Konstruksjon og oppsett av en Bench-skala alg fotosyntetisk bioreaktor med temperatur, lys og pH-overvåkning for kinetiske vekstprøver

Summary

Dette papiret beskriver monteringsprosessen og driften av en benkeskala fotosyntetisk bioreaktor som i kombinasjon med andre metoder kan estimere relevante kinetiske vekstparametere. Dette systemet overvåker kontinuerlig pH, lys og temperatur ved hjelp av sensorer, en datainnsamling og kontrollenhet, og åpen kildekode datainnsamling programvare.

Abstract

Den optimale utformingen og driften av fotosyntetiske bioreaktorer (PBR) for mikroalgodling er viktig for å forbedre den miljømessige og økonomiske ytelsen til mikroalgerbasert biodrivstoffproduksjon. Modeller som anslår mikroalgalvekst under forskjellige forhold kan bidra til å optimalisere PBR-design og drift. For å være effektive må vekstparametrene som brukes i disse modellene bestemmes nøyaktig. Algvekstforsøk er ofte begrenset av kulturmiljøets dynamiske natur, og styringssystemer er nødvendige for å bestemme de kinetiske parametrene nøyaktig. Det første trinnet i å sette opp et kontrollert batcheksperiment er live datainnsamling og -overvåking. Denne protokollen skisserer en prosess for montering og drift av en benkeskala fotosyntetisk bioreaktor som kan brukes til å utføre mikroalgale veksteksperimenter. Denne protokollen beskriver hvordan du måler og monterer en flatplate, benkeskala PBR fra akryl. Det beskriver også hvordan man konfigurererRe en PBR med kontinuerlig pH, lys og temperatur overvåking ved hjelp av en datainnsamling og kontrollenhet, analoge sensorer og åpen kildekode datainnsamling programvare.

Introduction

På grunn av økende bekymringer om globale klimaendringer og begrensede fossile ressurser, har regjeringer utviklet politikk for å redusere forbruket av fossilt brensel og tilskynde til utvikling av nye, bærekraftige transportbrensler. USAs miljøvernbyrå har utviklet fornybar drivstoffstandard (RFS), noe som krever at 36 av de årlige 140 milliarder gallonene av amerikansk transportbrenselsammensetning kommer fra fornybare drivstoffkilder innen 2022. Innovative og transformasjonsteknologier vil være nødvendige for å møte disse og Fremtidige standarder for fornybar energi ¹ .

Bruken av mikroalgaebaserte biodrivstoff har potensial til å bidra til å møte de nasjonale RFS, samtidig som utslippene av klimagasser reduseres ² . Mikroalgerbaserte biodrivstoff har flere fordeler sammenlignet med første generasjons biodrivstoff basert på jordbaserte matavlinger, som mais og soyabønner. I motsetning til første generasjons biodrivstoff, alger-bBiodrivstoff forbruker færre land-, vann- og matrelaterte ressurser, siden alger kan dyrkes året rundt og på ufruktbart land med saltvann eller avløpsvann. Mikroalger har høye vekstnivåer sammenlignet med jordbaserte avlinger og kan akkumulere høye nivåer av lipider, som lett kan omdannes til biodiesel ³ . For tiden eksisterer det ingen industrielle alger til biobrenselplanter på grunn av de høye kostnadene ved de energiintensive produksjonsprosessene, som består av algkultivering, lipidseparasjon og lipidraffinering i biodiesel. Mer forskning er nødvendig for å gjøre disse prosessene mer effektive og bærekraftige.

PBR, som er optisk klare, lukkede installasjoner for produksjon av fototrofiske mikroorganismer i et kunstig miljø, regnes som en av de mest lovende dyrkingsmetodene ³ . Men dagens design mangler fortsatt den volumetriske produktiviteten som er nødvendig for å gjøre produksjonen av alger til biodrivstoffEss mer effektiv og økonomisk attraktiv ⁴ . Kraftige matematiske modeller som vurderer lett irradianse og demping, transport av næringsstoffer og CO ₂ , og veksten av mikroalger kan i stor grad lette optimaliseringen av PBR-design og -operasjon. Benkeskalavekstforsøk er nødvendig for å bestemme artsspesifikke vekstparametere for disse optimaliseringsmodellene.

Kinetiske tester krever nøye overvåkning og kontroll av eksperimentelle oppsett for å forhindre utilsiktede hemmere av vekst. Med tanke på den fotosyntetiske naturen til alger ( dvs. deres forbruk av CO ₂ og absorpsjon av lys), er det spesielt vanskelig å opprettholde kontrollerte forhold i benkeskala PBR. Som vist i ligning 1 , blir mengden av oppløst CO ₂ i vekstmediet, vanligvis betegnet som ( Ligning 2 ), vil minst være aFunksjon av: 1) CO ₂ -partialtrykket og Henrys likevektskonstant, som dikterer mengden gass som vil oppløse i oppløsning ( likning 3 ); 2) Den første kjemiske sammensetningen av vekstmediet, som påvirker sammensetningen og aktiviteten av karbonationene og pH ( ligningene 4 og 5 ); Og 3) temperaturen, som påvirker ligninger 3-5 ⁵ .

De ulike fasene og kjemisk sammensetning av karbon gir en utfordring for å måle og opprettholde en konsistent oppløst karbonkonsentrasjon i en PBR whiLe holder andre forhold konstant (for eksempel øker pH ettersom alger forbruker CO ₂ , og økning av det oppløste CO ₂ -substratet kan muligens føre til et surt miljø som hemmer vekst) ⁶ .

Et ekstra lag av kompleksitet for å kontrollere tilstandene under alge-kinetiske tester involverer lysintensiteten i PBR. Den gjennomsnittlige lysintensiteten i en PBR er en funksjon av ikke bare lysintensiteten, men også designet ( f.eks. Materiale, form, dybde og blanding), absorbansen av algbiomassekomponenter (spesielt klorofyll) Spredningsegenskaper av algceller. Etter hvert som alger vokser, vil den gjennomsnittlige lysintensiteten reduseres. Denne endringen i lysintensitet, enten forårsaket av økning i totale celler og biomasse, en økning i klorofyllinnhold per celle, eller begge deler, kan til slutt forårsake en metabolsk respons, som for eksempel en økning i klorofyllproduktCtion per celle eller bruk av karbohydrat og lipid lagringsprodukter for energi ⁷ . Kontinuerlig overvåking av lysintensiteten fra reaktoren gir uvurderlig informasjon. Disse dataene kan bidra til å sikre at forholdene holder seg innenfor et spesifisert område og kan brukes til å estimere algvekst og absorbansparametere hvis de kombineres med andre målinger ( dvs. biomasse, klorofyllkonsentrasjon, reaktordybde, infalllys etc. ).

Forståelse av hvordan alger vokser under et spesifisert sett av forhold krever at pH, oppløst CO ₂ , lysintensitet og temperatur overvåkes i kinetiske eksperimenter i benkeskala. Mange algalvoksoppsett er ikke utstyrt for å overvåke forholdene i den grad det er nødvendig for kalibrering av kinetiske modeller, noe som gjør modelleringsprosessen ekstremt utfordrende ⁸ . Selv om mange selskaper tilbyr benk-skala PBRer med automatisering og kontroll, disse benk-skalaenE oppsett kan være ekstremt dyrt (~ $ 20 000) og kan ikke imøtekomme alle eksperimentelle hensyn til et gitt forskningsspørsmål.

Det første trinnet i å sette opp et kontroll-tilbakemeldingssystem for et batcheksperiment er live datainnsamling. Dette papiret tar sikte på å demonstrere hvordan man skal konstruere og sette opp en benk-PBR utstyrt med kontinuerlig lys-, pH- og temperaturovervåking. Dette overvåkingsoppsettet i sanntid kan bidra til at eksperimentelle forhold forblir innenfor de ønskede områdene, etter forskerens skjønn. Selv om denne protokollen ikke angir bestemte kontrollmekanismer, gir disse trinnvise instruksjonene et grunnleggende grunnlag for dataregistreringsrammen som kreves før mer sofistikerte kontroll tilbakemeldinger kan implementeres.

Protocol

1. Konstruer Bench-skala PBR-kroppen og lokket

MERK: Til illustrasjonsformål, Dunaliella sp. , En ~ 10 μm halotolerant mikroalga som manglet en cellevegg, ble brukt som modellorganisme for konstruksjonen av denne PBR.

1. Bestem PBR-volumet som kreves for forskningsbehovene.
   1. Bestem eksperimentelle mål for denne PBR.
   2. Bestem hvilke algemålingsanalyser, M , som er nødvendige for å karakterisere veksten av algenarter av interesse, inkludert volumet som kreves per assay, v ; Antall tekniske replikater, n ; Prøvetakingsfrekvensen, f ; Og varigheten av forsøkene, t .
      MERK: Prosjektspesifikke forskningsspørsmål, algart, og tilgjengelig utstyr dikterer algegenskapene målt, metodene som brukes for disse målingene, og hvor ofte disse målingene blir tatt. biomasse; Celle teller; Og totaltKlorofyllpigment, protein, lipid, karbohydrat og eksterne nitratkonsentrasjonsmålinger er vanlige måter å vurdere vekst på, og daglig prøvetaking over 5-14 dager er en felles tilnærming til vekstprøver ^{9 , 10} .
   3. Beregn totalt kulturvolum, V _s , som kreves for prøvetaking gjennom ett eksperiment ved bruk av ligning 6 .
      
   4. Bruk ligning 7 til å estimere et mål PBR-volum, _Vp , ved bruk av V _s fra trinn 1.1.3 og en maksimal fjerningsfraksjon fraksjon, F.
      
      MERK: Fjernelse av mindre enn en forhåndsdefinert brøkdel av total kulturvolum ( f.eks. ~ 20%) kan bidra til å sikre at forholdene i PBR dvs. (blandekraft, lysfordeling, etc. ) ikke drasticaLly varierer i løpet av forsøket når kulturvolumet fjernes.
      1. Forutsatt et 10-dagers eksperiment hvor biomasse; Celle teller; Og total klorofyll, protein, lipid, karbohydrat og nitratkonsentrasjoner måles daglig i tre eksemplarer, bruk et totalt prøvetakevolum på ~ 600 ml. Hvis det ikke er sikte på å fjerne ikke mer enn 18,75% av det totale kultivolumet, skal det brukes et totalt arbeidereaktorvolum på minst 3,2 L.
2. Velg sensorer og tilbehør for PBR-eksperimentene.
   1. Velg pH, lys og temperaturprober som skal brukes til kontinuerlig overvåking.
      MERK: Sensorer skal være kompatible med datainnsamlingsenheten og skal tåle interne kulturtilstander ( dvs. pH-område, lys, varme, algavfall, salt, etc. ). Rustfritt stål og salttolerante prober ble valgt her siden Dunaliella sp. Er marine mikroalger.
   2. Velg et hjulhjuldesign og motor for å tilfredsstille exPerimental blanding krav.
      MERK: For eksempel er et lavskjær, aksialhjuler et godt valg for Dunaliella- alger, da de mangler en cellevegg og enkelt kan skjære ¹¹ . Disse alger har flagellar-bevegelse og trenger ikke intens blanding ¹¹ . Lav blandingshastighet kan oppnås ved hjelp av en 12 V mini-girmotor. Hjulet og akselen kan 3D-skrives ut (3D-utskriftsinformasjon finnes i materiallisten).
3. Monter PBR-kroppen og lokket.
   1. Bestem reaktorens dimensjoner, basert på volumberegningene i trinn 1.1, med tanke på eksperimentelle mål og potensielle begrensninger ( f.eks. Plass).
      MERK: En PBR-konstruksjon med et lavere forhold mellom volum og volum er foretrukket, da denne formen minimerer lysdempning i hele PBR, noe som gir en mer konsistent lysfordeling gjennom eksperimentet.
   2. Klipp fem stykker optisk klart støptAkrylplater (~ 0,25-0,5 i tykk) ved hjelp av en bordsag, i henhold til PBR-design og -størrelse etablert i trinn 1.3.1.
   3. Sørg for at skjøtene er glatt, men ikke avrundet, med 200 til 400 sandpapir.
   4. Fest kantene på akrylstykkene sammen med tape og / eller klemmer.
      MERK: Akryl sement er ikke lim. Hvis akrylbindingens overflater er grove eller akrylbitene ikke er jevnt justert, vil denne bindingssementen ikke være effektiv.
   5. På et godt ventilert område, bruk akryl sement langs leddene ved hjelp av en nåle dispenser. Plastflatene vil straks feste seg sammen. La bitene sitte i 24 timer.
      ADVARSEL: En maske og hansker skal brukes for å unngå innånding og hudeksponering ved bruk av akryl sement.
   6. Påfør viskøs akryl sement på leddene for å sikre at PBR er vanntett. La sementen tørke i 24-48 timer, i henhold til sementinstruksjonene; Tørketider kan variere.
   7. Fyll påReaktor med vann for å sjekke for synlige lekkasjer. Hvis det ikke er noen lekkasjer, sett reaktoren på papirhåndklær og kontroller for tegn på lekkasje etter 24-36 timer.
      MERK: Akrylplater ikke mindre enn ~ 0,5 i tykk skal brukes til å montere PBR som holder mer enn ~ 2 L; Tynnere ark kan bøye seg under vanntrykk og forårsake lekkasjer. Pakninger og re-enforcing skruer kan brukes som et mer robust alternativ til akryl sement ( Figur 1 ). Denne typen montering krever presisjonsmaskiner og må gjøres ekstremt nøye, da akryl lett kan sprekke.
   8. Bruk en maskinbutikk for å designe PBR-lokket, med porter for å imøtekomme sensorer og andre PBR-tilbehør og behov ( dvs. pumpehjul, gassledninger, prøvetakingsporter, etc. ). Pass på at de interne komponentene ikke forstyrrer hverandre.
      MERK: PBR- og PBR-lokkekonfigurasjonen / -designet vil avhenge av reaktortilbehør og eksperimentelle mål. Se figur 1For et eksempel på en PBR-reaktor og lokkdesign (ytterligere detaljer finner du i materialeseksjonen). Denne PBR-designen vil bli referert for resten av protokollen.

Figur 1: Bilde av den tilpassede Bench-skala PBR-oppsett med sensorer og en mikser. Dette oppsettet viser en mikser, en elektrode festet til lokket gjennom en gjenget port i lokket, og en lyssensor festet til et spesialdesignet deksel. Dette lokkesignalet inkluderer også vedlegg av en 12 V DC mini-girmotor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Konfigurer og konfigurer sensorer med datainnsamlings- og kontrollenheten

MERK: Sensorer oversetter endringer iDen fysiske verden inn i et målbart analogt signal, ofte spenning. Datainnsamlingsenheter tjener som et grensesnitt mellom den digitale og fysiske verden og kan brukes til å lese disse analoge signalene og konvertere dem til diskrete verdier, som instruert av en datamaskin. Datainnsamlingsenheten beskrevet her har en analog inngangsoppløsning på 16 bits, kan lese opptil 14 analoge signaler (± 10 V) og kan levere strømmen som kreves av enkelte sensorer (opptil 5 V). Disse instruksjonene gir en oversikt over hvordan du konfigurerer denne datainnsamlingen og kontrollenheten for å konvertere et analogt signal til mer meningsfulle verdier for lys, pH og temperatur i en PBR. Disse instruksjonene beskriver ikke viktige begreper ( dvs. kvantisering, presisjon, responstid, etc. ) som trengs for å tolke disse målte verdier fullt ut og å kvantifisere usikkerhet.

Figur 2: Tilkoblingsdiagram for sensor til datainnsamling og kontrollenhet. Dette diagrammet viser hvordan du konfigurerer pH-, lys- og temperatursensorer til datainnsamlingen og kontrollenheten som brukes til denne protokollen. Signalbehandlingskomponenter for pH- og lyssensoren er vist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

1. Sett opp og konfigurer lyssensoren med datainnsamlingen og kontrollenheten ved hjelp av et lavpassfilter.
   MERK: Se figur 2 for generelle referansediagrammer. Produsentens sensorspesifikasjoner indikerer forskjellen mellom signal, strøm og jordledninger basert på farge. Et lavpasfilter er en enkel krets som bruker en motstand og kondensator til å filtrere ut uønsket lyd fra elektriske signaler. Denne typen filter demper elektriske signaler med frekvenser høyere thaN avskjæringsfrekvensen som bestemt av motstanden og kapasitansen. Dette filteret bidrar til å fjerne eller glatte elektrisk støy fra sensorsignalet.
   1. Ved hjelp av wire strippere, kutte en ~ 2 tommers grønn kontaktledning; Stripe 0,25 i isolasjon fra den ene enden og ~ 0,5 inn fra den andre enden av begge deler.
   2. Identifiser den analoge signalutgangstråden på lyssensoren. Forsikre deg om at minst ~ 0,25-0,50 tommer metalltråd er utsatt forbi ledningsisoleringen.
   3. Vri forsiktig ett ben på 1000 Ω motstanden rundt den 0,5-tommers strippede enden av kontaktledningen. Vik det andre benet av motstanden rundt den eksponerte delen av lyssensorens analoge signalledning.
   4. Bruk et loddejern og blyfri loddetinn for å lodde motstandsbenene til ledningen. La loddet avkjøles i 2-5 minutter.
      ADVARSEL: Loddemålerne blir veldig varme og kan være svært farlige hvis brukerne ikke er riktig opplært. Instruktjonsvideoer finner du online. Sikkerhetsbriller og andre forholdsregler er ekstremt viktige. Ledninger skal ikke kobles til strømforsyning eller andre enheter under denne prosessen.
   5. Skyv en 1,5 tommers varmekrympeslange over en ende av skjøteledningen og skyv stykket til den dekker loddetråd og motstand. Pass på at alle metallstykker er fullt dekket.
   6. Varmekrymp med en varmepistol. Pass på at slangen brytes tett rundt motstand og ledninger; Ingen ledig ledning bør utsettes.
   7. Fest jordens ledning av lyssensoren til en fri jord (GND) terminal på datainnsamlingen og kontrollenheten ved hjelp av en skrutrekker.
   8. Fest den frie enden av signalkontaktledningen til en gratis analog inngangs (AIN) terminal ved hjelp av en skrutrekker.
   9. Sikre den positive ledningen til 1000 μF kondensatoren ( dvs. lengre ben) til samme AIN-terminal som i trinn 2.1.8 og den negative ledningen ( dvs. kortere ben) til samme GND-terminal som i trinn 2.1.7.Pass på at både kondensatorbenet og ledningen er ordentlig tilkoblet terminalen.
   10. Identifiser strøminngangstråden for lyssensoren og fest denne ledningen til en spenningsforsyning (VS) på datainnsamlingen og kontrollenheten.
2. Sett opp og konfigurer pH-elektroden med datainnsamlingsenheten ved hjelp av enhetsforsterker og lavpassfilter.
   MERK: På grunn av arten av pH-målinger ( dvs. høy impedans og lav spenning), er det ofte nødvendig med en forsterkningsbuffer med en forsterkning mellom pH-proben og datainnsamlingsanordningen. Et lavpasfilter er også gunstig for måling av pH, for å beskytte signalet fra omgivende elektrisk støy.
   1. Koble enhetforsterkerforsterkeren til pH-proben ved hjelp av senderledningen.
   2. Koble den koaksiale adapteren, med positive og negative portterminaler, til den andre enden av enhedsforsterkeren.
   3. Klipp to 6-i stykker grønn og en ~ 12 tommers piecE av svart kontaktledning ved hjelp av wire strippere. Strip ~ 0,25 tommer isolasjon av begge ender av den svarte konnektortråd.
   4. Strip ~ 0,25 tommer og ~ 0,5 tommer isolasjon av endene av de grønne kontaktleddene ved hjelp av wire strippere.
   5. Vri forsiktig et ben på 1000 Ω motstanden rundt den 0,5-tommers strippede delen av en grønn kontaktledning. Wrap den andre motstanden benet rundt ~ 0,5 tommers strippet delen av den andre grønne kontaktledningen.
   6. Bruk et loddejern og blyfri loddetinn for å lodde motstandsbenene til ledningen. La loddet avkjøles i 2-5 minutter.
   7. Skyv en 1,5 tommers varmekrympeslange over en ende av skjøteledningen og skyv stykket til den dekker loddetråd og motstand. Pass på at alle metallstykker er fullt dekket.
   8. Varmekrymp med en varmepistol. Forsikre deg om at plastet brytes tett rundt motstanden og ledningene; Ingen ledig ledning bør utsettes.
   9. Sikre den ene enden av den svarte cOnnector wire til den negative (svarte) terminalen på koaksialadapteren. Sett den andre enden av denne ledningen inn i en GND-terminal på datainnsamlingen og kontrollenheten og fest den med en skrutrekker.
   10. Fest den ene enden av den grønne forbindelsestråden (med motstanden i serie) til den positive (røde) klemmeposten på koaksialadapteren. Sett den andre enden av denne skjøteledningen inn i en fri AIN-terminal på datainnsamlingen og kontrollenheten.
   11. Identifiser den positive ledningen til 1000 μF kondensatoren ( dvs. lengre ben) og sikre denne ledningen til samme AIN-terminal som i trinn 2.2.9; Sørg for at både kondensatorbenet og signalledningen er ordentlig tilkoblet terminalen.
   12. Sikre den negative ledningen til 1000 μF kondensatoren ( dvs. det kortere benet) til samme GND-terminal som i trinn 2.2.8.
3. Koble temperaturføleren til datainnsamlingen og kontrollenheten ved å koble signalet, bakken og strømmen wIres av sonden for å frigjøre AIN, GND og VS terminaler.

3. Konfigurer opplasting av levende data og eksperimentell fil

MERK: Dataoppkjøps- og kontrollprogramvaren beskrevet her kommuniserer med datainnsamlingen og kontrollenheten for å overvåke og logg sensordata ved brukerdefinerte tidsintervaller. Instruksjonene nedenfor forklarer hvordan du konfigurerer en kontrollfil i denne programvaren for å overvåke og registrere pH, temperatur og lys. Disse instruksjonene er spesifikke for programvaren og datainnsamlingen og kontrollenheten som er oppført i materialet. Ytterligere instruksjoner finner du i produktbrukerhåndbøker.

1. Koble datainnsamlingen og kontrollenheten til en datamaskin i nærheten av eksperimentell oppsett ved hjelp av en USB-kabel og last ned alle nødvendige drivere.
2. Last ned og åpne datainnsamlings- og kontrollprogramvaren.
3. Konfigurer "Konverteringer" for hver sensor i programvaren.
   MERK: For å konvertere den fysiske voltAlderssignal til en meningsfull verdi, må noen konverteringsfaktor, etablert ved kalibrering, brukes. Mange sensorer kommer med fabrikkkalibreringsfaktorer som finnes i produktspesifikke spesifikasjonsark. Konverteringsligninger er spesifikke for oppsettet og sensorene. Mange konverteringsligningsparametere, spesielt de for elektroder, må oppdateres jevnlig via kalibrering. Livstiden til en sensor og kalibreringsfrekvens vil avhenge av produktspesifikke spesifikasjoner og arbeidsmiljø.
   MERK: Brukere bør lese og forstå disse spesifikasjonene i sin helhet. Tabell 1 viser konverteringer for sensorer funnet i materialelisten. Et eksempel på omregning for temperaturproben er vist nedenfor.
   1. Naviger til "Konverteringer" i programvaren, på høyre side av hovedsiden.
   2. Legg til et konverteringsnavn, for eksempel, "volts_to_celsius" og skriv inn konverteringsligningen: (55,56 x verdi) + 255,37 - 273.15.

Kanalnavn	Konverteringsnavn	ligningen	Merknader
Temperatur	volts_to_celsius	(55,56 x verdi) + 255,37 - 273,15	Produsentens konverteringsligning for å konvertere volt til celsius.
Lett	volts_to_PPFD	Verdi x 500	Produsentens konverteringsfaktor for å konvertere volt til fotosyntetisk fotonfluxdensitet (μmol m -2 s -1 ), produsent LED-korreksjon ikke påført.
pH-	volts_to_pH	(-17,05 x verdi) + 6,93	Kalibreringsavhengig konverteringsligning (Figur 4b) for å konvertere pH-elektrodespenningsavlesninger til pH-verdier. Bare bruk konvertering til pH-kanal aFter kalibrering.

Tabell 1: Konverteringstabell for kanal for dataoppkjøpsfilen. Eksempler på hvordan du kan legge inn kanal- og konverteringsinformasjon for sensorene i datainnsamlingsprogramvaren.

4. Sett opp passende kanaler for hver sensor i programvaren for å skaffe sensordata.
   MERK: Hver sensor trenger sin egen analog-til-digitale kanal i programvaren og en angitt analog inngangsterminal i datainnsamlingen og kontrollenheten.
   1. Naviger til "Kanal" siden i programvaren.
   2. Legg til et sensorkanalnavn. Ingen mellomrom er tillatt.
   3. Velg riktig enhet for å samle inn data for den tilsvarende kanalen; Denne enheten vil korrespondere med datainnsamlingsenheten.
   4. Skriv inn enhetsnummeret som brukes til å referere til datainnsamlingen og kontrollenheten eller annetData-innhentende enhet; Hvis bare en enhet brukes, er standardnummeret ofte null.
   5. Velg analog-til-digital, "A til D", for inngangsutgangstypen ("I / O Type") og skriv inn kanalnummeret som tilsvarer AIN-terminalnummeret på datainnsamlingen og kontrollenheten
   6. Skriv inn ønsket prøvetaking "Timing" (s); Denne verdien indikerer hvor ofte sensorsignalet vil bli lest. Input 1.0 for å få en lesing hver 1 s. Til gjennomsnittlige data i løpet av 1 min. Intervaller før logging, sjekk "Avg" -boksen og angi 60 for gjennomsnittlig lengde.
   7. Velg riktig konvertering fra rullegardinmenyen, hvis det er aktuelt (se trinn 3.3 for å generere konverteringer); Ellers vil alle kanaldata bli vist / registrert som spenning.
5. Sett opp "Logging Set" for å logge eksperimentelle data.
   1. Naviger til "Logging Panel" i programvare arbeidsområdet, legg til enEw logging sett, og navngir settet tilsvarende. Velg utdatafiltype og -sted; ASCII-filtypen vil gi en kommaseparert verdifil hvis utvidelsen '.csv' er spesifisert i utdatafilnavn.
   2. Legg til alle ønskede kanaler for å logge på dette settet.
   3. Start og stopp logging som ønsket ved å høyreklikke på loggingssekvensen i arbeidsområdet og velg det aktuelle alternativet.
      MERK: Ikke prøv å få tilgang til filen når du logger på data aktivt. Denne handlingen kan forstyrre loggingsprosessen. Filplasseringen for kontinuerlig loggede filer skal ikke lagres / skrives i en skyskatalog.
6. Sett opp "Side" for å vise dataene og grafer.
   1. Naviger til "Sider" -skjermen i programvaren. Klikk på en av standardblanke sider.
   2. For å vise en sensorutgang som leses numerisk på siden, legger du til en "Variabel verdi" -skjerm til siden.
      1. RigHt-klikk hvor som helst innenfor blank side, velg "Skjermer", og klikk alternativet "Variabel verdi"; En liten boks vises på skjermen.
      2. Høyreklikk på denne nyopprettede boksen og velg "Egenskaper". Skriv inn bildeteksten (f.eks. "Temperatur i reaktor"), kanalreferansen (f.eks. "Temperatur [0]") og tilhørende enheter (f.eks. "Celsius"). Klikk "OK" og gå tilbake til skjermsiden.
   3. For å vise sensordata grafisk og i sanntid, legg til en 2D-graf på skjermsiden.
      1. Høyreklikk hvor som helst innenfor blank side og velg "Grafer" og deretter "2-D grafer;" En liten tomt vises på skjermen.
      2. Høyreklikk på den nylig opprettede grafen og velg "Egenskaper". I feltet "Traces" skriver du inn ønsket sensorkanalnavn (f.eks. "Temperatur") i boksen for "Y Expression:" og sørg for at "Time" er skrevetN i boksen for "X Expression :." Klikk "OK" og gå tilbake til skjermsiden.

4. Kalibrere pH-proben

MERK: pH-kalibrering skal gjøres før hvert forsøk, ved den tiltenkte temperaturen i eksperimentet, og pH- kanalomregningene skal oppdateres tilsvarende. PH-elektrodeavlesninger kan drifte under eksperimenter; For å bestemme omfanget av denne driften, gjenta kalibreringsprosessen etter å ha kjørt det eksperimentelle oppsettet og sammenlign lesingene. PH-elektroder skal lagres riktig i riktig oppbevaringsløsning før og etter forsøk, som produsentens anvisninger.

1. Koble pH- og temperatursensorene, som beskrevet i trinn 2.
2. Sett inn både pH-elektroden og temperaturproben i pH-kalibreringsbuffer 7.
3. Kontroller det grafiske displayet for å sikre at temperaturavlesningen til sonden er i ønsket temperaturFor å kjøre eksperimenter (trinn 3.6.2.2).
4. La pH-elektrodespenningsutgangen stabilisere seg ( dvs. spenningsavlesningene endres ikke lenger i en retning). Bruk en grafisk skjerm for å bekrefte stabilisering.
5. Log både temperatur og pH-elektriske data til en fil (trinn 3.5) i 30-60 s. Under denne prosessen bør pH-kanalen ikke ha noen konverteringer påført eller inkludere noen gjennomsnitt.
   Merk: Siden pH-elektroder er følsomme for elektrisk støy, kan en lavere oppkjøpstidspunkt (dvs. raskere prøvetaking) for pH-kanalen være å foretrekke ( f.eks . Timing = 0,1 s). Husk, en lavere timing vil kreve flere beregningsmessige ressurser.
6. Gjenta kalibreringen for buffere 4 og 10. Bekreft at responsen til sensoren er mellom -57 og -59 mV / pH ( figur 3a ).
7. Generer en konverteringsligning ved å plotte pH-bufferverdien versus spenning og montering av en linje ( figur 3b >). Oppdater konverteringsligningen som beskrevet i trinn 3.3.
8. Bruk denne konverteringen til pH-kanalen og oppdater kanalinnstillingene for å inkludere gjennomsnitt som ønsket for logging.

5. Sett opp PBR for algaleksperimentet

MERK: Trinnene nedenfor er spesifikke for Dunaliella og den skreddersydde PBR vist i Figur 1 . Videre er disse oppsettinstruksjonene ikke i samsvar med sterile protokoller, da dette systemet ikke var utformet på en slik måte.

1. Forbered algene inokulum og vekstmedium, etter behov for forsøket og eksperimentelle mål.
2. Koble pH- og temperaturkablene til datainnsamlingen og kontrollenheten, som beskrevet i trinn 2.2-2.3.
3. Kalibrere og oppdatere konverteringsligningen for pH- kanalen, som beskrevet i trinnene 3.3 og 4.

Igimg "src =" / files / ftp_upload / 55545 / 55545fig4.jpg "/>
Figur 4: Ledningsdiagram for blanderen. Dette diagrammet viser hvordan du setter opp en blandingsenhet for en PBR ved hjelp av en mini-girmotor, en strømforsyning og en 3D-trykt pumpehjul og aksel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Sett opp PBR i en temperaturstyrt inkubator med tilbehør og sensorer. Se figur 4 for visualisering.
   1. Sett lysføleren inn i PBR ved å trille lysfølerledningen gjennom lokkporten, og monter sensorhodet på lokkfesteholderen med den medfølgende skruen. Bruk en gummipropp eller grommet for å holde denne porten lukket for atmosfæren.
   2. Fest og fest mikserhjulet til PBR-lokket ved å plassere pumpeakselakselen over DC-minisjonsmotorenAksel inne i PBR lokket; Sikre akselen med en skrue og en unbrakonøkkel.
   3. Legg til algespesifikt vekstmedium, plasser lokket og fest lokket med skruer. Plasser PBR inne i inkubatoren (sett til 25 ° C eller ønsket temperatur).
   4. Sett temperaturføleren inn i den utpekte porten og fest den inn i porten med en gummipropp.
   5. Sikre pH-sonden inn i reaktorlokkporten ved hjelp av en PG-13.5 gjenget montering.
   6. Koble lyssensorledningene til datainnsamlingsenheten, som beskrevet i trinn 2.1.
5. Koble blanderhjulet til ønsket hastighet.
   1. Sett opp den variable DC strømforsyningen ved siden av oppsettet. Slå på strømforsyningen og juster spenningsknappen til spenningsverdien leser 0 volt. Slå av strømforsyningen.
   2. Koble pumpehjulets motorledninger til de positive og negative utgangsklemmene til variabel strømforsyning ( Figur 5 ADVARSEL: Koble aldri til eller rør direkte ledninger eller kretser. Pass på at alle strømforsyningene er slått av før du kobler til noen ledninger. Les alltid produsentens instruksjoner / spesifikasjoner for å sikre kompatibilitet mellom motor, strømforsyning og ledninger.
   3. Slå på strømforsyningen og øk spenningen langsomt ved å dreie spenningsknappen til ønsket mengdehastighet er nådd; Beregne blandingshastigheten ved å måle rotasjonene per minutt.

Figur 5: Reaktoreksperimentell oppsettdiagram. Visualisering av et PBR eksperimentelt oppsett i en temperaturstyrt inkubator. Dette oppsettet inkluderer en vokslampe og en PBR, med sensorer og en blander sikret i PBR-lokket. Vennligst klikk her tilSe en større versjon av denne figuren.

6. Sett opp vokslampen for å belyse PBR.
   MERK: En høydrevet, LED-vekslelampe som utsender i det blå og det røde spekteret ble valgt for å oppnå de fotosyntetiske lysintensitetsnivåene som kreves for denne Dunaliella- spesifikke undersøkelsen. Størrelsen og formen til lysarmaturen bør velges slik at lyset lyser jevnt på PBRs innfallsoverflate. Kontroller at inkubatoren kan håndtere en intern varmekilde. Hvis du ikke gjør det, kan du forkorte inkubatorens levetid og / eller forårsake skade eller overdreven oppvarming i inkubatoren.
   1. Senter voksenlampen langs forsiden av PBR. Pass på at lysbanen er rettet mot lysføleren montert på baksiden av reaktoren.
   2. Slå på lyset og juster lysintensiteten etter behov ved å flytte vekselampen direkte mot eller vekk fra reaktoren. Kontroller sensorvariabelen for lysavlesninger.
7. Overvåk og logg sensordataene i 6 - 24 timer for å sikre at lys, temperatur og pH-avlesning innenfor PBR er stabile og innenfor det ønskede området. Juster etter behov.
   MERK: Elektrisk støy kan ofte observeres ved hoppende, ustabile avlesninger og / eller bråtteverdi i verdier uten tilsynelatende endringer i PBR-miljøet.
8. Ta av gummiproppen på prøveuttaket for å legge til algeninokulum via overføringspipetten.
9. Fjern prøvene og kontroller betingelsene for å sikre at de holder seg innenfor det ønskede området for eksperimentet.
   1. Fjern kulturer for analyse etter behov fra prøveuttaket ved hjelp av en pipette.
      MERK: Prøvens volum, frekvens og varighet av eksperimentet vil avhenge av trinn 1.1.2.
   2. Overvåk vanntemperaturen i PBR ved å kontrollere dataskjermen i programvaren og justere innstillingspunktet for inkubatortemperaturen manuelt for å holde vannet tempeRatur konstant.
      MERK: Denne justeringen vil avhenge av instruksjonene for inkubatorprodusenten.
   3. Overvåk og juster pH i PBR, som ønsket, for å sikre at pH forblir innenfor det forventede området for forsøkene.
      MERK: Her ble pH styrt med en 12 V magnetventil (normalt lukket) i tråd med en komprimert CO2-tank (99,99%). Ventilen ble åpnet etter behov ved hjelp av kontrollfunksjonaliteten til datainnsamlingen og kontrollenheten og programvaren. Dette oppsettet krever et tilbehørskort og DC-moduler, og ble implementert ved hjelp av tilpasset dataprogrammering skreddersydd for bestemte forskningsmål.

Representative Results

Data fra dette sanntids overvåkingssystemet viser det dynamiske kulturmiljøet for alger i en PBR-benk og markerer behovet for å overvåke og kontrollere systemet. De loggede temperaturdataene ( Figur 6 ) viser hvordan lysbelysning, inkubatorlufttemperatur og energidissipasjon assosiert med algvekst kan endre temperaturen i PBR og hvordan sanntidsdataene kan brukes til å justere inkubatortemperaturkontrollene etter behov.

Det målte lyset i løpet av forsøket understreker ytterligere den dynamiske naturen til dette voksende miljøet. Som observert i figur 7 var lyssensoravlesningen, målt som fotosyntetisk fotonfluxdensitet (PPFD; μE-m ^-2 s ^-1 ), ~ 100 PPFD før alger ble tilsatt og droppet umiddelbart til 85 PPFD avTer inokulere reaktoren med algenkulturen. Lyset fortsatte å falle til mindre enn 5 PPFD på dag 7. Denne reduksjonen i lysintensitet skyldes økende biomasse og celletall, og / eller økt absorpsjon ved økt klorofyllinnhold, som viser at alger er aktive gjennom dag 7, til tross for lavt Lysnivåer. Ytterligere biologiske målinger kreves for å gjøre ytterligere avledninger.

De kontinuerlig loggede pH-dataene viser at totalt sett ble pH-kontrollen tilstrekkelig styrt under dette eksperimentet med den implementerte pH-kontrollalgoritmen ( figur 8 ). Disse dataene, som viser både minutt-for-minutt-avlesninger og timelange gjennomsnitt, viser noen få viktige punkter om dyrkning av alger og overvåking av pH i sanntid. For det første økte pH over det ønskede settpunktet på 7,6 umiddelbart etter inokulering av PBR med alger. Denne forandringen var forventet, da kulturfrøet som ble tilsatt PBR, hadde apH verdier høyere enn settpunktet, da kolben som ble brukt til å dyrke inokulumet, ikke var pH-kontrollert. For det andre fremhever disse levende data hvordan følsomme pH-elektroder er til ekstern elektrisk støy. Denne følsomheten er registrert ved et drastisk hopp i elektrodverdiene mellom dag 1 og dag 2. Disse plutselige endringene i pH-verdiene ble sannsynligvis skapt av elektrisk støy fra en magnetventil fra et tilstøtende eksperimentelt oppsett. Denne elektriske forstyrrelsen utløste for tidlig pH-kontrollalgoritmen for å injisere CO ₂ i PBR. Følgelig falt pH-verdien under ønsket settpunkt. Sensibiliteten til pH-elektrodene kan føre til ekstreme utelukkere og kan potensielt forstyrre kontrollsystemer.

Figur 3: pH-respons og kalibreringseksempelgrafer. ( A ) Eksempel respons graf av thE pH-sensor ( b ) Eksempel kalibreringsgraf på pH-sensoren, med en ligning som skal brukes til konvertering. Regresjonsanalyse viser et 95% konfidensintervall. Feilbarer er ikke synlige (standard feil mindre enn 0,03%). Disse grafene viser at pH-sensorene var riktig tilkoblet og at signalet var veldig stabilt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Temperaturmålinger innenfor PBR Under et 7-dagers eksperiment. Mørkeblå punkter representerer 1-h gjennomsnitt av sensordata, og lyseblå punkter representerer sensoravlesninger som er anskaffet i løpet av 1 min (oppkjøpstidspunkt på 1 s, gjennomsnittlig lengde på 60) og omgjort til temperatur ved å bruke produsent-leverte konverteringsfaktorer. Svart piler sho W når inkubatortemperaturinnstillingen ble justert for å opprettholde kulturtemperaturen rundt 25 ° C (dette ønskede settpunktet er betegnet med rød, prikket linje). Temperaturvariationer skyldes algvekst og endringer i inkubatortemperaturen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Lysmålinger Innenfor PBR I løpet av et 7-dagers eksperiment. Mørkblå punkter representerer 1 h gjennomsnitt av sensordata, og lyseblå punkter representerer sensoravlesninger over 1 minutt (oppkjøpstidspunkt på 1 s, gjennomsnittlig lengde på 60) og omgjort til PPFD ved bruk av standardkalibreringsverdier for fabrikken."> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8: pH-målinger innenfor PBR i løpet av et 7-dagers eksperiment. Mørkblå punkter representerer 1-h gjennomsnitt av sensordata, og lyseblå punkter representerer sensoravlesninger logget hver 1 min (oppkjøpstidspunkt på 0,1 s, gjennomsnittlig lengde på 600) og omgjort til pH ved hjelp av konverteringsligning etablert ved kalibrering. PH ble holdt mellom 7,6 og 7,5 ved bruk av en 99% CO2-injeksjon. De røde, stiplede linjene angir ønsket pH-område. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Dette PBR-systemet tilbyr muligheten til å overvåke og kontrollere benkalibrering av alge kinetiske veksteksperimenter, slik at flere repeterbare resultater fra eksperimentelle analyser brukes til å kvantifisere vekst. Imidlertid er forståelse av begrensningene og usikkerhetene til sensormålinger avgjørende for at sensoravlesningene nøyaktig reflekterer reaktorbetingelsene. Denne forståelsen inkluderer grunnleggende kunnskap om måleprinsippene involvert med sensorer, prosess og frekvens av kalibrering, måleusikkerheten og hva sensoren kan og ikke kan måle. For eksempel er den elektriske responsen for lyssensoren som er beskrevet her, ikke like fordelt over det synlige spektrumområdet, og det kan være nødvendig med visse korreksjonsfaktorer på sensorutgangen, avhengig av hvordan denne sensordata vil bli analysert.

Temperaturnivåer og variasjoner er også ekstremt viktige, da endringer i temperaturen kan drastisk innFluenserer sensorenes respons. Det er også kritisk viktig å forstå potensielle forstyrrelser som kan påvirke sensoravlesningene. Denne forstyrrelsen kan være omgivende elektrisk støy fra bygningen eller kunne stige fra målemiljøet (for eksempel kan natriumioner drastisk påvirke pH-målinger ved pH-verdier over 10) ¹² . Videre er det også en potensiell forstyrrelseskilde å nedsenke flere prober i en løsning, særlig en høyt ionisk og ledende saltløsning. Elektroder som måler pH (eller ionstyrke, oppløst oksygen, oppløst CO ₂ , etc. ) er spesielt følsomme for omgivende elektrisk støy og kan lett forstyrres. Signalkondisjonering som brukes til å beskytte elektrodesignalet, kan ikke garantere at andre faktorer ikke vil forstyrre sondeavlesningene. Som et ledd i kvalitetskontroll, bør annet laboratorieutstyr, som en håndholdt pH-probe, et håndholdt spektrometer og et termometer, brukes til å verifisere tHan sensoravlesninger og for å sikre at systemet er satt opp og kjører riktig.

En annen begrensning som må tas opp er den mulige effekten av alger og / eller dyrkningsmiljø på sensorene. For eksempel, hvis algrester eller bobler dekker fotodiode-reseptoren til lyssensoren, vil lesingene bli påvirket. På samme måte er pH-elektroder ekstremt følsomme og krever ekstra forsiktighet for å sikre nøyaktige avlesninger. Disse elektrodene arbeider ved å måle en spenningsforskjell over et indre veikryss på grunn av oppbygging av H ⁺ -ioner; Et hydratisert bufferlag i sonden er nødvendig for å opprettholde nøyaktige målinger ¹² . Avhengig av forholdene i reaktoren vil dette laget slites av, og responsen til sensoren kan endres i løpet av forsøket mens sonden er nedsenket. I foreløpige tester drev pH-spenningsutgangen ikke mer enn ~ 0,2 pH-enheter i løpet av et 20-dagers eksperiment, Men ytterligere vurderinger bør utføres for å karakterisere denne endringen i sensorrespons og å etablere maksimale eksperimentelle løpstider, spesielt hvis det er behov for fine pH-justeringer / kvantifikasjoner.

Mange nåværende PBR-systemer som er bygget for å analysere algvekst, overvåker ikke og kontrollerer det interne kulturmiljøet så tett som nødvendig for å skille mellom hvordan ulike faktorer påvirker algveksten, siden oppsett av systemer på denne måten kan være utfordrende. Denne protokollen kan bidra til å lette mer kontrollerte eksperimenter ved å gi trinnvise instruksjoner for å bygge en PBR med sanntidsovervåkning. Videre kan disse levende dataene ikke bare brukes til bedre å kontrollere eksperimentelle forhold, men det kan potensielt benyttes til å estimere vekstkinetikk ( f.eks. Optiske tetthetsmålinger som referanse for generelle veksthastigheter).

Kontrollerte eksperimentelle systemer kan bidra til å gjøre algerforskningen mer reproducerbar. Bench-skala PBR sEtups som overvåkes og kontrolleres, kan øke eksperimentell effektivitet ved å minimere utilsiktede gjenstander i eksperimentell design og kan bidra til å fremme innsats for å gjøre biodrivstoffene til en bærekraftig, alternativ drivstoffkilde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cast acrylic sheets	McMaster Carr	8560K244	7/8'' thick, 12 x 36'', optically-clear, the size of sheets purchased will depend on reactor dimensions.
Acrylic cement	McMaster Carr	7517A4	Scigrip plastic pipe cement, #4SC nonwhitening for acrylic. Not needed if gaskets and screws are used for PBR assembly.
Acrylic cement applicator needle	McMaster Carr	75165A136	Acrylic cement applicator needle, 25 Gauge, 1", Stainless steel, PTFE lined.
Plastic dispensing bottle for acrylic cement	McMaster Carr	7544A67	Plastic dispensing bottle, 2-oz size, packs of 5.
Viscous acrylic cement	McMaster Carr	7515A11	Scigrip plastic pipe cement. Medium-bodied acrylic cement to seal in any gaps within PBR body.
PG-13.5 thread tap	McMaster Carr	2485A14	Can be used to help secure pH electrode to lid (if applicable).
PBR and lid	NCSU Precision Machine Shop	Karam Algae 3.2L Reactor Revision E	This machine shop is open to public for business. Contact shop manager.
pH sensor	Hamilton	238643	EasyFerm Plus 120, autoclavable, millivolt output.
Light sensor	Apogee Instruments	SQ-225	Amplified 0-5 volt electric calibration quantum sensor, water-proof.
Temperature sensor	LabJack	EI1034	Stainless steel, water-proof temperature sensor.
pH transmitter wire with BNC end	Sigma-Aldrich	HAM355173-1EA	This wire will vary with type of pH probe. Make sure wire is compatible with pH probe and has BNC connector end.
Unity gain pre-amplifier	Omega Engineering	PHTX-21	Signal processing amplifier for pH electrode needed for high-impedance pH readings.
Coaxial adapter, BNC female-to-binding post	Amazon	SMAKN B00NGD5K80	For connecting pH signal from pre-amplifier to microcontroller.
Capacitor (1000 uF)	Amazon	Nichicon BCBI4950	For low-pass filter.
Resistor (1000 ohm)	Radio Shack	2711321	For low-pass filter.
Hookup wire	RadioShack	2781222	For making low-pass filters, connecting sensors to microcontroller, and wiring motor.
Heat shrink tubing	RadioShack	2781611	For low-pass filter assembly.
Data acquisition and control unit	LabJack	LabJack U6	To process electrical signal from sensors and communicate with data acquisition and control software.
DAQFactory data acquisition software	DAQFactory	DAQFactory Express Release 5.87c Build: 2050	Free to download, for up to 10 channels.
Mini DC-gearmotor	McMaster Carr	6331K31	Motor for mixer impeller.
Impeller and shaft	N/A	N/A	Email authors for 3D files.
Variable DC power supply	Amazon	Tekpower HY1803D	Variable DC power supply, 0-18V @ 0-3A.
Grow Lamp	HydroGrow	SOL-1	This exact model is no longer available.
Incubator	Thermo Scientific	Precision Model 818	This particular incubator can withstand an internal heat source since this unit's cooling compressors run non-stop regardless of temperature setting.