BL 6 / माउस फेफड़ों विभिन्न एंटीबॉडी के साथ दाग से पूरे PCLS। के रंग प्रत्येक अणु (शीर्ष दाएं) अपने फ़ॉन्ट रंग से मिलता है। व्यक्तिगत और मिश्रित धुंधला हित के प्रकार की कोशिकाओं के लिए निम्नलिखित रंग देता है: -;, CD11b हाय CDCs (CD11c + CD103 - CD88 -; लाल) (सफेद CD103 + CD11c + CD88) CD103 + CDCs, मैक्रोफेज (CD11c + CD88 +; पीले ), न्यूट्रोफिल (CD11c - CD88 +; हरा) और वायु-मार्ग उपकला कोशिकाओं (CD324 +; नीला)। बी - डी) में सन्निवेश के उच्च आवर्धन। बी) CD11b हाय CDCs पैरेन्काइमा में स्थानीय बनाना। सी) CD103 + वायुमार्ग के आसपास CDCs। डी) CD103 + आंत का फुस्फुस का आवरण के नीचे CDCs। व्हाइट सलाखों 50 सुक्ष्ममापी को दर्शाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तम्बू "के लिए: रखने together.within-पन्ने की =" 1 "> चित्र 2
चित्रा 2. डीसी और मैक्रोफेज का धुंधला। ए) CD11b (नीला) के लिए एंटीबॉडी के साथ PCLS का धुंधला PCLS में एक उच्च पृष्ठभूमि देता है। बी) CD172a (हरा करने के लिए एंटीबॉडी) PCLS में एक अपेक्षाकृत कम पृष्ठभूमि और CD11b + कोशिकाओं के लिए अधिक विशिष्टता है। सी) / 6 C57BL MABS जिसका रंग फ़ॉन्ट रंग (शीर्ष दाएं) से निर्देशित होता है के साथ दाग चूहों के पूरे PCLS। CD11c (लाल), CD88 (सियान), CD172a (हरा) और CD324 (नीला)। CD11b हाय CDCs (CD11c + CD88 - CD172a +; पीला), वायुकोशीय मैक्रोफेज (CD11c + CD88 + CD172a -; गुलाबी), मध्यवर्ती मैक्रोफेज (CD11c + CD88 + CD172a +; सफेद), न्यूट्रोफिल (CD11c - CD88 +; सियान) और वायुमार्ग (CD324 +; नीला)। डी - एफ) सन्निवेश के उच्च आवर्धनसी में दिखाया गया। डी) उप-फुफ्फुस क्षेत्र। ई) उप-उपकला क्षेत्र। एफ) interstitium। बीच में आने वाले मैक्रोफेज पैरेन्काइमा में स्थानीय बनाना, और वायुकोशीय मैक्रोफेज एल्वियोली में हैं। लेबल नहीं किया गया सफेद सलाखों 50 सुक्ष्ममापी को दर्शाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. PCLS में स्ट्रक्चरल कोशिकाओं की लेबलिंग। ए) पूरे PCLS Prox1 tdTomato माउस से तैयार किया है, और CD90.2 (हरा) के लिए Mabs के साथ दाग, CD103 (सफेद) और CD324 (नीला)। Prox1-व्यक्त कोशिकाओं (लाल) आनुवंशिक रूप से Prox1 प्रमोटर (Prox1-tdTomato) के विनियमन के तहत tdTomato दिया जाता है। बी - ई) में इनसेट के उच्च आवर्धन बी) CD90.2 (हरा), सी) Prox1-tdTomato (लाल), और डी) CD90.2 और Prox1-tdTomato का संयोजन। ई) CD90.2 (हरी का संयोजन), CD103 (लाल) और CD324 (नीला)। लेबल नहीं किया गया सफेद सलाखों 50 सुक्ष्ममापी को दर्शाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 1
मूवी 1. टी कोशिकाओं फेफड़े में CD103 + CDCs साथ सहभागिता करें। CD103 + CDCs (लाल) की लाइव सेल इमेजिंग टी कोशिकाओं (हरा) के साथ बातचीत। ओवीए विशिष्ट OT-II Nur77 GFP चूहों से अलग सीडी 4+ टी कोशिकाओं प्लीहा डीसी और इन विट्रो में ओवीए साथ प्रेरित कर रहे थे, और adoptively राग में स्थानांतरित - / - माउस। 2 घंटे बाद, प्राप्तकर्ता माउस इलाज किया गया था बुद्धिज ओवीए / LPS एयरवे को टपकाना। 16 ज ओवीए / LPS उपचार के बाद, PCLS, बना दाग और 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए imaged किया गया। समय रिकॉर्डिंग छवि (न्यूनतम) दिखाया गया है। यह वीडियो देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

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Discussion

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प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित मूल रूप से फेफड़ों के भीतर CDCs के दो उप-समूहों के स्थानों को कल्पना करने के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, इस प्रोटोकॉल आसानी से कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं का अध्ययन करने, जबकि सेल व्यवहार्यता और फेफड़ों के तीन आयामी वास्तुकला को बनाए रखने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध सुविधा सेल संस्कृति प्रणाली पर एक महत्वपूर्ण लाभ यह है और दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं की पहचान की सुविधा। विधि फेफड़ों से PCLS की पीढ़ी पर निर्भर करता है, और एंटीबॉडी के लिए एक उपयुक्त संयोजन विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं की पहचान करने के समय पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने। एक बड़ी हद तक, यह एक अनुभवजन्य व्यायाम क्योंकि एंटीबॉडी कि प्रवाह cytometry सहित अन्य अनुप्रयोगों में अच्छी तरह से काम करते हैं, जरूरी PCLS धुंधला के लिए अच्छी तरह से काम नहीं करते है। हम पहले से ही इस संबंध में काफी प्रगति की है, लेकिन जांचकर्ताओं ने उस का उत्तर नहीं दिया प्रकार की कोशिकाओं का अध्ययन करना चाहते हैं अलग एंटीबॉडी का परीक्षण करने और fluorochromes और सांद्रता का अनुकूलन करने के लिए हो सकता है। प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि CD103 + CDCs और CD11b हाय CDCs फेफड़ों में अलग स्थानीयकरणों पर रहते हैं। स्थिर अवस्था में CD103 + CDCs, वायुमार्ग के आसपास है और subpleural क्षेत्र में पता लगाया जबकि CD11b हाय CDCs मुख्य रूप से पैरेन्काइमा में पाए गए थे। हालांकि प्रोटोकॉल हम यहाँ का वर्णन intracellular अणुओं धुंधला के लिए उपयुक्त नहीं है, यह इमेजिंग कोशिका की सतह मार्करों, साथ ही स्रावी अणुओं के लिए उपयोगी है। इस प्रकार, हम, chemokines, CCL21 और CCL19 पता लगाने के लिए PCLS में सक्षम थे (डेटा नहीं दिखाया गया है)। केवल कमजोर फ्लोरोसेंट संकेतों प्राथमिक प्रतिरक्षी का उपयोग कर देखा जाता है, तो यह उन संकेतों बढ़ाना माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करना संभव है।

एक बड़ी चुनौती है जब PCLS की लाइव सेल वीडियो इमेजिंग के संचालन के लिए पर्याप्त रूप संस्कृति माध्यम में ऊतक लंगर डालना 4-ज माइक्रोस्कोपी अवधि के दौरान महत्वपूर्ण xy- और z-बहाव को रोकने के लिए किया गया था। इसका पता लगाने के लिए, हम प्रयोगबाह्य मैट्रिक्स के लिए लेबोविट्ज़ के माध्यम है, जो कमरे के तापमान पर ठोस है के विभिन्न अनुपात, और निर्धारित के साथ एक 1: 1 अनुपात सेल व्यवहार्यता के साथ एक स्थिर, 3 डी संरचना को बनाए रखा। बाद इमेज प्रोसेसिंग के दौरान, हम भी ImageJ प्लग-इन की एक श्रृंखला, TurboReg और StackReg कहा जाता है कि किसी भी अतिरिक्त आकस्मिक xy या z-शिफ्ट (http://www.einstein.yu.edu/segallLab/page.aspx को खत्म करने के लिए उपयोग किया? id = 18226)। कोंफोकल माइक्रोस्कोप के ऑटो फोकस उपकरण का उपयोग करना, ब्याज की क्षेत्र को ध्यान में रखा गया था, विशेष रूप से z-सीमा में पूरे स्कैनिंग की अवधि के दौरान। PCLS की लाइव सेल इमेजिंग के दौरान एक अन्य चुनौती टाइल स्कैन, z के ढेर, समय श्रृंखला, और ऑटोफोकस कार्यों माइक्रोस्कोप के उपयोग किया गया था। प्रत्येक फ्रेम के बीच के समय को कम करने के लिए, एक संतुलन समय प्रत्येक टाइल स्कैनिंग खर्च के बीच मारा जाना चाहिए। प्रत्येक अनुसंधान परियोजना में समय स्कैन का अनुकूलन करने के लिए, z के ढेर संख्या, टाइल्स, और स्कैनिंग गति समायोजित करने की आवश्यकता।

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Disclosures

जाहिर करने के लिए लेखकों के बीच हितों में कोई टकराव नहीं।

Acknowledgments

हम माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी मदद के लिए जेफ टकर, इरिका स्कैपपिनी, और एग्नेस जानोशाज़ी धन्यवाद, माउस कॉलोनी के उसके प्रबंधन के लिए लिगोन पेरो, और जून चेन और माइकल सैंडरसन ऊतक स्लाइसर साथ मदद के लिए, और माइकल फेससलर और डेरेक कैन के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए पांडुलिपि। इस काम के NIEHS, एनआईएच (जिया ES102025-09), है जो बदले में स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग द्वारा प्रायोजित परिसर में ही कई शाखा द्वारा वित्त पोषित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 000664
Prox1-TdTomato transgenic mice  Jackson Laboratory 018128 B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J
OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice Jackson Laboratory 004194, 016617 B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J 
Rag1 knock-out mice Jackson Laboratory 002216 B6.129S7-Rag1tm1Mom/J
Ovalbumin, Low Endo, Purified Worthington Biochemical Corporation LS003059
Lipopolysaccharides from Escherichia coli Sigma-Aldrich Co. L2630-25MG
Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft BD Diagnostic Systems 427421 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter
GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose BioExpress E-3112-125 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C.
Compresstome VF-300 Precisionary Instruments, Inc. VF-300
Double Edge Stainless Razor Blade Electron Microscopy Sciences 72000 Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung.
Krazy Glue All Purpose Instant Gel VWR 500033-484 Commonly available for $3/tube in local drugstores 
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red ThermoFisher Scientific 21083027
Normal Rat Serum (NRS) Jackson ImmunoResearch Inc. 012-000-120
Normal Mouse Serum (NMS) Jackson ImmunoResearch Inc. 015-000-120
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30071.03HI
Staining Buffer Made in House N/A PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4
Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) Made in House N/A Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2
Anti-mouse CD11b eFluor 450 eBioscience 48-0112-80 Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) 
Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 BioLegend 101237 Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Phycoerythrin eBioscience 12-0114-82 PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418)
Anti-mouse CD11c Allophycocyanin BD Phamingen 550261 APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3)
Anti-mouse CD88 Phycoerythrin BioLegend 135806 PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70)
Anti-mouse CD103 Allophycocyanin eBioscience 17-1031-82 Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7)
Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 eBioscience 48-0902-82 Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1)
Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin eBioscience 17-1721-82 Anti-mouse CD172a APC (clone: P84)
Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 BD Horizon 564188 BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 eBioscience 53-3249-82 Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 eBioscience 51-3249-82 Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1)
Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass MatTek Corperation P35G-1.5-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ThermoFisher Scientific 155411PK  Pack of 16
15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness MatTek Corperation PCS-1.5-15
Bare Platinum Wire World Precision Instruments PTP201 0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36934 Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use.
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free Corning 356231
Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope Carl Zeiss Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss)
Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends Carl Zeiss 420650-9901-000

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References

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प्रेसिजन कटौती माउस फेफड़े स्लाइस लाइव फेफड़े वृक्ष के समान कोशिकाओं कल्पना करने के लिए
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Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (122), e55465, doi:10.3791/55465 (2017).More

Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (122), e55465, doi:10.3791/55465 (2017).

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