Konstruktion og opsætning af en Bench-skala Algal Photosynthetic Bioreactor med temperatur, lys og pH-overvågning for kinetiske væksttest

Summary

I dette papir beskrives montageprocessen og driften af ​​en bænkskala fotosyntetisk bioreaktor, som i forbindelse med andre metoder kan estimere relevante kinetiske vækstparametre. Dette system overvåger kontinuerligt pH, lys og temperatur ved hjælp af sensorer, en dataindsamling og styreenhed og open source dataindsamlingssoftware.

Abstract

Den optimale udformning og drift af fotosyntetiske bioreaktorer (PBR) til mikroalgal dyrkning er afgørende for forbedring af den miljømæssige og økonomiske præstation af mikroalgerbaseret biobrændstofproduktion. Modeller, der estimerer mikroalgalvækst under forskellige forhold, kan bidrage til at optimere PBR-design og -operation. For at være effektive skal de vækstparametre, der anvendes i disse modeller, bestemmes nøjagtigt. Algalvæksteksperimenter begrænses ofte af kulturmiljøets dynamiske natur, og der kræves kontrolsystemer til nøjagtigt at bestemme de kinetiske parametre. Det første skridt i oprettelsen af ​​et kontrolleret batch-forsøg er live dataindsamling og -overvågning. Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til samling og drift af en bænkskala fotosyntetisk bioreaktor, som kan anvendes til at udføre mikroalgale vækstforsøg. Denne protokol beskriver, hvordan man dimensionerer og monterer en fladplade, bænkskala PBR fra akryl. Det beskriver også, hvordan man konfigurererRe en PBR med kontinuerlig pH, lys og temperatur overvågning ved hjælp af en dataindsamling og kontrolenhed, analoge sensorer og open source dataindsamlingssoftware.

Introduction

På grund af den voksende bekymring over globale klimaændringer og begrænsede fossile brændstofressourcer har regeringer udviklet politikker for at reducere forbruget af fossile brændstoffer og tilskynde til udvikling af nye, bæredygtige transportbrændstoffer. USAs miljøbeskyttelsesagentur har udviklet den vedvarende brændselsstandard (RFS), der kræver, at 36 af de årlige 140 milliarder gallons af amerikansk transportbrændstofblanding kommer fra vedvarende brændstofkilder inden 2022. Innovative og transformerende teknologier vil være nødvendige for at opfylde disse og Fremtidige standarder for vedvarende energi ¹ .

Anvendelsen af ​​mikroalgerbaserede biobrændstoffer har potentialet til at hjælpe med at møde de nationale RFS, samtidig med at drivhusgasemissionerne reduceres ² . Mikroalgerbaserede biobrændstoffer har flere fordele i forhold til første generationens biobrændstoffer baseret på jordbaserede fødeafgrøder, såsom majs og sojabønner. I modsætning til første generation biobrændstoffer, alger-bBiobrændstoffer forbruger færre jord-, vand- og fødevarerelaterede ressourcer, da alger kan dyrkes året rundt og på ufrugtbart jord med saltvand eller spildevand. Mikroalger har høje vækstrater sammenlignet med jordbaserede afgrøder og kan akkumulere høje niveauer af lipider, der let kan omdannes til biodiesel ³ . På nuværende tidspunkt findes der ikke industrielle alger til biobrændstofanlæg på grund af de høje omkostninger ved de energiintensive produktionsprocesser, der består af algodling, lipidseparation og lipidraffinering til biodiesel. Mere forskning er nødvendig for at gøre disse processer mere effektive og bæredygtige.

PBR'er, som er optisk klare, lukkede installationer til fremstilling af fototrofiske mikroorganismer i et kunstigt miljø, betragtes som en af ​​de mest lovende dyrkningsmetoder ³ . Men de nuværende designs mangler stadig den volumetriske produktivitet, der er nødvendig for at producere algen til biobrændstofproduktionEss mere effektiv og økonomisk attraktiv ⁴ . Kraftfulde matematiske modeller, der betragter lysbestråling og dæmpning, transport af næringsstoffer og CO ₂ , og mikroalgenes vækst kan i høj grad lette optimeringen af ​​PBR-design og -operation. Bench-skalavæksteksperimenter er nødvendige for at bestemme artsspecifikke vækstparametre for disse optimeringsmodeller.

Kinetiske tests kræver nøje overvågning og kontrol af forsøgsopsætninger for at forhindre utilsigtede hæmmere af vækst. På grund af algens fotosyntiske karakter ( dvs. deres forbrug af CO ₂ og lysabsorption) er opretholdelsen af ​​kontrollerede betingelser særligt vanskelig i PBR'er i bænkeskalaer. Som afbildet i ligning 1 , mængden af ​​opløst CO ₂ i vækstmediet, betegnet almindeligvis som ( Ligning 2 ) vil mindst være aFunktion af: 1) CO ₂ -partialtrykket og Henry's ligevægtskonstant, som dikterer mængden af ​​gas, der vil opløses i opløsning ( ligning 3 ); 2) den oprindelige kemiske sammensætning af vækstmediet, hvilket påvirker sammensætningen og aktiviteten af ​​carbonationerne og pH ( ligninger 4 og 5 ); Og 3) temperaturen, som påvirker ligninger 3-5 ⁵ .

De forskellige faser og kemisk sammensætning af carbon skaber en udfordring til måling og opretholdelse af en konsistent opløst kulstofkoncentration inden for en PBR whiLe holder andre tilstande konstant ( fx øges pH, da algerne forbruger CO ₂ , og forøgelse af det opløste CO ₂ -substrat kan muligvis føre til et surt miljø, der hæmmer væksten) ⁶ .

Et yderligere lag af kompleksitet til styring af tilstande under alge kinetiske test involverer lysintensiteten inden for PBR. Den gennemsnitlige lysintensitet i en PBR er en funktion af ikke kun den indfaldende lysintensitet, men også designet ( fx materiale, form, dybde og blanding), absorptionen af ​​algebiomassekomponenter (især chlorophyll) Spredning egenskaber af alger celler. Da algerne vokser, vil den gennemsnitlige lysintensitet falde. Denne ændring i lysintensitet, uanset om den er forårsaget af en stigning i de samlede celler og biomasse, en forøgelse af chlorophyllindholdet pr. Celle eller begge dele, kan til sidst fremkalde et metabolisk respons, såsom en forøgelse af chlorophyllproducentenCtion pr. Celle eller anvendelsen af ​​kulhydrat og lipidopbevaringsprodukter til energi ⁷ . Kontinuerlig overvågning af lysintensiteten fra reaktoren giver uvurderlig information. Disse data kan bidrage til at sikre, at betingelserne forbliver inden for et bestemt interval og kan bruges til at estimere algalvækst og absorbansparametre, hvis de kombineres med andre målinger ( dvs. biomasse, chlorophyllkoncentration, reaktordybde, indfaldende lys osv. ).

Forståelse af hvordan alger vokser under et bestemt sæt betingelser kræver, at pH, opløst CO ₂ , lysintensitet og temperatur overvåges i bænkeskala kinetiske eksperimenter. Mange algalvækstopsætninger er ikke udstyret til at overvåge forholdene i det omfang der kræves til kalibrering af kinetiske modeller, hvilket gør modelleringsprocessen ekstremt udfordrende ⁸ . Selvom mange virksomheder tilbyder bænkeskala PBR'er med automatisering og kontrol, er disse bænkskalaerE opsætninger kan være ekstremt dyre (~ $ 20.000) og kan muligvis ikke rumme alle eksperimentelle overvejelser af et givet forskningsspørgsmål.

Det første skridt i oprettelsen af ​​et kontrol-feedback system til et batch-eksperiment er live dataindsamling. Dette dokument har til formål at demonstrere, hvordan man konstruerer og opretter en PBR-bænk udstyret med kontinuerlig lys-, pH- og temperaturovervågning. Denne overvågningsopsætning i realtid kan bidrage til at sikre, at forsøgsbetingelserne forbliver inden for de ønskede områder efter forskerens skøn. Mens denne protokol ikke detaljerer specifikke kontrolmekanismer, giver disse trinvise instrukser et grundlæggende grundlag for den dataopsamlingsramme, der kræves, før mere sofistikerede kontrolfeedbacks kan implementeres.

Protocol

1. Konstruer Bench-skala PBR Body og Lid

BEMÆRK: Til illustration formål Dunaliella sp. , En ~ 10 μm halotolerant mikroalga, der manglede en cellevæg, blev anvendt som modelorganisme til konstruktionen af ​​denne PBR.

1. Bestem det krævede PBR-volumen for forskningsbehovene.
   1. Bestem de eksperimentelle mål for denne PBR.
   2. Bestem hvilke algemålingsassays, M , der er nødvendige for at karakterisere væksten af ​​de pågældende algsparter, herunder det krævede volumen pr. Assay, v ; Antallet af tekniske replikater, n ; Prøveudtagningsfrekvensen, f ; Og varigheden af ​​forsøgene, t .
      BEMÆRK: Projektspecifikke undersøgelsesspørgsmål, algerarter og ledigt udstyr dikterer de målte alger, de metoder, der anvendes til disse målinger, og hvor ofte disse målinger tages. Biomasse; Celle tæller; Og totalKlorofylpigment, protein, lipid, kulhydrat og ydre nitratkoncentrationsmålinger er almindelige måder at vurdere vækst på, og daglig prøveudtagning over 5-14 dage er en fælles tilgang til væksttest ^{9 , 10} .
   3. Beregn det totale kulturvolumen, V _s , der kræves til prøveudtagning gennem ét forsøg under anvendelse af ligning 6 .
      
   4. Brug ligning 7 til at estimere et mål PBR-volumen, Vp , ved hjælp af Vs fra trin 1.1.3 og en maksimal fjernelsesfraktionsfraktion, F.
      
      BEMÆRK: Fjernelse af mindre end en forud specificeret brøkdel af den samlede kulturmængde ( f.eks. ~ 20%) kan bidrage til at sikre, at forholdene i PBR dvs. (blandekraft, lysfordeling osv. ) Ikke drasticaLly varierer i løbet af forsøget, da kulturvolumenet fjernes.
      1. Antag et 10-dages eksperiment hvor biomasse; Celle tæller; Og samlede klorofyl-, protein-, lipid-, kulhydrat- og nitratkoncentrationer måles dagligt i triplicat, anvende et samlet prøveudtagningsvolumen på ~ 600 ml. Hvis man har til formål at fjerne ikke mere end 18,75% af den samlede kulturmængde, skal man anvende en samlet reaktorvolumen på mindst 3,2 L.
2. Vælg sensorer og tilbehør til PBR eksperimenterne.
   1. Vælg pH, lys og temperaturprober til brug for kontinuerlig overvågning.
      BEMÆRK: Sensorer skal være kompatible med dataindsamlingsenheden og skal modstå interne kulturbetingelser ( dvs. pH-område, lys, varme, algrester, salt osv. ). Rustfrit stål og salttolerante prober blev valgt her siden Dunaliella sp. Er marine mikroalger.
   2. Vælg et impeller design og motor for at tilfredsstille exPerimental blanding krav.
      BEMÆRK: En lavforskydende aksialhjul er et godt valg for Dunaliella- alger, da de mangler en cellevæg og nemt kan forskyde ¹¹ . Disse alger har flagellær bevægelse og behøver intenst blanding ¹¹ . Lav blandehastighed kan opnås ved hjælp af en 12 V mini-gearmotor. Hjulet og akslen kan 3D-udskrives (3D-udskrivningsoplysninger findes på materialelisten).
3. Saml PBR krop og låg.
   1. Bestem reaktorens dimensioner ud fra volumenberegningerne i trin 1.1, idet der tages hensyn til de eksperimentelle mål og potentielle begrænsninger ( fx rum).
      BEMÆRK: Et PBR-design med et lavere forhold mellem volumen og volumen foretrækkes, da denne form minimerer lysdæmpning i hele PBR'en, hvilket giver en mere konsistent lysfordeling gennem hele eksperimentet.
   2. Skær fem stykker optisk klar støbningAkrylplader (~ 0,25-0,5 i tykke) ved hjælp af en bordsave ifølge PBR-design og -størrelse etableret i trin 1.3.1.
   3. Sørg for, at fugekanterne er glatte, men ikke afrundede, ved hjælp af 200 til 400 sandpapir.
   4. Fastgør kanterne af akrylstykkerne sammen med tape og / eller klemmer.
      BEMÆRK: Akrylcement er ikke lim. Hvis de akrylbundne overflader er ru eller akrylstykkerne ikke er ensartet justeret, vil denne bindingscement ikke være effektiv.
   5. På et godt ventileret område skal du anvende akrylcement langs leddene ved hjælp af en nåle dispenser. Plastfladerne vil straks klæbe sammen. Lad stykkerne sidde i 24 timer.
      ADVARSEL: En maske og handsker bør bæres for at undgå indånding og hudeksponering ved brug af akrylcement.
   6. Påfør viskos akrylcement på leddene for at sikre, at PBR er vandtæt. Lad cementet tørre i 24-48 timer i henhold til cementinstruktionerne. Tørringstider kan variere.
   7. UdfyldReaktor med vand for at kontrollere synlige lækager. Hvis der ikke er nogen lækage, skal reaktoren anbringes på papirhåndklæder og kontrolleres for tegn på lækage efter 24-36 timer.
      BEMÆRK: Akrylplader ikke mindre end ~ 0,5 i tykke skal bruges til at samle PBR'er med mere end ~ 2 L; Tyndere ark kan bøje under vandtryk og forårsage lækager. Pakninger og genkravskruer kan bruges som et mere robust alternativ til akrylcement ( figur 1 ). Denne type montering kræver præcisionsmaskineri og skal gøres ekstremt omhyggeligt, da akryl let kan knække.
   8. Brug en maskinbutik til at designe PBR-låget, med porte, der kan rumme sensorer og andre PBR-tilbehør og behov ( dvs. pumpehjul, gasledninger, prøveudtagningsporte osv. ). Sørg for, at de interne komponenter ikke forstyrrer hinanden.
      BEMÆRK: PBR og PBR låget konfiguration / design vil afhænge af reaktortilbehør og eksperimentelle mål. Se figur 1For et eksempel på en PBR reaktor og låg design (yderligere detaljer kan findes i materialet sektionen). Dette PBR-design vil blive henvist til resten af ​​protokollen.

Figur 1: Billede af den tilpassede Bench-skala PBR Setup med sensorer og mixer. Denne opsætning viser en mixer, en elektrode fastgjort til låget gennem en gevindforsynet port i låget og en lyssensor fastgjort til et specielt designet låg. Dette lågdesign omfatter også vedhæftning af en 12 V DC mini-gearmotor. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Opsætning og konfiguration af sensorer med dataovervågnings- og styreenheden

BEMÆRK: Sensorer oversætter ændringer iDen fysiske verden ind i et målbart analogt signal, ofte spænding. Dataindsamlingsenheder tjener som en grænseflade mellem den digitale og fysiske verden og kan bruges til at læse disse analoge signaler og konvertere dem til diskrete værdier, som instrueret af en computer. Den dataindsamlingsenhed, der er beskrevet heri, har en analog indgangsopløsning på 16 bits, kan læse op til 14 analoge signaler (± 10 V) og kan levere den effekt, der kræves af nogle sensorer (op til 5 V). Disse instruktioner giver et overblik over, hvordan man opretter denne dataindsamling og kontrolenhed for at konvertere et analogt signal til mere meningsfulde værdier for lys, pH og temperatur inden for en PBR. Disse instruktioner beskriver ikke vigtige begreber ( dvs. kvantificering, præcision, responstid osv. ), Der er nødvendige for fuldt ud at fortolke disse målte værdier og for at kvantificere usikkerhed.

Figur 2: Tilslutningsdiagram for sensor til dataoverførsel og kontrolenhed. Dette diagram viser, hvordan man opsætter pH-, lys- og temperatursensorer til dataopsamlingen og kontrolenheden, der anvendes til denne protokol. Signalbehandlingskomponenter til pH- og lyssensoren er vist. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Opsæt og konfigurer lyssensoren med dataindsamlingen og styreenheden ved hjælp af et lavpasfilter.
   BEMÆRK: Se venligst figur 2 for generelle referencediagrammer. Fabrikatens specifikationer angiver forskellen mellem signal, strøm og jordledninger baseret på farve. Et lavpasfilter er et simpelt kredsløb, der bruger en modstand og kondensator til at filtrere uønsket støj fra elektriske signaler. Denne type filter dæmper elektriske signaler med frekvenser højere thaN cutoff frekvensen som bestemt af modstand og kapacitans. Dette filter hjælper med at fjerne eller glatte elektrisk støj fra sensorsignalet.
   1. Ved hjælp af wire strippere, skære en ~ 2 tommer stykke grøn stik Strip 0,25 i isolering fra den ene ende og ~ 0,5 ind fra den anden ende af begge stykker.
   2. Identificer den analoge signaludgangstråd på lyssensoren. Sørg for, at mindst ~ 0,25-0,50 tommer metaltråd udsættes forbi trådisoleringen.
   3. Sæt forsigtigt et ben på 1000 Ω modstanden omkring den 0,5 tommer strippede ende af forbindelsestrådene. Pak det andet ben af ​​modstanden rundt om den eksponerede del af lyssensorens analoge signalledning.
   4. Brug et loddejern og blyfri lodde til lodning af modstandsbenene til ledningen. Lad loddet afkøles i 2-5 minutter.
      ADVARSEL: Loddemålerne bliver meget varme og kan være meget farlige, hvis brugerne ikke er ordentligt uddannet. Instruktionsvideoer kan findes online. Sikkerhedsbriller og andre forholdsregler er yderst vigtige. Ledninger bør ikke tilsluttes strømforsyning eller andre enheder under denne proces.
   5. Sæt en ~ 1,5 tommer varmekrympeslange over den ene ende af forbindelsestrådene, og glid stykket, indtil det dækker loddetråd og modstand. Sørg for at alle metalstykker er fuldt dækket.
   6. Varmekrymp med en varmepistol. Sørg for, at slangen vikles tæt rundt modstand og ledninger; Ingen ledig ledning skal udsættes.
   7. Fastgør lysfølerens jordledning til en fri jord (GND) terminal på dataindsamlingen og styreenheden ved hjælp af en skruetrækker.
   8. Fastgør den fri ende af signalstikket til en ledig analog indgangsstik (AIN) med en skruetrækker.
   9. Fastgør den positive ledning på 1000 μF kondensatoren ( dvs. det længere ben) til den samme AIN-terminal som i trin 2.1.8 og den negative ledning (det kortere ben) til den samme GND-terminal som i trin 2.1.7.Sørg for, at både kondensatorbenet og ledningen er fast forbundet til terminalen.
   10. Identificer strømforsyningskablet til lyssensoren og fastgør denne ledning til en spændingsforsyning (VS) terminal på dataindsamlings- og styreenheden.
2. Opsæt og konfigurér pH-elektroden med dataindsamlingsenheden ved hjælp af en enhedsforstærker og et lavpasfilter.
   BEMÆRK: På grund af arten af ​​pH-målinger ( dvs. høj impedans og lav spænding) kræves der ofte en enhedsforstærkende buffer mellem pH-sonden og datafangstningsenheden. Et lavpasfilter er også gavnligt til måling af pH for at beskytte signalet fra omgivende elektrisk støj.
   1. Forbind enhedsforstærkeren til pH-sonden ved hjælp af transmitterledningen.
   2. Tilslut den co-aksiale adapter med positive og negative portterminaler til den anden ende af enhedsforstærkeren.
   3. Skær to 6-i stykker grøn og en ~ 12 tommer piecE af sort konnektortråd ved hjælp af wire strippere. Strip ~ 0,25 tommer isolering fra begge ender af den sorte forbindelsestråd.
   4. Strip ~ 0,25 tommer og ~ 0,5 tommer isolering ud for enderne af de grønne forbindelsesledninger ved hjælp af trådstrimmere.
   5. Sæt forsigtigt et ben på 1000 Ω modstanden omkring den 0,5-tommers strippede del af en grøn stikketråd. Pak det andet modstandsben rundt om den ~ 0,5 tommer strippede del af den anden grønne forbindelsestråd.
   6. Brug et loddejern og blyfri lodde til lodning af modstandsbenene til ledningen. Lad loddet afkøles i 2-5 minutter.
   7. Sæt en ~ 1,5 tommer varmekrympeslange over den ene ende af forbindelsestrådene, og glid stykket, indtil det dækker loddetråd og modstand. Sørg for at alle metalstykker er fuldt dækket.
   8. Varmekrymp med en varmepistol. Sørg for, at plastikbåndene er tæt omkring modstanden og ledningerne; Ingen ledig ledning skal udsættes.
   9. Fastgør den ene ende af den sorte cOnnector wire til den negative (sorte) terminal post på co-aksial adapter. Sæt den anden ende af denne ledning i en GND-terminal på dataindsamlings- og styreenheden og fastgør den ved hjælp af en skruetrækker.
   10. Fastgør den ene ende af den grønne forbindelsestråd (med modstanden i serie) til det positive (røde) klemmeindlæg på koaksialadapteren. Sæt den anden ende af denne stikledning ind i en fri AIN-terminal på dataindsamlings- og styreenheden.
   11. Identificer den positive ledning på 1000 μF kondensatoren ( dvs. det længere ben) og fastgør denne ledning til den samme AIN-terminal som i trin 2.2.9; Sørg for, at både kondensatorbenet og signalledningen er fast forbundet til terminalen.
   12. Fastgør den negative ledning på 1000 μF kondensatoren ( dvs. det kortere ben) til den samme GND-terminal som i trin 2.2.8.
3. Tilslut temperaturføleren til dataindsamlingen og styreenheden ved at forbinde signalet, jorden og strømmen wIres af sonden at frigive AIN, GND og VS terminaler.

3. Indstil Live Data Acquisition og Experimental File

BEMÆRK: Dataovervågnings- og styringssoftwaren beskrevet her kommunikerer med dataindsamlings- og styreenheden for at overvåge og logge sensordata ved brugerdefinerede tidsintervaller. Instruktionerne nedenfor forklarer, hvordan man opretter en kontrolfil i denne software til overvågning og registrering af pH, temperatur og lys. Disse instruktioner er specifikke for software- og dataindsamling og kontrolenhed, der er angivet i materialesektionen. Yderligere instruktioner findes i produktbrugsanvisninger.

1. Slut dataopsamlingen og styreenheden til en computer i nærheden af ​​eksperimentelle opsætninger ved hjælp af et USB-kabel og download alle nødvendige drivere.
2. Download og åbent dataopsamlings- og kontrolsoftware.
3. Konfigurer "Konverteringer" for hver sensor i softwaren.
   BEMÆRK: At konvertere den fysiske voltAlderssignal til en meningsfuld værdi, skal en vis konverteringsfaktor etableret ved kalibrering anvendes. Mange sensorer leveres med fabrikskalibreringsfaktorer, der findes i produktspecifikke specifikationer. Konverteringsligninger er specifikke for opsætningen og sensorerne. Mange konverteringsligningsparametre, især dem for elektroder, skal opdateres regelmæssigt via kalibrering. Sensorens og kalibreringsfrekvensens levetid afhænger af produktspecifikke specifikationer og arbejdsmiljø.
   BEMÆRK: Brugere skal læse og forstå disse specifikationer fuldt ud. Tabel 1 viser konverteringer til sensorer fundet i materialelisten. Et eksempel konvertering til temperaturproben er vist nedenfor.
   1. Naviger til "Konverteringer" i software arbejdsområdet, på højre side af hovedsiden.
   2. Tilføj et konverteringsnavn, f.eks. "Volts_to_celsius" og indtast konverteringsligningen: (55,56 x værdi) + 255,37 - 273.15.

Kanalnavn	Konverteringsnavn	ligning	Noter
Temperatur	volts_to_celsius	(55,56 x værdi) + 255,37 - 273,15	Producent konvertering ligning til at konvertere volt til celsius.
Lys	volts_to_PPFD	Værdi x 500	Fabrikantens omregningsfaktor for at konvertere volt til fotosyntetisk fotonfluxdensitet (μmol m -2 s -1 ), producentens LED-korrektion er ikke anvendt.
pH	volts_to_pH	(-17,05 x værdi) + 6,93	Kalibreringsafhængig konverteringsligning (Figur 4b) for at omdanne pH-elektrodespændingsaflæsninger til pH-værdier. Anvend kun omdannelse til pH-kanal aFter kalibrering.

Tabel 1: Kanalkonverteringstabel til dataovertagelsesfilen. Eksempler på, hvordan du indsætter kanal- og konverteringsinformation for sensorer i dataovervågningssoftware.

4. Indstil passende kanaler for hver sensor i softwaren til at erhverve sensor data.
   BEMÆRK: Hver sensor har brug for sin egen analog-til-digitale kanal i softwaren og en udpeget analog indgangsterminal i dataindsamlings- og styreenheden.
   1. Naviger til "Channel" siden i softwaren.
   2. Tilføj et sensorkanalnavn. Ingen mellemrumstegn er tilladt.
   3. Vælg den relevante enhed til at indsamle data for den tilsvarende kanal; Denne enhed svarer til den dataindsamlingsenhed.
   4. Indtast det enhedsnummer, der bruges til at henvise til dataindsamling og styreenhed eller andetDatafangende enhed; Hvis kun en enhed bruges, er standardnummeret ofte nul.
   5. Vælg analog-til-digital, "A til D" for input-output type ("I / O Type") og indtast kanalnummeret, der svarer til AIN-terminalnummeret på dataindsamlings- og styreenheden
   6. Indtast den ønskede prøveudtagning "Timing" (s); Denne værdi angiver, hvor ofte sensorsignalet vil blive læst. Input 1.0 for at få en læsning hver 1 s. Til gennemsnitlige data i løbet af 1 min intervaller forud for logning, skal du kontrollere "Gem" boksen og angive 60 for gennemsnitslængden.
   7. Vælg den relevante konvertering fra rullemenuen, hvis det er relevant (se trin 3.3 for at generere konverteringer); Ellers vil alle kanaldata blive vist / optaget som en spænding.
5. Indstil "Logging Set" for at logge eksperimentelle data.
   1. Naviger til "Logpanelet" inden for software arbejdsområdet, tilføj enEw logging sæt, og navngiv sætningen i overensstemmelse hermed. Vælg output filtype og placering; ASCII-filtypen vil give en kommasepareret værdifil, hvis udvidelsen '.csv' er angivet i outputfilnavn.
   2. Tilføj alle ønskede kanaler for at logge på dette sæt.
   3. Start og stop logning som ønsket ved at højreklikke på loggensekvensen i arbejdsområdet og vælge den relevante indstilling.
      BEMÆRK: Forsøg ikke at få adgang til filen, når du aktivt logger på data. Denne handling kan forstyrre logningsprocessen. Filplaceringen for kontinuerligt loggede filer skal ikke gemmes / skrives i en cloud-mappe.
6. Indstil "Side" for at vise data og grafer.
   1. Naviger til "Sider" displayet i software arbejdsområdet. Klik på et af standardblanke sider.
   2. For at vise en sensorudgang, der læses numerisk på siden, skal du tilføje et "Variable Value" display til siden.
      1. RigHt-klik hvor som helst inden for den tomme side, vælg "Displays", og klik på "Variable Value" indstillingen; En lille boks vises på skærmen.
      2. Højreklik på denne nyoprettede boks og vælg "Egenskaber". Indtast skærmbilledet (f.eks. "Temperatur i reaktor"), kanalreferencen (f.eks. "Temperatur [0]") og de tilhørende enheder (f.eks. "Celsius"). Klik på "OK" og vend tilbage til displayet.
   3. For at vise sensordata grafisk og i realtid, tilføj en 2D-graf til displaysiden.
      1. Højreklik på et vilkårligt sted på den tomme side og vælg "Grafer" og derefter "2-D grafer;" Et lille plot vises på skærmen.
      2. Højreklik på den nyligt oprettede graf og vælg "Egenskaber". Indtast det ønskede sensorkanalnavn (f.eks. "Temperatur") i boksen til "Y Expression:" inden for fanen "Traces" og sørg for at "Time" er skrevetN i boksen for "X Expression :." Klik på "OK" og vend tilbage til displayet.

4. Kalibrere pH-proben

BEMÆRK: pH-kalibrering skal udføres før hvert forsøg, med den tilsigtede temperatur i eksperimentet, og pH -kanalomregningen skal opdateres i overensstemmelse hermed. PH-elektrodeaflæsninger kan drifte under eksperimenter; For at bestemme omfanget af denne drift skal man gentage kalibreringsprocessen efter at have kørt den eksperimentelle opsætning og sammenligne aflæsningerne. PH-elektroder skal opbevares korrekt i den passende opbevaringsopløsning før og efter forsøg, som angivet af fabrikanten.

1. Tilslut pH og temperaturfølere som beskrevet i trin 2.
2. Indsæt både pH-elektroden og temperaturproben i pH-kalibreringsbuffer 7.
3. Kontrollér det grafiske display for at sikre, at temperaturens aflæsning af sonden er ved den ønskede temperaturTil at køre eksperimenter (trin 3.6.2.2).
4. Lad pH-elektrodens spændingsudgang stabilisere sig ( dvs. spændingslæsningerne ændres ikke længere i en retning). Brug et grafisk display for at bekræfte stabilisering.
5. Log både temperatur og pH elektriske data til en fil (trin 3.5) i 30-60 s. Under denne proces bør pH-kanalen ikke have nogen konverteringer anvendt eller inkludere nogen middelværdi.
   Bemærk: Da pH-elektroderne er følsomme for elektrisk støj, kan en lavere overtagelsestidspunkt (dvs. hurtigere prøveudtagning) for pH-kanalen være at foretrække ( f.eks. 'Timing' = 0,1 s). Husk, en lavere timing vil kræve flere beregningsmæssige ressourcer.
6. Gentag kalibreringen for buffere 4 og 10. Bekræft, at sensorens respons er mellem -57 og -59 mV / pH ( figur 3a ).
7. Generer en konverteringsligning ved at plotte pH-bufferværdien versus spænding og montering af en linje ( figur 3b >). Opdater konverteringsligningen som beskrevet i trin 3.3.
8. Anvend denne konvertering til pH-kanalen og opdatér kanalindstillingerne for at inkludere gennemsnittet som ønsket til logning.

5. Indstil PBR til Algal Eksperimentet

BEMÆRK: Trinene nedenfor er specifikke for Dunaliella og den brugerdefinerede PBR, der er vist i Figur 1 . Desuden er disse installationsinstruktioner ikke i overensstemmelse med sterile protokoller, da dette system ikke var designet på en sådan måde.

1. Forbered algeren inokulum og vækstmedium, som det er nødvendigt for eksperimentet og eksperimentelle mål.
2. Tilslut pH- og temperaturkablerne til dataindsamlings- og styreenheden, som beskrevet i trin 2.2-2.3.
3. Kalibrere og opdatere konverteringsligningen for pH- kanalen som beskrevet i trin 3.3 og 4.

Igimg "src =" / files / ftp_upload / 55545 / 55545fig4.jpg "/>
Figur 4: Ledningsdiagram for mixeren. Dette diagram viser, hvordan man opretter en blandingsenhed til en PBR ved hjælp af en mini-gearmotor, en strømforsyning og en 3D-trykt pumpehjul og aksel. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Indstil PBR inde i en temperaturstyret inkubator med tilbehør og sensorer. Se figur 4 til visualisering.
   1. Indstil lyssensoren inden for PBR ved at trille lysfølerledningen gennem lågeåbningen og derefter montere sensorhovedet på låget forlængelsesbeslaget med den medfølgende skrue. Brug en gummiprop eller gummiprop for at holde denne port lukket for atmosfæren.
   2. Fastgør og fastgør mixerhjulet på PBR-låget ved at placere pumpeakslen over DC mini-gearmotorenAksel inde i PBR låget; Sikre akslen med en sæt skrue og en unbrakonøgle.
   3. Tilsæt algespecifik vækstmedium, læg låget og fastgør låget med skruer. Placer PBR inde i inkubatoren (indstillet til 25 ° C eller den ønskede temperatur).
   4. Indsæt temperaturføleren i den udpegede port og fastgør den i porten ved hjælp af en gummiprop.
   5. Fastgør pH-sonden ind i reaktorlåget med en PG-13.5 gevindbeslag.
   6. Tilslut lysfølerens ledninger til dataindsamlingsenheden, som beskrevet i trin 2.1.
5. Drej blanderhjulet til den ønskede hastighed.
   1. Konfigurer den variable DC strømforsyning ved siden af ​​opsætningen. Tænd for strømforsyningen og juster spændingsknappen, indtil spændingsværdien læser 0 volt. Sluk for strømforsyningen.
   2. Tilslut pumpehjulets motorledninger til de positive og negative udgangsterminaler af den variable strømforsyning ( Figur 5 ADVARSEL: Tilslut aldrig eller rør direkte ledninger eller kredsløb. Sørg for, at alle strømforsyninger er slukket, inden du tilslutter ledninger. Læs altid producentens instruktioner / specifikationer for at sikre kompatibilitet mellem motor, strømforsyning og ledninger.
   3. Tænd for strømforsyningen og sænk langsomt spændingen ved at dreje spændingsknappen, indtil den ønskede blandingshastighed er nået; Beregne blandingshastigheden ved at måle rotationerne pr. Min.

Figur 5: Reaktor Eksperimentel Setup Diagram. Visualisering af en PBR eksperimentel opsætning inden for en temperaturstyret inkubator. Denne opsætning omfatter en vokslampe og en PBR, med sensorer og en blander sikret i PBR-låget. Venligst klik her tilSe en større version af denne figur.

6. Indstil vækstlampen for at belyse PBR.
   BEMÆRK: En kraftdrevet LED-lampe, der udsender i det blå og det røde spektrum, blev valgt for at opnå de fotosyntiske lysintensitetsniveauer, der kræves til denne Dunaliella- specifikke undersøgelse. Størrelsen og formen af ​​lysarmaturen skal vælges således, at lyset jævnt lyser PBR's indfaldende overflade. Kontroller, at inkubatoren kan håndtere en intern varmekilde. Hvis du ikke gør det, kan du forkorte inkubatorens levetid og / eller kunne forårsage skade eller overdreven opvarmning i inkubatoren.
   1. Centrer vækstlampen langs forsiden af ​​PBR. Sørg for, at lysstien er rettet mod lysføleren monteret på bagsiden af ​​reaktoren.
   2. Tænd lyset og juster lysintensiteten efter behov ved at flytte vækstlampen direkte mod eller væk fra reaktoren. Kontrollér sensorens variabeldisplay for lysaflæsninger.
7. Overvåg og log sensordataene i 6 - 24 timer for at sikre, at lys, temperatur og pH-aflæsninger inden for PBR er stabile og inden for det ønskede interval. Juster efter behov.
   BEMÆRK: Elektrisk støj kan ofte observeres ved hoppende, ustabile aflæsninger og / eller pludselige ændringer i værdier uden tilsyneladende ændringer i PBR-miljøet.
8. Fjern gummiproppen på prøveudtagningsporten for at tilsætte algerinokulum via overføringspipetten.
9. Fjern prøverne og kontroller betingelserne for at sikre, at de forbliver inden for det ønskede interval for eksperimentet.
   1. Fjern kulturerne til analyse efter behov fra prøveudtagningsporten ved hjælp af en pipette.
      BEMÆRK: Prøvens volumen, frekvens og varighed af eksperimentet afhænger af trin 1.1.2.
   2. Overvåg vandtemperaturen inden for PBR ved at kontrollere datavisningen i softwaren og manuelt justere inkubatorlufttemperaturens indstillingspunkt for at holde vandet tempeRatur konstant.
      BEMÆRK: Denne justering vil afhænge af instruktionerne fra inkubatorfabrikanten.
   3. Overvåg og juster pH i PBR efter ønske for at sikre, at pH forbliver inden for det forventede område for forsøgene.
      BEMÆRK: Her blev pH styret med en 12 V magnetventil (normalt lukket) i tråd med en komprimeret CO2-tank (99,99%). Ventilen blev åbnet efter behov ved hjælp af kontrolfunktionaliteten i dataindsamlings- og styreenheden og softwaren. Denne opsætning krævede et tilbehør relækort og DC-moduler og blev implementeret ved brug af brugerdefineret computerprogrammering skræddersyet til specifikke forskningsmål.

Representative Results

Data fra dette overvågningssystem i realtid viser det dynamiske kulturmiljø for alger inden for en PBR-bænk og fremhæver behovet for overvågning og styring af systemet. De loggetemperaturdata ( Figur 6 ) viser, hvordan lysbelysning, inkubatorlufttemperatur og energidissipation i forbindelse med algvækst kan ændre temperaturen inden for PBR og hvordan realtidsdata kan bruges til at justere inkubatortemperaturreguleringen efter behov.

Det målte lys i løbet af eksperimentet understreger yderligere den dynamiske natur af dette voksende miljø. Som det blev observeret i figur 7 var lyssensorlæsningen målt som fotosyntetisk fotonfluxdensitet (PPFD; μE-m -2s ^-1 ), ~ 100 PPFD før alger blev tilsat og faldt straks til 85 PPFD afTer inokulere reaktoren med algenkulturen. Lyset fortsatte med at falde til mindre end 5 PPFD på dag 7. Dette fald i lysintensitet skyldes stigende biomasse og celleantal og / eller forøgelse af absorptionen ved forøget chlorophyllindhold, hvilket viser, at alger er aktive igennem dag 7, til trods for lavt Lysniveauer. Yderligere biologiske målinger er nødvendige for at gøre yderligere afledninger.

De kontinuerligt registrerede pH-data viser, at pH-værdien samlet set blev kontrolleret tilstrækkeligt under dette eksperiment med den implementerede pH-kontrolalgoritme ( figur 8 ). Disse data, der viser både minut-for-minut-aflæsninger og timelange gennemsnit, viser nogle få nøglepunkter om dyrkning af alger og overvågning af pH i realtid. For det første steg pH-værdien over det ønskede sætpunkt på 7,6 umiddelbart efter inokulering af PBR med alger. Denne ændring var forventet, da kulturfrøet, der blev tilsat til PBR, havde apH værdi højere end setpunktet, da kolben anvendt til at dyrke inokulumet ikke var pH-kontrolleret. For det andet fremhæver disse levende data, hvordan følsomme pH-elektroder er til ekstern elektrisk støj. Denne følsomhed bemærkes ved et drastisk spring i elektrodeværdierne mellem dag 1 og dag 2. Disse pludselige ændringer i pH-værdier blev sandsynligvis skabt af elektrisk støj fra en magnetventil fra en tilstødende forsøgsopsætning. Denne elektriske forstyrrelse udløste for tidligt pH-kontrolalgoritmen for at injicere CO ₂ i PBR. Som følge heraf faldt pH-værdien under det ønskede sætpunkt. PH-elektrodernes følsomhed kan føre til ekstreme afvigere og kan potentielt forstyrre styresystemerne.

Figur 3: pH-svar og kalibreringseksempelgrafer. ( A ) Eksempel respons graf af thE pH-sensor ( b ) Eksempel kalibreringsgraf af pH-sensoren, med en ligning til brug for omdannelsen. Regressionsanalyse viser et 95% konfidensinterval. Fejlstænger er ikke synlige (standard fejl mindre end 0,03%). Disse grafer viser, at pH-sensorerne var korrekt forbundet, og at signalet var meget stabilt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Temperaturmålinger inden for PBR Under et 7 dages forsøg. Mørkeblå punkter repræsenterer 1-h gennemsnit af sensordata, og lyseblå punkter repræsenterer sensorlæsninger erhvervet i løbet af 1 min (akkumuleringstimering på 1 s, gennemsnitlig længde på 60) og omdannet til temperatur ved hjælp af fabrikationsleverede konverteringsfaktorer. Sorte pile sho W, når inkubatortemperaturens indstilling blev justeret for at opretholde kulturtemperaturen omkring 25 ° C (dette ønskede sætpunkt er angivet med en rød prikket linje). Temperaturvariationer skyldes algalvækst og ændringer i inkubatortemperaturen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Lysmål inden for PBR Under et 7 dages eksperiment. Mørkeblå punkter repræsenterer 1 h gennemsnit af sensordata, og lyseblå punkter repræsenterer sensorlæsninger erhvervet i løbet af 1 min (akkumuleringstidspunkt på 1 s, gennemsnitlig længde på 60) og omdannet til PPFD ved hjælp af fabrikskalibreringsværdier for standardføler."> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8: pH-målinger inden for PBR under et 7 dages forsøg. Mørkeblå punkter repræsenterer 1-h gennemsnit af sensordata, og lyseblå punkter repræsenterer sensorlæsninger, der logges hver 1. minut (overtagelsestidspunkt på 0,1 s, gennemsnitslængde på 600) og konverteres til pH ved hjælp af konverteringsligning etableret via kalibrering. PH blev holdt mellem 7,6 og 7,5 ved anvendelse af en 99% CO2-injektion. De røde, stiplede linjer indikerer det ønskede pH-interval. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Dette PBR-system tilbyder evnen til at overvåge og kontrollere bækskala alge kinetiske vækstforsøg, hvilket giver mulighed for mere repeterbare resultater fra eksperimentelle analyser, der anvendes til at kvantificere vækst. En forståelse af begrænsningerne og usikkerheden af ​​sensormålinger er imidlertid afgørende for at sikre, at sensoraflæsningerne nøjagtigt reflekterer reaktorbetingelserne. Denne forståelse omfatter grundlæggende kendskab til måleprincipperne involveret med sensorer, kalibreringsprocessen og hyppigheden, måleusikkerheden og hvad sensoren kan og ikke kan måle. For eksempel er det elektriske svar for lysføleren, der er beskrevet her, ikke lige fordelt over det synlige spektrumområde, og visse korrektionsfaktorer må muligvis påføres sensorudgangen, afhængigt af hvordan denne sensordata vil blive analyseret.

Temperaturniveauer og variationer er også yderst vigtige, da ændringer i temperaturen kan drastisk indFluensere sensorresponsen. Forståelse af potentielle interferenser, som kan påvirke sensoraflæsningerne, er også kritisk vigtig; Denne interferens kan være omgivende elektrisk støj fra bygningen eller kunne stamme fra målemiljøet ( f.eks. Kan natriumioner drastisk påvirke pH-aflæsninger ved pH-værdier over 10) ¹² . Desuden er nedsænkning af flere prober til en opløsning, især en stærkt ionisk og ledende saltopløsning, også en potentiel kilde til interferens. Elektroder, der måler pH (eller ionstyrke, opløst oxygen, opløst CO ₂ osv. ) Er særligt følsomme over for omgivende elektrisk støj og kan let forstyrres. Signalkonditionering, der anvendes til beskyttelse af elektrodesignalet, kan ikke garantere, at andre faktorer ikke vil forstyrre sondeaflæsningerne. Som et led i kvalitetskontrollen bør andre laboratorieudstyr, såsom en håndholdt pH-probe, et håndholdt spektrometer og et termometer, anvendes til at verificere tHan sensoraflæsninger og for at sikre at systemet er oprettet og kører korrekt.

En anden begrænsning, der skal løses, er den mulige virkning af algerne og / eller dyrkningsmiljøet på sensorerne. Hvis f.eks. Algrester eller bobler dækker lysfølerens fotodiodereceptor, vil aflæsningerne blive påvirket. På samme måde er pH-elektroder ekstremt følsomme og kræver ekstra omhu for at sikre nøjagtige aflæsninger. Disse elektroder arbejder ved at måle en spændingsforskel på tværs af et indre knudepunkt på grund af opbygningen af ​​H ⁺ ioner; Et hydratiseret bufferlag i sonden er påkrævet for at opretholde nøjagtige målinger ¹² . Afhængigt af forholdene i reaktoren vil dette lag slides af, og responsen fra sensoren kan ændre sig i løbet af eksperimentet, mens sonden er nedsænket. I foreløbige forsøg drev pH-spændingsudgangen ikke mere end ~ 0,2 pH-enheder i løbet af et 20-dages forsøg, Men yderligere vurderinger skal udføres for at karakterisere denne ændring i sensorrespons og at etablere maksimale eksperimentelle driftstider, især hvis fine pH-justeringer / kvantifikationer er nødvendige.

Mange nuværende PBR-systemer, der er bygget til at analysere algalvækst, overvåger og kontrollerer ikke internt kulturmiljø så tæt som nødvendigt for at skelne, hvordan forskellige faktorer påvirker algalvæksten, da opsætning af systemer på denne måde kan være udfordrende. Denne protokol kan hjælpe med at lette mere kontrollerede eksperimenter ved at give trinvise instruktioner til konstruktion af PBR med realtidsovervågning. Desuden kan disse levende data ikke kun bruges til bedre at kontrollere eksperimentelle forhold, men det kan potentielt udnyttes til at estimere vækstkinetik ( fx optiske densitetsmålinger som reference for generelle vækstrater).

Kontrollerede forsøgssystemer kan bidrage til at gøre algalforskningen mere reproducerbar. Bench-skala PBR sEtups, der overvåges og styres, kan øge eksperimentel effektivitet ved at minimere utilsigtede artefakter i eksperimentelt design og kan bidrage til at fremme indsatsen for at gøre algalbiobrændstoffer en bæredygtig alternativ brændstofkilde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cast acrylic sheets	McMaster Carr	8560K244	7/8'' thick, 12 x 36'', optically-clear, the size of sheets purchased will depend on reactor dimensions.
Acrylic cement	McMaster Carr	7517A4	Scigrip plastic pipe cement, #4SC nonwhitening for acrylic. Not needed if gaskets and screws are used for PBR assembly.
Acrylic cement applicator needle	McMaster Carr	75165A136	Acrylic cement applicator needle, 25 Gauge, 1", Stainless steel, PTFE lined.
Plastic dispensing bottle for acrylic cement	McMaster Carr	7544A67	Plastic dispensing bottle, 2-oz size, packs of 5.
Viscous acrylic cement	McMaster Carr	7515A11	Scigrip plastic pipe cement. Medium-bodied acrylic cement to seal in any gaps within PBR body.
PG-13.5 thread tap	McMaster Carr	2485A14	Can be used to help secure pH electrode to lid (if applicable).
PBR and lid	NCSU Precision Machine Shop	Karam Algae 3.2L Reactor Revision E	This machine shop is open to public for business. Contact shop manager.
pH sensor	Hamilton	238643	EasyFerm Plus 120, autoclavable, millivolt output.
Light sensor	Apogee Instruments	SQ-225	Amplified 0-5 volt electric calibration quantum sensor, water-proof.
Temperature sensor	LabJack	EI1034	Stainless steel, water-proof temperature sensor.
pH transmitter wire with BNC end	Sigma-Aldrich	HAM355173-1EA	This wire will vary with type of pH probe. Make sure wire is compatible with pH probe and has BNC connector end.
Unity gain pre-amplifier	Omega Engineering	PHTX-21	Signal processing amplifier for pH electrode needed for high-impedance pH readings.
Coaxial adapter, BNC female-to-binding post	Amazon	SMAKN B00NGD5K80	For connecting pH signal from pre-amplifier to microcontroller.
Capacitor (1000 uF)	Amazon	Nichicon BCBI4950	For low-pass filter.
Resistor (1000 ohm)	Radio Shack	2711321	For low-pass filter.
Hookup wire	RadioShack	2781222	For making low-pass filters, connecting sensors to microcontroller, and wiring motor.
Heat shrink tubing	RadioShack	2781611	For low-pass filter assembly.
Data acquisition and control unit	LabJack	LabJack U6	To process electrical signal from sensors and communicate with data acquisition and control software.
DAQFactory data acquisition software	DAQFactory	DAQFactory Express Release 5.87c Build: 2050	Free to download, for up to 10 channels.
Mini DC-gearmotor	McMaster Carr	6331K31	Motor for mixer impeller.
Impeller and shaft	N/A	N/A	Email authors for 3D files.
Variable DC power supply	Amazon	Tekpower HY1803D	Variable DC power supply, 0-18V @ 0-3A.
Grow Lamp	HydroGrow	SOL-1	This exact model is no longer available.
Incubator	Thermo Scientific	Precision Model 818	This particular incubator can withstand an internal heat source since this unit's cooling compressors run non-stop regardless of temperature setting.