Konstruktion och uppställning av en Bench-skala alga fotosyntetisk bioreaktor med temperatur, ljus och pH-övervakning för kinetiska tillväxttest

Summary

I detta dokument beskrivs monteringsprocessen och funktionen av en belystskalans fotosyntetisk bioreaktor som kan användas i samband med andra metoder för att uppskatta relevanta kinetiska tillväxtparametrar. Detta system övervakar kontinuerligt pH, ljus och temperatur med hjälp av sensorer, en datainsamling och styrenhet, och öppen källkodsinsamlingsprogramvara.

Abstract

Den optimala utformningen och driften av fotosyntetiska bioreaktorer (PBR) för mikroalgodling är avgörande för att förbättra den miljömässiga och ekonomiska utvecklingen hos mikroalgerbaserad biobränsleproduktion. Modeller som uppskattar mikroalgstillväxt under olika förhållanden kan bidra till att optimera PBR-design och -operation. För att vara effektiva måste tillväxtparametrarna som används i dessa modeller bestämmas exakt. Algstillväxtförsök begränsas ofta av kulturmiljöns dynamiska natur, och kontrollsystem behövs för att bestämma de kinetiska parametrarna noggrant. Det första steget i att upprätta ett kontrollerat satsprov är live datainsamling och övervakning. Detta protokoll beskriver en process för sammansättning och drift av en belystskalig fotosyntetisk bioreaktor som kan användas för att utföra mikroalgstillväxtförsök. Detta protokoll beskriver hur man storlekar och monterar en platta, bänkskalig PBR från akryl. Det beskriver också hur man konfigurerarRe en PBR med kontinuerlig pH, ljus och temperaturövervakning med hjälp av en dataövervakning och kontrollenhet, analoga sensorer och öppen källkods dataöverföringsprogram.

Introduction

På grund av växande oro över globala klimatförändringar och ändamålsenliga fossila bränslen har regeringar utvecklat strategier för att minska förbrukningen av fossila bränslen och uppmuntra utvecklingen av nya hållbara transportbränslen. Förenta staternas miljöskyddsmyndighet har utvecklat Renewable Fuel Standard (RFS), vilket kräver att 36 av de årliga 140 miljarder gallonerna av den amerikanska transportbränsleblandningen kommer från förnybara bränslekällor år 2022. Innovativ och transformativ teknik kommer att vara nödvändig för att möta dessa och Framtida förnybara energinormer ¹ .

Användningen av mikroalgerbaserade biobränslen har potential att hjälpa till att möta de nationella RFS-systemen samtidigt som utsläppen av växthusgaser minskas ² . Mikroalgerbaserade biobränslen har flera fördelar jämfört med första generationens biobränslen baserade på markbundna livsmedelsgrödor, såsom majs och sojabönor. Till skillnad från första generationens biobränslen, alger-bBiobränslen förbrukar färre mark-, vatten- och livsmedelsrelaterade resurser, eftersom algerna kan odlas året runt och på fräckt mark med saltvatten eller avloppsvatten. Mikroalger har höga tillväxter jämfört med markbundna grödor och kan ackumulera höga lipider, som lätt kan omvandlas till biodiesel ³ . För närvarande finns det inga industriella alg-till-biobränsleanläggningar på grund av de höga kostnaderna för de energiintensiva produktionsprocesserna, som består av algodling, lipidseparation och lipidraffinering i biodiesel. Mer forskning behövs för att göra dessa processer mer effektiva och hållbara.

PBR, som är optiskt klara, slutna installationer för produktion av fototrofiska mikroorganismer i en konstgjord miljö, anses vara en av de mest lovande odlingsmetoderna ³ . Emellertid saknar nuvarande konstruktioner fortfarande den volymetriska produktiviteten som är nödvändig för att producera algen-till-biobränsleproduktionenMer effektiv och ekonomiskt attraktiv ⁴ . Kraftfulla matematiska modeller som betraktar lätt bestrålning och dämpning, transport av näringsämnen och CO ₂ , och mikroalgernas tillväxt kan i hög grad underlätta optimeringen av PBR-design och drift. Bänkskalstillväxtförsök krävs för att bestämma artsspecifika tillväxtparametrar för dessa optimeringsmodeller.

Kinetiska test kräver noggrann övervakning och kontroll av experimentella inställningar för att förhindra oavsiktliga hämmare av tillväxt. Med tanke på algens fotosyntetiska karaktär ( dvs. deras förbrukning av CO ₂ och ljusabsorption) är det särskilt svårt att upprätthålla kontrollerade förhållanden i bänkskala PBR. Såsom avbildas i ekvation 1 betecknas mängden upplöst CO ₂ i tillväxtmediet, vanligen betecknat som ( Ekvation 2 ) kommer att vara, åtminstone aFunktion av: 1) CO ₂ -partialtrycket och Henriks jämviktskonstant, som dikterar mängden gas som kommer att lösas i lösning ( ekvation 3 ); 2) den första kemiska sammansättningen av tillväxtmediet, vilken påverkar karbonatjonernas och pH- värdetas speciering och aktivitet ( ekvationer 4 och 5 ); Och 3) temperaturen, som påverkar ekvationer 3-5 ⁵ .

De olika faserna och kemisk speciering av kol bildar en utmaning för mätning och upprätthållande av en konsekvent upplösning av upplöst kol i en PBR whiLe håller andra villkor konstanta ( t ex ökar pH när algerna konsumerar CO ₂ och ökning av det upplösta CO ₂ -substratet kan eventuellt leda till en sur miljö som hämmar tillväxten) ⁶ .

Ett ytterligare skikt av komplexitet för att reglera förhållandena under alkekinetiska test innefattar ljusintensiteten inom PBR. Den genomsnittliga ljusintensiteten i en PBR är en funktion av inte bara den infallande ljusintensiteten utan även konstruktionen ( t.ex. material, form, djup och blandning), absorptionen av algbiomassakomponenter (särskilt klorofyll) Spridningsegenskaper hos algcellerna. När algerna växer kommer den genomsnittliga ljusintensiteten att minska. Denna förändring i ljusintensitet, oavsett orsakad av en ökning av totala celler och biomassa, en ökning av klorofyllhalten per cell eller båda, kan så småningom inducera ett metaboliskt svar, såsom en ökning av klorofyllproducentenCtion per cell eller användningen av kolhydrat- och lipidlagringsprodukter för energi ⁷ . Kontinuerlig övervakning av ljusintensiteten från reaktorn ger ovärderlig information. Dessa data kan bidra till att förhållandena ligger inom ett visst område och kan användas för att uppskatta algstillväxt och absorbansparametrar om de kombineras med andra mätningar ( dvs. biomassa, klorofyllkoncentration, reaktordjup, infallande ljus etc. ).

Att förstå hur alger växer under en bestämd uppsättning villkor kräver att pH, upplöst CO ₂ , ljusintensitet och temperatur övervakas i bänkskalans kinetiska experiment. Många algstillväxtuppsättningar är inte utrustade med att övervaka förhållanden i den utsträckning som krävs för kalibrering av kinetiska modeller, vilket gör modelleringsprocessen extremt utmanande ⁸ . Även om många företag erbjuder bänkskaliga PBR med automation och kontroll, dessa bänkskalorE-uppställningar kan vara extremt dyra (~ $ 20 000) och kanske inte tillgodose alla experimentella överväganden av en given forskningsfråga.

Det första steget i att inrätta ett kontrollåterkopplingssystem för ett satsprov är live datainnsamling. Denna uppsats syftar till att visa hur man konstruerar och ställer upp en PBR-bänk som är utrustad med kontinuerlig ljus-, pH- och temperaturövervakning. Denna realtidsövervakningsinstallation kan bidra till att försöksförhållandena ligger inom önskade områden, efter forskarens bedömning. Medan detta protokoll inte specificerar specifika kontrollmekanismer, ger dessa stegvisa instruktioner en grundläggande grund för den datainsamling som krävs innan mer sofistikerade kontrollåterkopplingar kan implementeras.

Protocol

1. Konstruera bänkskivans PBR-kropp och lock

OBS! För illustrationsändamål, Dunaliella sp. , En ~ 10 μm halotolerant mikroalga som saknade en cellvägg, användes som modellorganismen för konstruktionen av denna PBR.

1. Bestäm den PBR-volym som krävs för forskningsbehoven.
   1. Bestäm de experimentella målen för denna PBR.
   2. Bestäm vilka vilka algmätningsanalyser, M , som är nödvändiga för att karakterisera tillväxten av de algartarter av intresse, inklusive den volym som krävs per analys, v ; Antalet tekniska replikat, n ; Samplingsfrekvensen, f ; Och varaktigheten av experiment, t .
      OBS! Projektspecifika forskningsfrågor, algart och tillgänglig utrustning dikterar de algegenskaper som mäts, metoderna som används för dessa mätningar och hur ofta dessa mätningar tas. Biomassa; Cellantal; Och totaltKlorofyllpigment, protein, lipid, kolhydrater och yttre nitratkoncentrationsmätningar är vanliga sätt att bedöma tillväxten, och daglig provtagning över 5-14 dagar är en vanlig metod för tillväxttest ^{9 , 10} .
   3. Beräkna den totala odlingsvolymen, V _s , som krävs för provtagning genom ett experiment med användning av ekvation 6 .
      
   4. Använd ekvation 7 för att uppskatta en mål-PBR-volym, Vp , med användning av Vs från steg 1.1.3 och en maxvolymavlägsnande fraktion, F.
      
      OBS: Att ta bort mindre än en förutbestämd fraktion av den totala odlingsvolymen ( t ex ~ 20%) kan bidra till att förhållandena inom PBR, dvs blandningskraft, ljusfördelning etc. inte drasticaLly varierar under försökets gång då kulturvolymen avlägsnas.
      1. Antag ett 10-dagars experiment där biomassa; Cellantal; Och totala klorofyll-, protein-, lipid-, kolhydrat- och nitratkoncentrationerna mäts dagligen i triplicat, använd en total provtagningsvolym på ~ 600 ml. Om man syftar till att avlägsna inte mer än 18,75% av den totala odlingsvolymen, använd en total arbetsreaktorvolym på minst 3,2 L.
2. Välj sensorer och tillbehör för PBR-experimenten.
   1. Välj pH, ljus och temperaturprober för kontinuerlig övervakning.
      OBS! Sensorerna ska vara kompatibla med datainsamlingsenheten och ska stå emot interna kulturförhållanden ( dvs. pH-intervall, ljus, värme, algavfall, salt etc. ). Rostfritt stål och salttoleranta prober valdes här sedan Dunaliella sp. Är marina mikroalger.
   2. Välj en pumphjulsdesign och motor för att tillfredsställa exPerimental blandningskrav.
      OBS! Exempelvis är en axiell pumphjul med låg skjuvning ett bra val för Dunaliella- alger, eftersom de saknar en cellvägg och lätt kan skjuva ¹¹ . Dessa alger har flagellär rörelse och behöver inte intensiv blandning ¹¹ . Låg blandhastighet kan uppnås med en 12 V mini-växellåda. Pumphjulet och axeln kan 3D-tryckas (3D-utskriftsinformation finns i materiallistan).
3. Montera PBR-kroppen och locket.
   1. Bestäm reaktorns dimensioner, baserat på volymberäkningarna i steg 1.1, med tanke på de experimentella målen och eventuella begränsningar ( t.ex. utrymme).
      OBS! En PBR-design med ett lägre förhållande mellan volymen är föredragen, eftersom denna form minimerar ljusdämpning i hela PBR, vilket ger en mer konsekvent ljusfördelning under hela experimentet.
   2. Skär fem stycken optiskt klar gjutningAkrylplåtar (~ 0,25-0,5 i tjock) med hjälp av en bordsåg, enligt PBR-designen och storleken som fastställdes i steg 1.3.1.
   3. Se till att fogkanterna är jämn, men inte avrundad, med 200 till 400 sandpapper.
   4. Skruva kanterna på akrylstyckena tillsammans med tejp och / eller klämmor.
      OBS! Akrylcement är inte ett lim. Om de akrylbindande ytorna är grova eller akrylstyckena inte är jämnt inriktade, kommer denna bindningscement inte att vara effektiv.
   5. På ett välventilerat område applicera akrylcement längs lederna med en nåldispenser. Plastytorna kommer omedelbart att fästa ihop. Låt bitarna sitta i 24 h.
      VARNING: En mask och handskar bör bäras för att undvika inandning och hudexponering vid användning av akrylcement.
   6. Applicera viskös akrylcement i lederna för att se till att PBR är vattentätt. Låt cementet torka i 24-48 h, enligt cementanvisningarna; Torkningstiderna kan variera.
   7. FyllReaktor med vatten för att kontrollera om det finns synliga läckor. Om det inte finns några läckor placera reaktorn på pappershanddukar och kontrollera om det finns tecken på läckage efter 24-36 timmar.
      OBS! Akrylplattor inte mindre än ~ 0,5 i tjock ska användas för att montera PBR som håller mer än ~ 2 L; Tunnare ark kan buga under vattentryck och orsaka läckage. Packningar och re-enforcing skruvar kan användas som ett mer robust alternativ till akrylcement ( Figur 1 ). Denna typ av montering kräver precisionsmaskiner och måste göras extremt noga, eftersom akryl lätt kan spricka.
   8. Använd en maskinbutik för att designa PBR-locket, med portar för att rymma sensorer och andra PBR-tillbehör och behov ( dvs. pumphjul, gasledningar, provtagningsportar etc. ). Se till att de interna komponenterna inte stör varandra.
      OBS: PBR- och PBR-lockets konfiguration / design kommer att bero på reaktortillbehör och experimentella mål. Se figur 1För ett exempel på en PBR-reaktor och lockdesign (ytterligare detaljer finns i materialavsnittet). Denna PBR-design kommer att refereras för resten av protokollet.

Figur 1: Bild av den anpassade bänkskalan PBR-inställningen med sensorer och en mixer. Denna inställning visar en mixer, en elektrod som är fäst på locket genom en gängad port i locket och en ljussensor ansluten till ett speciellt utformat lock. I detta locks utformning ingår även en 12 V DC mini-växellåda. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Konfigurera och konfigurera sensorer med Data Acquisition and Control Unit

OBS: Sensorer översätter ändringar iDen fysiska världen in i en mätbar analog signal, ofta spänning. Datainsamlingsenheter fungerar som gränssnitt mellan den digitala och fysiska världen och kan användas för att läsa dessa analoga signaler och konvertera dem till diskreta värden, enligt instruktioner från en dator. Den datahämtande enheten som beskrivs här har en analog ingångsupplösning på 16 bitar, kan läsa upp till 14 analoga signaler (± 10 V) och kan leverera den ström som krävs av vissa sensorer (upp till 5 V). Dessa instruktioner ger en översikt över hur man konfigurerar detta datainsamling och styrenhet för att konvertera en analog signal till mer meningsfulla värden för ljus, pH och temperatur inom en PBR. Dessa instruktioner beskriver inte viktiga begrepp ( dvs. kvantisering, precision, svarstid, etc. ) som behövs för att fullständigt tolka dessa uppmätta värden och att kvantifiera osäkerheten.

Figur 2: Anslutningsdiagram för sensor till data förvärv och styrenhet. Detta diagram visar hur man ställer in pH-, ljus- och temperatursensorer till datainsamling och styrenhet som används för detta protokoll. Signalbehandlingskomponenter för pH- och ljussensorn visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

1. Ställ in och konfigurera ljussensorn med datainsamling och styrenhet med hjälp av ett lågpassfilter.
   OBS! Se figur 2 för allmänna referensdiagram. Tillverkaresensorspecifikationer visar skillnaden mellan signal, kraft och jordledningar baserat på färg. Ett lågpassfilter är en enkel krets som använder ett motstånd och en kondensator för att filtrera bort oönskade ljud från elektriska signaler. Denna typ av filter dämpar elektriska signaler med frekvenser högre thaN avkänningsfrekvensen bestämd av resistans och kapacitans. Detta filter hjälper till att ta bort eller släta det elektriska bruset från sensorsignalen.
   1. Skär en 2-tums grön kontaktledning med hjälp av trådspärrar. Band 0,25 i isolering från ena änden och ~ 0,5 in från den andra änden av båda bitarna.
   2. Identifiera den analoga signalutgångstråden på ljussensorn. Se till att minst ~ 0,25-0,50 tum av metalltråd utsätts förbi isoleringen av ledningen.
   3. Vik försiktigt ett ben av 1000 Ω motstånd runt den ca 0,5 tum avtagna änden av kopplingstråden. Vik det andra benet av motståndet runt den exponerade delen av ljussensorens analoga signalledning.
   4. Använd lödstryk och blyfri lödning för att lödda motståndsbenen mot ledningen. Låt löddet svalna i 2-5 minuter.
      VARNING: Löd- och lödstrykjärnen blir extremt heta och kan vara mycket farliga om användarna inte är ordentligt utbildade. Instruktionsvideor finns online. Säkerhetsglasögon och andra försiktighetsåtgärder är extremt viktiga. Ledningar ska inte anslutas till strömförsörjning eller andra enheter under denna process.
   5. Lossa en ~ 1,5 tums värmekrympslang över ena änden av kopplingstråden och skjut biten tills den täcker löddetråd och motstånd. Se till att alla metallstycken är heltäckta.
   6. Värmekrymp med värmepistol. Se till att röret sitter ordentligt runt motståndet och ledningarna; Ingen ledig tråd ska exponeras.
   7. Fäst ljuskällarens jordkabel till en fri jord (GND) på datainsamling och styrenhet med en skruvmejsel.
   8. Säkra den lediga änden av signalkabeln till en fri analog ingång (AIN) med en skruvmejsel.
   9. Säkra den positiva ledningen på 1000 μF kondensatorn ( dvs längre benet) till samma AIN-terminal som i steg 2.1.8 och den negativa ledningen ( dvs det kortare benet) till samma GND-terminal som i steg 2.1.7.Se till att både kondensatorbenet och tråden är ordentligt anslutna till terminalen.
   10. Identifiera strömkabeln för ljussensorn och säkra den här ledningen till en nätuttag (VS) på datainsamlingen och styrenheten.
2. Ställ in och konfigurera pH-elektroden med datainsamlingsenheten med hjälp av en förstärkare med en förstärkare och ett lågpassfilter.
   ANMÄRKNING: På grund av beskaffenheten av pH-mätningar ( dvs högimpedans och lågspänning) behövs ofta en enhåndsförstärkande buffert mellan pH-sonden och dataöverföringsanordningen. Ett lågpassfilter är också fördelaktigt för mätning av pH, för att skydda signalen från omgivande elektrisk ljud.
   1. Anslut enhetens förstärkare till pH-sonden med hjälp av sändarledningen.
   2. Anslut den koaxiala adaptern, med positiva och negativa portanslutningar, till den andra änden av enhåndsförstärkaren.
   3. Klipp två 6-bitar gröna och en ~ 12 tums piecE av svart kopplingstråd med trådspärrar. Strip ~ 0,25 tum isolering från båda ändarna av den svarta kopplingstråden.
   4. Strip ~ 0,25 tum och ~ 0,5 tum isolering från ändarna av de gröna kontaktkablarna med hjälp av trådspärrar.
   5. Vik försiktigt ett ben på 1000 Ω motstånd runt den ~ 0,5 tums avskurna delen av en grön kontaktledning. Wrap det andra motståndet benet runt den ~ 0,5 tums avskalade delen av den andra gröna kontaktledningen.
   6. Använd lödstryk och blyfri lödning för att lödda motståndsbenen mot ledningen. Låt löddet svalna i 2-5 minuter.
   7. Lossa en ~ 1,5 tums värmekrympslang över ena änden av kopplingstråden och skjut biten tills den täcker löddetråd och motstånd. Se till att alla metallstycken är heltäckta.
   8. Värmekrymp med värmepistol. Se till att plasten sitter hårt runt motståndet och ledningarna; Ingen ledig tråd ska exponeras.
   9. Säker den ena änden av den svarta cNätsladden till den negativa (svarta) terminalen på koaxialadaptern. Sätt i den andra änden av den här ledningen i en GND-terminal på datainsamlings- och styrenheten och säkra med en skruvmejsel.
   10. Säkra ena änden av den gröna kontaktledningen (med motståndet i serie) till den positiva (röda) terminalen på koaxialadaptern. Sätt i den andra änden av den här anslutningskabeln i en fri AIN-terminal på datainsamlings- och styrenheten.
   11. Identifiera den positiva ledningen på 1000 μF kondensatorn ( dvs längre benet) och säkra denna ledning till samma AIN-terminal som i steg 2.2.9; Se till att både kondensatorbenet och signalkabeln är ordentligt anslutna till terminalen.
   12. Säkra den negativa ledningen på 1000 μF kondensatorn ( dvs det kortare benet) till samma GND-terminal som i steg 2.2.8.
3. Anslut temperaturgivaren till datainsamlings- och styrenheten genom att ansluta signalen, marken och strömmen wIres av sonden att frigöra AIN, GND och VS terminaler.

3. Ställ in den Live Data Acquisition och Experimental File

OBS: Datainsamlings- och kontrollprogrammet som beskrivs här kommunicerar med datainsamlings- och styrenheten för att övervaka och logga sensordata vid användardefinierade tidsintervaller. Anvisningarna nedan förklarar hur man ställer in en kontrollfil i denna programvara för att övervaka och registrera pH, temperatur och ljus. Dessa instruktioner är specifika för mjukvaran och datainsamling och kontrollenhet som anges i materialavsnittet. Ytterligare instruktioner finns i produktanvändarhandböcker.

1. Anslut datainsamling och styrenhet till en dator nära experimentell inställning med en USB-kabel och ladda ner alla nödvändiga drivrutiner.
2. Ladda ner och öppna datainsamlings- och kontrollprogramvaran.
3. Konfigurera "Konverteringar" för varje sensor i programvaran.
   OBS: Att konvertera fysiska voltÅlderssignal till ett meningsfullt värde, måste en viss omvandlingsfaktor, som fastställs genom kalibrering, tillämpas. Många sensorer kommer med fabrikskalibreringsfaktorer som finns i produktspecifika specifikationer. Konverteringsekvationer är specifika för inställningen och sensorerna. Många omvandlingsekvationsparametrar, speciellt de för elektroder, måste uppdateras regelbundet via kalibrering. Sensorns och kalibreringsfrekvensens livslängd beror på produktspecifika specifikationer och arbetsmiljön.
   OBS! Användarna bör läsa och förstå dessa specifikationer i sin helhet. Tabell 1 visar omvandlingar för sensorer som finns i materiallistan. Ett exempel omvandling för temperaturproben visas nedan.
   1. Navigera till "Konverteringar" i programvaruutrymmet, på höger sida på huvudsidan.
   2. Lägg till ett omvandlingsnamn, till exempel, "volts_to_celsius" och skriv in omvandlingsjämförelsen: (55,56 x värde) + 255,37 - 273,15.

Kanalnamn	Konverteringsnamn	Ekvation	anteckningar
Temperatur	volts_to_celsius	(55,56 x värde) + 255,37 - 273,15	Tillverkarens omvandlingsekvation för att omvandla volt till celsius.
Ljus	volts_to_PPFD	Värde x 500	Tillverkarens omvandlingsfaktor för att omvandla volt till fotosyntetisk fotonflödesdensitet (μmol m -2 s -1 ), tillverkarens LED-korrektion tillämpas ej.
pH	volts_to_pH	(-17,05 x värde) + 6,93	Kalibreringsberoende omvandlingsekvation (Figur 4b) för att omvandla pH-elektrodspänningsavläsning till pH-värden. Applicera endast omvandling till pH-kanal aFter kalibrering.

Tabell 1: Kanalomvandlingstabell för Data Acquisition File. Exempel på hur man matar in kanal- och omvandlingsinformation för sensorerna i datainsamlingsprogrammet.

4. Ställ in lämpliga kanaler för varje sensor i mjukvaran för att erhålla sensordata.
   OBS! Varje sensor behöver en egen analog-digital-kanal i mjukvaran och en analog analog ingång i datainsamlings- och styrenheten.
   1. Navigera till sidan "Channel" i programvaran.
   2. Lägg till ett sensorkanalsnamn. Inga mellanslag tecken är tillåtna.
   3. Välj lämplig enhet för att samla in data för motsvarande kanal; Den här enheten kommer att motsvara den datainsamling.
   4. Ange enhetnumret som används för att referera till datainsamling och styrenhet eller annanData-förvärvande enhet; Om endast en enhet används, är standardnumret ofta noll.
   5. Välj analog-digital, "A till D", för ingångsutgångstypen ("I / O-typ") och mata in kanalnumret som motsvarar AIN-terminalnumret på datainsamlings- och styrenheten
   6. Ange önskat provtagning "Timing" (s); Detta värde anger hur ofta sensorsignalen ska läsas. Ingång 1.0 för att få en läsning var 1: a s. Till genomsnittlig data över 1 minuters mellanrum före loggning, kolla rutan "Avg" och ange 60 för medellängden.
   7. Välj lämplig konvertering från rullgardinsmenyn, om tillämpligt (se steg 3.3 för att generera omvandlingar); Annars kommer alla kanaldata att visas / registreras som en spänning.
5. Ställ in "Logging Set" för att logga in experimentdata.
   1. Navigera till "Loggpanel" inom mjukvaruinläggningen, lägg till enEw logging set, och namnge uppsättningen i enlighet därmed. Välj utdatafil typ och plats; ASCII-filtypen kommer att ge en kommaseparerad värdefil om tillägget '.csv' anges i utdatafilnamnet.
   2. Lägg till alla önskade kanaler för att logga till den här uppsättningen.
   3. Starta och sluta logga som önskat genom att högerklicka på loggningssekvensen i arbetsytan och välj lämpligt alternativ.
      OBS! Försök inte komma åt filen när du aktivt loggar in data. Den här åtgärden kan störa loggningsprocessen. Filplatsen för kontinuerligt loggade filer ska inte sparas / skrivas i en molnkatalog.
6. Ställ in "Sidan" för att visa data och diagram.
   1. Navigera till "Sidor" -displayen inom programvaruutrymmet. Klicka på en av standardblankidorna.
   2. För att visa en sensorutmatning som läses numeriskt på sidan, lägg till en "Variabelvärde" -skärm till sidan.
      1. RiggHt-klicka någonstans inom blank sidan, välj "Displays" och klicka på alternativet "Variable Value"; En liten låda visas på skärmen.
      2. Högerklicka på den här nyskapade rutan och välj "Egenskaper". Skriv in bildtexten (t.ex. "Temperatur i reaktorn"), kanalreferensen (t.ex. "Temperatur [0]") och de tillhörande enheterna (t.ex. "Celsius"). Klicka på "OK" och återgå till bildsidan.
   3. För att visa sensordata grafiskt och i realtid lägger du till ett 2D-diagram på bildskärmsidan.
      1. Högerklicka var som helst på blank sidan och välj "Grafer" och sedan "2-D-grafer;" En liten tomt visas på skärmen.
      2. Högerklicka på det nybildade grafen och välj "Egenskaper". Inom fliken "Spår" skriver du in önskat sensorkanalsnamn (t.ex. "Temperatur") i rutan för "Y Expression:" och se till att "Time" är writteN i rutan för "X Expression :." Klicka på "OK" och återgå till bildsidan.

4. Kalibrera pH-proben

OBS! PH-kalibrering ska göras före varje experiment, vid den avsedda temperaturen i experimentet, och pH -kanalomvandlingen ska uppdateras i enlighet därmed. PH-elektrodavläsningar kan drifta under experimenten; För att bestämma omfattningen av denna drift, upprepa kalibreringsprocessen efter att ha kört experimentuppställningen och jämför läsningarna. PH-elektroder ska lagras korrekt i lämplig lagringslösning före och efter experiment, enligt tillverkarens anvisningar.

1. Anslut pH- och temperatursensorerna, som beskrivs i steg 2.
2. Sätt in både pH-elektroden och temperaturproben i pH-kalibreringsbufferten 7.
3. Kontrollera den grafiska displayen för att säkerställa att sondens temperaturavläsning är vid önskad temperaturFör att köra experiment (steg 3.6.2.2).
4. Låt pH-elektrodens spänningsutgång stabilisera ( dvs spänningsavläsningarna ändras inte längre i en riktning). Använd en grafisk display för att bekräfta stabilisering.
5. Logga in både temperatur och pH-eldata till en fil (steg 3.5) i 30-60 s. Under denna process bör pH-kanalen inte ha några omvandlingar tillämpade eller inkludera någon medelvärde.
   Obs! Eftersom pH-elektroderna är känsliga för elektriskt brus kan en lägre förvärvstidpunkt (dvs. snabbare sampling) för pH-kanalen vara att föredra ( t.ex. "Timing" = 0,1 s). Tänk på att en lägre timing kräver mer beräkningsresurser.
6. Upprepa kalibreringen för buffertar 4 och 10. Bekräfta att sensorns respons är mellan -57 och -59 mV / pH ( Figur 3a ).
7. Generera en omvandlingsekvation genom att plotta pH-buffertvärdet mot spänning och montera en linje ( Figur 3b >). Uppdatera omvandlingsekvationen som beskrivs i steg 3.3.
8. Använd denna omvandling till pH-kanalen och uppdatera kanalinställningarna för att inkludera medelvärdet som önskat för loggning.

5. Ställ in PBR för algalexperimentet

OBS! Stegen nedan är specifik för Dunaliella och den skräddarsydda PBR som visas i Figur 1 . Dessutom är dessa installationsinstruktioner inte i överensstämmelse med sterila protokoll, eftersom det här systemet inte var utformat på ett sådant sätt.

1. Förbered algeninoculum och tillväxtmedium, som behövs för experimentet och experimentella mål.
2. Anslut pH- och temperaturkablarna till datainsamlings- och styrenheten, som beskrivs i steg 2.2-2.3.
3. Kalibrera och uppdatera omvandlingsekvationen för pH- kanalen, som beskrivs i steg 3.3 och 4.

Igimg "src =" / files / ftp_upload / 55545 / 55545fig4.jpg "/>
Figur 4: Kopplingsschema för mixern. Detta diagram visar hur man ställer in en blandningsanordning för en PBR med en minidrevsmotor, en strömförsörjning och en 3D-tryckt pumphjul och axel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

4. Ställ in PBR i en temperaturstyrd inkubator med tillbehör och sensorer. Se figur 4 för visualisering.
   1. Ställ in ljussensorn i PBR genom att dra ljuskabeln genom lockporten och montera sensorhuvudet på lockets förlängningsfäste med den medföljande skruven. Använd en gummipropp eller gummipropp för att hålla denna port stängd för atmosfären.
   2. Fäst och fäst mixerhjulet på PBR-locket genom att placera pumphjulsaxeln över DC-miniväxlarenAxel inuti PBR-locket; Säkra axeln med en skruv och en insexnyckel.
   3. Lägg till algspecifikt tillväxtmedium, sätt locket och fäst locket med skruvar. Placera PBR inuti inkubatorn (inställd vid 25 ° C eller önskad temperatur).
   4. Sätt i temperaturproben i den utvalda porten och fäst den i porten med ett gummipropp.
   5. Säkra pH-sonden i reaktorlocksporten med hjälp av ett PG-13.5 gängat fäste.
   6. Anslut ljussensorns kablar till datainsamlingsenheten, som beskrivs i steg 2.1.
5. Kör blandarehjulet till önskad hastighet.
   1. Ställ in den variabla likströmsförsörjningen intill inställningen. Slå på strömförsörjningen och justera spänningsknappen tills spänningsvärdet läser 0 volt. Stäng av strömförsörjningen.
   2. Anslut pumphjulets motorledningar till de positiva och negativa utgångarna på den variabla strömförsörjningen ( Figur 5 VARNING: Anslut aldrig eller rör lediga ledningar eller kretsar. Se till att alla strömförsörjningar är avstängda innan du ansluter några ledningar. Läs alltid tillverkarens instruktioner / specifikationer för att säkerställa kompatibilitet mellan motor, nätaggregat och ledningar.
   3. Slå på strömförsörjningen och sakta öka spänningen genom att vrida spänningsknappen tills önskad blandhastighet uppnås; Beräkna blandhastigheten genom att mäta rotationerna per minut.

Figur 5: Reaktor Experimentellt Inställningsdiagram. Visualisering av en PBR-experimentell inställning inom en temperaturstyrd inkubator. Denna inställning innehåller en växelampa och en PBR, med sensorer och en mixer fastsatt i PBR-locket. Vänligen klicka här tillSe en större version av denna figur.

6. Ställ in växlampan för att belysa PBR.
   OBS! En kraftig LED-växelampa som avges i det blå och röda spektrat valdes för att uppnå de fotosyntetiska ljusintensitetsnivåer som krävs för denna Dunaliella- specifika undersökning. Lampans storlek och form bör väljas så att ljuset lyser jämnt på PBR: s infallyta. Kontrollera att inkubatorn kan hantera en intern värmekälla. Om du inte gör det kan du förkorta inkubatorns livstid och / eller orsaka skada eller överdriven uppvärmning i inkubatorn.
   1. Centrera växlampan längs PBR: s framsida. Kontrollera att ljusbanan är orienterad mot ljusgivaren monterad på reaktorns baksida.
   2. Slå på ljuset och justera ljusintensiteten efter behov genom att flytta växlampan direkt mot eller bort från reaktorn. Kontrollera sensorns variabeldisplay för ljusavläsningar.
7. Övervaka och logga sensordata i 6 - 24 timmar för att säkerställa att ljus, temperatur och pH-avläsningar inom PBR är stabila och inom det önskade området. Justera vid behov.
   OBS! Elektriskt brus kan ofta observeras av studsningar, ostabila mätningar och / eller plötsliga värdeförändringar, utan tydliga ändringar i PBR-miljön.
8. Ta bort gummiproppen på provtagningsporten för att tillsätta algeninoculum via överföringspipetten.
9. Ta bort proverna och övervaka villkoren för att säkerställa att de ligger inom det önskade området för experimentet.
   1. Ta bort kulturerna för analys efter behov från provtagningsporten med hjälp av en pipett.
      OBS: Provvolymen, frekvensen och varaktigheten av experimentet beror på steg 1.1.2.
   2. Övervaka vattentemperaturen i PBR genom att kontrollera dataskärmen i programvaran och manuellt justera inkubatorns lufttemperatur inställd punkt för att hålla vattnet temperaturRena konstant.
      OBS: Justeringen beror på instruktionerna för inkubatortillverkaren.
   3. Övervaka och justera pH i PBR, som önskat, för att säkerställa att pH förblir inom det förväntade intervallet för experimenten.
      OBS: Här kontrollerades pH med en 12 V magnetventil (normalt sluten) i linje med en komprimerad CO2-tank (99,99%). Ventilen öppnades efter behov med användning av kontrollfunktionaliteten hos datainsamlings- och styrenheten och mjukvaran. Denna inställning krävde ett reläkort och DC-moduler och implementerades med hjälp av anpassad datorprogrammering skräddarsydd för specifika forskningsmål.

Representative Results

Data från detta realtidsövervakningssystem visar den dynamiska odlingsmiljön för alger inom en PBR-bänk och markerar behovet av övervakning och styrning av systemet. Den loggade temperaturdata ( Figur 6 ) visar hur ljusbelysning, inkubatorluftens temperatur och energiförlust i samband med algstillväxt kan ändra temperaturen inom PBR och hur realtidsdata kan användas för att justera inkubatortemperaturreglering, efter behov.

Det uppmätta ljuset under experimentets gång belyser vidare den dynamiska naturen hos denna växande miljö. Såsom observerats i figur 7 var ljussensorns avläsning, mätt som fotosyntetisk fotonflödesdensitet (PPFD; μE-m ^-2 s ^-1 ), ~ 100 PPFD innan alger tillsattes och tappades omedelbart till 85 PPFD avTer inokulering av reaktorn med algkulturen. Ljuset fortsatte att sjunka till mindre än 5 PPFD på dag 7. Denna minskning av ljusintensiteten beror på ökad biomassa och cellantal och / eller ökad absorption med ökat klorofyllinnehåll, vilket visar att algerna är aktiva genom dag 7, trots låg Ljusnivåer. Ytterligare biologiska mätningar krävs för att göra ytterligare slutsatser.

De kontinuerligt loggade pH-data visar att pH-värdet totalt sett kontrollerades under detta experiment med den implementerade pH-kontrollalgoritmen ( Figur 8 ). Dessa data, som visar både minut-för-minut-avläsningar och timlånga medelvärden, visar några viktiga punkter om odling av alger och övervakning av pH i realtid. Först ökade pH över den önskade börvärdet på 7,6 omedelbart efter inokulering av PBR med alger. Denna förändring var förväntad, eftersom odlingsfröet som tillsattes till PBR hade apH värdet högre än börvärdet, eftersom kolven som användes för att odla inokulatet inte var pH-kontrollerad. För det andra belyser denna levnadsdata hur känsliga pH-elektroder är för externt elektrisk ljud. Denna känslighet uppmärksammas av ett drastiskt hopp i elektrodvärdena mellan dag 1 och dag 2. Dessa plötsliga förändringar i pH-värden skapades sannolikt av elektriskt brus från en magnetventil från en intilliggande experimentuppställning. Denna elektriska störning utlöpte tidigt pH-kontrollalgoritmen för att injicera CO ₂ i PBR. Följaktligen sjönk pH under den önskade börvärdet. PH-elektrodens känslighet kan leda till extrema utjämnare och kan störa styrsystemen potentiellt.

Figur 3: pH-svar och kalibreringsexempelgrafer. ( A ) Exempel svar graf av thE pH-sensor ( b ) Exempel kalibreringsdiagram för pH-sensorn, med en ekvation som ska användas för omvandlingen. Regressionsanalys visar ett 95% konfidensintervall. Felstänger är inte synliga (standardfel mindre än 0,03%). Dessa diagram visar att pH-sensorerna var korrekt anslutna och att signalen var mycket stabil. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Temperaturmätningar inom PBR Under ett 7-dagars experiment. Mörkblå punkter representerar 1-h-medelvärdena av sensordata och ljusblåa punkter representerar sensoravläsningar som förvärvats under 1 min (förvärvstid av 1 s, medellängd 60) och omvandlas till temperatur med användning av tillverkningslevererade omvandlingsfaktorer. Svarta pilar sho W när inkubatortemperaturens inställning justerades för att bibehålla odlingstemperaturen runt 25 ° C (den önskade börvärdet anges med en röd streckad linje). Temperaturvariationer beror på algstillväxt och förändringar i inkubatortemperaturen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7: Lätta mätningar inom PBR Under ett 7-dagars experiment. Mörkblå punkter representerar 1 h medelvärdesdata och ljusblå punkter representerar sensoravläsningar som förvärvats under 1 min (uppköpstimering av 1 s, genomsnittlig längd 60) och omvandlas till PPFD med hjälp av fabrikskalibreringsvärden för standardljuskällor."> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 8: pH-mätningar inom PBR under ett 7-dagars experiment. Mörkblå punkter representerar 1-h-medelvärdena för sensordata och ljusblåa punkter representerar sensoravläsningar som loggats var 1: e minut (uppköpstiming av 0,1 s, medellängd 600) och omvandlas till pH med hjälp av omvandlingsekvation som fastställts via kalibrering. PH upprätthölls mellan 7,6 och 7,5 med användning av en 99% CO2-injektion. De röda streckade linjerna anger önskat pH-område. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Detta PBR-system erbjuder möjligheten att övervaka och styra algkinetiska tillväxtprov på bänkskalan, vilket möjliggör mer repeterbara resultat från experimentella analyser som används för att kvantifiera tillväxten. En förståelse för begränsningar och osäkerheter hos sensormätningar är emellertid kritisk för att säkerställa att sensoravläsningarna exakt reflekterar reaktorförhållandena. Denna förståelse innehåller grundläggande kunskaper om mätprinciper som berörs av sensorer, kalibreringens process och frekvens, mätosäkerheten och vad sensorn kan och kan inte mäta. Exempelvis är det elektriska svaret för den här beskrivna ljussensorn inte lika fördelat över det synliga spektrumområdet, och vissa korrigeringsfaktorer kan behöva appliceras på sensorutgången, beroende på hur denna sensordata ska analyseras.

Temperaturnivåer och variationer är också extremt viktiga, eftersom temperaturförändringar kan drastiskt inFluensera sensorns svar. Att förstå potentiella störningar som kan påverka sensoravläsningen är också kritiskt viktigt. Denna störning kan vara omgivande elektriskt brus från byggnaden eller kan härröra från mätmiljön ( t ex kan natriumjoner drastiskt påverka pH-värden vid pH-värden över 10) ¹² . Vidare är nedsänkning av flera sonder i en lösning, särskilt en högt jonisk och ledande saltlösning, också en potentiell störningskälla. Elektroder som mäter pH (eller jonstyrka, löst syre, upplöst CO ₂ , etc. ) är speciellt känsliga för omgivande elektrisk buller och kan lätt störas. Signalkonditionering som används för att skydda elektrodsignalen kan inte garantera att andra faktorer inte kommer att störa probavläsningarna. Som en del av kvalitetskontrollen bör annan laboratorieutrustning, såsom en handhållen pH-sond, en handhållen spektrometer och en termometer användas för att verifiera tHan sensoravläsningar och för att försäkra sig om att systemet är inställt och kört korrekt.

En annan begränsning som måste åtgärdas är den möjliga effekten av algerna och / eller odlingsmiljön på sensorerna. Om exempelvis algavfall eller bubblor täcker fotodiodreceptorn hos ljussensorn, kommer avläsningarna att påverkas. På liknande sätt är pH-elektroder extremt känsliga och kräver extra försiktighet för att säkerställa noggranna avläsningar. Dessa elektroder arbetar genom att mäta en spänningsskillnad över en inre förbindning på grund av uppbyggnaden av H ⁺ joner; Ett hydratiserat buffertlager i sonden krävs för att upprätthålla noggranna mätningar ¹² . Beroende på förhållandena i reaktorn kommer detta skikt att slita av och sensornas respons kan förändras under experimentets gång medan sonden är nedsänkt. I preliminära tester drev pH-spänningsutmatningen inte mer än ~ 0,2 pH-enheter under ett 20-dagars experiment, Men ytterligare bedömningar bör utföras för att karakterisera denna förändring i sensorsvar och för att fastställa maximala experimentella körtider, speciellt om fina pH-justeringar / kvantifieringar behövs.

Många nuvarande bänkskala PBR-system som är konstruerade för att analysera algstillväxten, övervakar inte och kontrollerar den interna kulturnäringen så hårt som behövs för att urskilja hur olika faktorer påverkar algstillväxten, eftersom det kan vara utmanande att installera system på detta sätt. Detta protokoll kan hjälpa till att underlätta mer kontrollerade experiment genom att ge steg för steg instruktioner för att konstruera en PBR med realtidsövervakning. Vidare kan dessa levnadsdata användas inte bara för att bättre kontrollera experimentella förhållanden, men det kan potentiellt användas för att uppskatta tillväxtkinetik ( t.ex. optiska densitetsavläsningar som referens för generella tillväxthastigheter).

Kontrollerade experimentella system kan bidra till att algforskningen blir mer reproducerbar. Bänkskal PBR sEtups som övervakas och kontrolleras kan öka experimentell effektivitet genom att minimera oavsiktliga artefakter i experimentell design och kan bidra till att öka insatserna för att göra algenbiobränslen till en hållbar alternativ bränslekälla.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cast acrylic sheets	McMaster Carr	8560K244	7/8'' thick, 12 x 36'', optically-clear, the size of sheets purchased will depend on reactor dimensions.
Acrylic cement	McMaster Carr	7517A4	Scigrip plastic pipe cement, #4SC nonwhitening for acrylic. Not needed if gaskets and screws are used for PBR assembly.
Acrylic cement applicator needle	McMaster Carr	75165A136	Acrylic cement applicator needle, 25 Gauge, 1", Stainless steel, PTFE lined.
Plastic dispensing bottle for acrylic cement	McMaster Carr	7544A67	Plastic dispensing bottle, 2-oz size, packs of 5.
Viscous acrylic cement	McMaster Carr	7515A11	Scigrip plastic pipe cement. Medium-bodied acrylic cement to seal in any gaps within PBR body.
PG-13.5 thread tap	McMaster Carr	2485A14	Can be used to help secure pH electrode to lid (if applicable).
PBR and lid	NCSU Precision Machine Shop	Karam Algae 3.2L Reactor Revision E	This machine shop is open to public for business. Contact shop manager.
pH sensor	Hamilton	238643	EasyFerm Plus 120, autoclavable, millivolt output.
Light sensor	Apogee Instruments	SQ-225	Amplified 0-5 volt electric calibration quantum sensor, water-proof.
Temperature sensor	LabJack	EI1034	Stainless steel, water-proof temperature sensor.
pH transmitter wire with BNC end	Sigma-Aldrich	HAM355173-1EA	This wire will vary with type of pH probe. Make sure wire is compatible with pH probe and has BNC connector end.
Unity gain pre-amplifier	Omega Engineering	PHTX-21	Signal processing amplifier for pH electrode needed for high-impedance pH readings.
Coaxial adapter, BNC female-to-binding post	Amazon	SMAKN B00NGD5K80	For connecting pH signal from pre-amplifier to microcontroller.
Capacitor (1000 uF)	Amazon	Nichicon BCBI4950	For low-pass filter.
Resistor (1000 ohm)	Radio Shack	2711321	For low-pass filter.
Hookup wire	RadioShack	2781222	For making low-pass filters, connecting sensors to microcontroller, and wiring motor.
Heat shrink tubing	RadioShack	2781611	For low-pass filter assembly.
Data acquisition and control unit	LabJack	LabJack U6	To process electrical signal from sensors and communicate with data acquisition and control software.
DAQFactory data acquisition software	DAQFactory	DAQFactory Express Release 5.87c Build: 2050	Free to download, for up to 10 channels.
Mini DC-gearmotor	McMaster Carr	6331K31	Motor for mixer impeller.
Impeller and shaft	N/A	N/A	Email authors for 3D files.
Variable DC power supply	Amazon	Tekpower HY1803D	Variable DC power supply, 0-18V @ 0-3A.
Grow Lamp	HydroGrow	SOL-1	This exact model is no longer available.
Incubator	Thermo Scientific	Precision Model 818	This particular incubator can withstand an internal heat source since this unit's cooling compressors run non-stop regardless of temperature setting.