Vi beskriver en fremgangsmåte for å generere Precision snitt Lung Skiver (PCLS) og farging dem for å visualisere lokaliseringen av forskjellige immuncelletyper i lungen. Vår Protokollen kan utvides for å visualisere plasseringen og funksjonen av mange forskjellige celletyper under en rekke forskjellige forhold.
Innånding av allergener og patogener fremkaller flere forandringer i en rekke av immuncelletyper i lungen. Strømningscytometri er en kraftfull teknikk for kvantitativ analyse av celleoverflateproteiner på immunceller, men det gir ingen informasjon om lokalisering og vandringsmønstrene av disse celler i lungene. På samme måte kan kjemotaksis analysen utføres for å studere mulighetene for cellene til å svare på kjemotaktiske faktorer in vitro, men disse analysene ikke reprodusere det komplekse miljø av det intakte lunge. I motsetning til disse nevnte metoder, kan plasseringen av de enkelte celletyper i lungene blir lett visualisert ved å generere Precision snitt Lung Skiver (PCLS), farging dem med kommersielt tilgjengelige, fluorescensmerket antistoff, og visualisering av seksjonene ved hjelp av konfokal mikroskopi. PCLS kan brukes for både direkte og fast lungevev, og skivene kan omfatte områder som stort som et tverrsnitt av en hel lobe. Vi har brukt denne protokollen for å kunne visualisere plasseringen av et stort utvalg av celletyper i lungen, inkludert forskjellige typer dendrittiske celler, makrofager, neutrofiler, T-celler og B-celler, så vel som strukturelle celler slik som lymfe, endotel, og epitelceller. Evnen til å visualisere cellulære interaksjoner, for eksempel de som er mellom dendrittiske celler og T-celler i levende, tredimensjonal lungevev kan avsløre hvordan celler bevege seg i lunge og kommuniserer med hverandre ved likevekt og ved betennelse. Således, når det brukes i kombinasjon med andre fremgangsmåter, slik som strømningscytometri og kvantitativ PCR, kan PCLS bidra til en omfattende forståelse av cellulære hendelser som ligger til grunn allergiske og inflammatoriske sykdommer i lungen.
Etter inhalering av pro-inflammatoriske stimuli så som lipopolysakkarid (LPS), er det en koordinert bevegelse av immunceller inn i, innenfor og fra lungen. For eksempel er nøytrofile hurtig rekruttert til lunge parenchyma og luftveier. I tillegg er noen profesjonell antigenpresenterende celler som er kjent som konvensjonell dendrittiske celler (CDCS) gjennomgå en forholdsvis komplisert migrasjonsmønster 1, 2. CDCS kan identifiseres ved hjelp av flow cytometri, delvis basert på deres visning av de overflatemarkør, CD11c. Distinkte undergrupper av DC kan skilles ved differensial overflateekspresjon av CD103 og CD11b 3. Ved å anskaffe inhalert antigen, noen CDCS avslutte lunge og migrere gjennom lymfekarene til lunge-drenerende lymfeknuter (LNS) hvor de presenterer peptider til antigen-spesifikke T-celler 4. Dette er en kritisk tidlig begivenhet i initiering av adaptive immun responses. Av ukjente grunner, men ikke alle kabelfordelingsskap som skaffer inhalerte antigener forlater lunge, og mange av disse cellene forblir i det organ i flere måneder 5, 6. Denne observasjonen kan delvis forklares ved den utviklingsmessige opphav til disse cellene, fordi monocytt-avledede CD11c + celler som mangler kjemokinreseptoren, CCR7, er ute av stand til å migrere til regionale LNS 7, 8. Det synes sannsynlig at migreringen potensialet i kabelfordelingsskap bestemmes også, i det minste delvis, ved sin anatomisk stilling i lungene. Imidlertid er den nøyaktige lokalisering av disse forskjellige populasjoner av kabelfordelingsskap i lungen ikke fullstendig karakterisert. En forbedret kunnskap om immunceller lokalisering i lungen, og av de molekyler som styrer det, er nødvendig for en bedre forståelse av hvordan immunsystemet til lungen blir aktivert.
PCLS blir stadigly brukt som en ex vivo-metode for å visualisere mobilposisjonerings og celle-celleinteraksjoner, og samtidig opprettholde den strukturelle integriteten til lungen arkitekturen 9, 10. PCLS har blitt brukt til å studere lungene av mange arter, inkludert mus, storfe, aper, sauer, hester og mennesker 11. En stor fordel med denne teknikken er at omtrent 20 skiver kan fremstilles fra en enkelt lapp av en mus lunge, og dermed redusere antall dyr er nødvendig for individuelle eksperimenter. Praktisk talt alle immune celletyper, inkludert DCS, makrofager, nøytrofiler og T-celler, er til stede i PCLS og opprettholde sin normale strukturer.
PCLS kan også brukes til å studere kalsiumsignalisering og kontraktilitet av luftveis og glatte muskelceller etter behandling med acetylcholin 12 eller metakolin 13. Ved denne metode bare en liten del av lungen er enalyzed mikroskopisk, men en undersøkelse rapporterte at måling av luftveistrekningen i PCLS variere bare omtrent 10% fra skive til skive, og denne variasjonen er sammenlignbart med det som ses ved hjelp av lungefunksjonstester i intakte dyr 14. Andre forskere har brukt PCLS som en ex vivo-metode for å studere forandringer i cytokinekspresjon og celleoverflatemarkører etter inkubasjon med LPS 15. PCLS har også vært anvendt i en ex vivo-modell av hypoksisk pulmonær vasokonstriksjon i små intra-acinar arterier. Disse fartøyene er plassert i den del av lungen som ikke kan nås ved hjelp av andre fremgangsmåter, inkludert opptak fra dissekerte arterielle segmenter eller analyse av subpleural fartøy 16. Vårt laboratorium har først og fremst brukes til å visualisere PCLS immunceller lokalisering i levende lungevev ved stabil tilstand, og etter en in vivo-inflammatorisk stimulus. Prosedyrene vi har utviklet for dette er som følger.
Protokollen er beskrevet her ble opprinnelig utviklet for å visualisere plasseringen av to undergrupper av kabelfordelingsskap i lungene. Imidlertid kan denne protokollen lett tilpasses for å studere mange forskjellige celletyper, og samtidig opprettholde cellenes levedyktighet og den tredimensjonale arkitektur av lungen. Sistnevnte trekk er en viktig fordel i forhold til cellekultursystemer, og muliggjør identifikasjon av sjeldne celletyper. Metoden bygger på generering av PCLS fra lungen, og en passende kombinasjo…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jeff Tucker, Erica Scappini, og Agnes Janoshazi for deres hjelp med mikroskopi, Ligon Perrow for hennes ledelse av musen kolonien, og Jun Chen og Michael Sanderson for å få hjelp med vevet slicer, og Michael Fessler og Derek Cain for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av egenutført gren av NIEHS, NIH (Zia ES102025-09), som igjen er sponset av Institutt for helse-og omsorgsminister.
C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 006617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
Normal Rat Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03HI | |
Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |