Construção e configuração de um Bioreactor Fotossintético Algal com Escala de Banco com Monitoramento de Temperatura, Luz e pH para testes de crescimento cinético

Summary

Este artigo descreve o processo de montagem e operação de um biorreator fotossintético de bench-scale que pode ser usado, em conjunto com outros métodos, para estimar os parâmetros de crescimento cinético pertinentes. Este sistema monitora continuamente o pH, a luz e a temperatura usando sensores, uma unidade de aquisição e controle de dados e software de aquisição de dados de código aberto.

Abstract

O ótimo design e operação de biorreatores fotossintéticos (PBRs) para o cultivo de microalgas é essencial para melhorar o desempenho ambiental e econômico da produção de biocombustíveis à base de microalgas. Os modelos que estimam o crescimento de microalgas em diferentes condições podem ajudar a otimizar o design e a operação do PBR. Para serem efetivos, os parâmetros de crescimento utilizados nesses modelos devem ser determinados com precisão. As experiências de crescimento de algas são muitas vezes limitadas pela natureza dinâmica do ambiente de cultura e são necessários sistemas de controle para determinar com precisão os parâmetros cinéticos. O primeiro passo na criação de um experimento em lote controlado é a aquisição e monitoramento de dados ao vivo. Este protocolo descreve um processo para a montagem e operação de um biorreator fotossintético de bench-scale que pode ser usado para realizar experiências de crescimento de microalgas. Este protocolo descreve como dimensionar e montar um PBR de placa plana e de bancada a partir de acrílico. Ele também detalha como configurarRe um PBR com monitoramento contínuo de pH, luz e temperatura usando uma unidade de aquisição e controle de dados, sensores analógicos e software de aquisição de dados de código aberto.

Introduction

Devido às crescentes preocupações com as mudanças climáticas globais e os recursos finitos de combustíveis fósseis, os governos têm desenvolvido políticas para reduzir o consumo de combustíveis fósseis e incentivar o desenvolvimento de combustíveis de transporte novos e sustentáveis. A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos desenvolveu o Padrão de Combustível Renovável (RFS), que exige que 36 dos 140 bilhões de litros anual de combustível de transporte de EUA provenham de fontes de combustível renováveis ​​até 2022. Tecnologias inovadoras e transformacionais serão necessárias para atender a essas e Futuros padrões de energia renovável ¹ .

O uso de biocombustíveis à base de microalgas tem potencial para ajudar a satisfazer os RFS nacionais, reduzindo as emissões de gases de efeito estufa ² . Os biocombustíveis à base de microalgas têm várias vantagens em relação aos biocombustíveis de primeira geração baseados em culturas alimentares terrestres, como o milho e a soja. Ao contrário dos biocombustíveis de primeira geração, algas-bOs biocombustíveis de combustível consumem menos recursos terrestres, hídricos e alimentares, uma vez que as algas podem ser cultivadas durante todo o ano e em terras estéreis usando água salgada ou águas residuais. As microalgas têm altas taxas de crescimento em relação às culturas terrestres e podem acumular altos níveis de lipídios, que podem ser facilmente convertidos em biodiesel ³ . Atualmente, não existem plantas de algas para biocombustíveis a escala industrial devido aos altos custos dos processos de produção intensivos em energia, que consistem em cultivo de algas, separação de lipídios e refinação de lipídios em biodiesel. Mais pesquisas são necessárias para tornar esses processos mais eficientes e sustentáveis.

Os PBRs, que são instalações ópticamente claras, fechadas para a produção de microorganismos fototróficos em ambiente artificial, são considerados um dos métodos de cultivo mais promissores ³ . No entanto, os projetos atuais ainda não possuem a produtividade volumétrica necessária para fazer o processo de produção de algas para biocombustíveisÉ mais eficiente e economicamente atraente ⁴ . Modelos matemáticos poderosos que consideram a irradiância e atenuação da luz, o transporte de nutrientes e o CO ₂ e o crescimento das microalgas podem facilitar a otimização do design e da operação da PBR. As experiências de crescimento em escala de banco são necessárias para determinar parâmetros de crescimento específicos de espécies para esses modelos de otimização.

Os testes cinéticos exigem o monitoramento cuidadoso e controle de configurações experimentais para evitar inibidores não intencionais de crescimento. Dada a natureza fotossintética das algas ( isto é, seu consumo de CO ₂ e absorção de luz), a manutenção de condições controladas é especialmente difícil em PBR de escala de banco. Conforme ilustrado na Equação 1 , a quantidade de CO ₂ dissolvido no meio de crescimento, comumente designado como ( Equação 2 ), será, no mínimo, umFunção de: 1) a pressão parcial de CO ₂ e a constante de equilíbrio de Henry, que determina a quantidade de gás que se dissolverá em solução ( Equação 3 ); 2) a composição química inicial do meio de crescimento, que afeta a especiação e a atividade dos íons carbonato e pH ( Equações 4 e 5 ); E 3) a temperatura, que impacta as Equações 3-5 ⁵ .

As várias fases e a especificação química de carbono criam um desafio para medir e manter uma concentração consistente de carbono dissolvido dentro de um PBR WhiMantendo outras condições constantes ( por exemplo, o pH aumenta à medida que as algas consomem CO ₂ e o aumento do substrato de CO ₂ dissolvido pode levar a um ambiente ácido que inibe o crescimento) ⁶ .

Uma camada adicional de complexidade para controlar condições durante os testes cinéticos de algas envolve a intensidade da luz dentro da PBR. A intensidade média da luz dentro de uma PBR é função não só da intensidade da luz incidente, mas também do design ( por exemplo, material, forma, profundidade e mistura), a absorvência de componentes de biomassa de algas (particularmente a clorofila) e a luz- Propriedades de dispersão das células de algas. À medida que as algas crescem, a intensidade da luz média diminuirá. Esta alteração na intensidade da luz, seja causada por aumento das células totais e biomassa, um aumento no teor de clorofila por célula, ou ambos, pode eventualmente induzir uma resposta metabólica, como um aumento nos produtos de clorofilaCção por célula ou uso de produtos de armazenamento de carboidratos e lipídios para energia ⁷ . O monitoramento contínuo da intensidade da luz dentro do reator fornece informações inestimáveis. Estes dados podem ajudar a garantir que as condições permaneçam dentro de um intervalo especificado e podem ser usadas para estimar o crescimento de algas e os parâmetros de absorvância se combinados com outras medidas (por exemplo, biomassa, concentração de clorofila, profundidade do reator, luz incidente, etc. ).

Compreender como as algas crescem sob um conjunto específico de condições requer que o pH, o CO ₂ dissolvido, a intensidade da luz e a temperatura sejam monitorados em experimentos cinéticos de bench-scale. Muitas configurações de crescimento de algas não estão equipadas para monitorar condições na medida necessária para a calibração de modelos cinéticos, tornando o processo de modelagem extremamente desafiador ⁸ . Embora muitas empresas ofereçam PBRs de escala de banco com automação e controle, estas bancadasAs configurações do e podem ser extremamente caras (~ $ 20,000) e podem não acomodar todas as considerações experimentais de uma determinada questão de pesquisa.

O primeiro passo na configuração de um sistema de feedback de controle para um experimento em lote é a aquisição de dados ao vivo. Este artigo pretende demonstrar como construir e configurar um PBR de escala de banco equipado com monitoramento contínuo de luz, pH e temperatura. Esta configuração de monitoramento em tempo real pode ajudar a garantir que as condições experimentais permaneçam dentro dos intervalos desejados, a critério do pesquisador. Embora este protocolo não detalha mecanismos de controle específicos, essas instruções passo a passo fornecem uma base básica para a estrutura de aquisição de dados necessária antes que os feedbacks de controle mais sofisticados possam ser implementados.

Protocol

1. Construa o corpo e a tampa PBR da escala de banco

NOTA: Para fins de ilustração , Dunaliella sp. , Uma microtubase halotolerante de ~ 10 μm que não possui uma parede celular, foi utilizada como organismo modelo para a construção deste PBR.

1. Determine o volume de PBR necessário para as necessidades de pesquisa.
   1. Determine os objetivos experimentais para este PBR.
   2. Decida quais os ensaios de medição de algas, M , são necessários para caracterizar o crescimento das espécies de interesse de algas, incluindo o volume requerido por ensaio, v ; O número de repetições técnicas, n ; A frequência de amostragem f ; E a duração das experiências, t .
      NOTA: As questões de pesquisa específicas do projeto, espécies de algas e equipamentos disponíveis determinam as propriedades de algas medidas, os métodos utilizados para essas medidas e a freqüência com que essas medidas são tomadas. Biomassa; Contagem de células; E totalAs medições de pigmentos de clorofila, proteínas, lipídios, hidratos de carbono e nitratos externos são formas comuns de avaliar o crescimento e a amostragem diária em 5 a 14 dias é uma abordagem comum para os testes de crescimento ^{9 , 10} .
   3. Calcule o volume de cultura total, V _s , necessário para a amostragem ao longo de uma experiência usando a Equação 6 .
      
   4. Use a Equação 7 para estimar um volume PBR alvo, V _p , usando V _s do passo 1.1.3 e uma fração máxima de remoção de volume, F.
      
      NOTA: A remoção de menos de uma fração pré-especificada do volume de cultura total ( por exemplo, ~ 20%) pode ajudar a garantir que as condições dentro do PBR , ou seja, (energia de mistura, distribuição de luz, etc. ) não são drásticasLily varia ao longo do experimento à medida que o volume de cultura é removido.
      1. Assumindo um experimento de 10 dias onde a biomassa; Contagem de células; E as concentrações totais de clorofila, proteína, lipídios, hidratos de carbono e nitrato são medidas diariamente em triplicado, use um volume de amostragem total de ~ 600 mL. Se pretender remover não mais do que 18,75% do volume total de cultura, use um volume total de reator de trabalho de pelo menos 3,2 L.
2. Selecione sensores e acessórios para as experiências PBR.
   1. Selecione sondas de pH, luz e temperatura para usar para monitoramento contínuo.
      NOTA: Os sensores devem ser compatíveis com a unidade de aquisição de dados e devem suportar condições de cultura interna ( isto é, faixa de pH, luz, calor, detritos de algas, sal, etc. ). As sondas de aço inoxidável e tolerância ao sal foram selecionadas aqui desde Dunaliella sp. São microalgas marinhas.
   2. Selecione um design de impulsor e motor para satisfazer o exRequisitos de mistura perimental.
      NOTA: Por exemplo, um impulsor axial de baixo cisalhamento é uma boa escolha para algas Dunaliella , pois eles não têm parede celular e podem cortar facilmente ¹¹ . Estas algas têm locomoção flagelar e não precisam de mistura intensa ¹¹ . Baixas velocidades de mistura podem ser alcançadas usando um motor de engrenagem de 12 V. O impulsor e o eixo podem ser impressos em 3D (a informação de impressão 3D pode ser encontrada na lista de materiais).
3. Monte o corpo e a tampa PBR.
   1. Determine as dimensões do reator, com base nos cálculos de volume no passo 1.1, tendo em mente os objetivos experimentais e as restrições potenciais ( por exemplo, espaço).
      NOTA: Um design PBR com uma relação superfície-volume inferior é preferido, pois esta forma minimiza a atenuação da luz em toda a PBR, proporcionando uma distribuição de luz mais consistente durante todo o experimento.
   2. Corte cinco peças de elenco opticamente claroFolhas acrílicas (~ 0,25-0,5 em espessura) usando uma serra de mesa, de acordo com o design e tamanho da PBR estabelecido no passo 1.3.1.
   3. Certifique-se de que as bordas das juntas são alisadas, mas não arredondadas, com lixa de areia de 200 a 400.
   4. Proteja as bordas das peças de acrílico juntamente com fita adesiva e / ou grampos.
      NOTA: O cimento acrílico não é uma cola. Se as superfícies de ligação acrílica são ásperas ou as peças acrílicas não estão uniformemente alinhadas, este cimento de ligação não será efetivo.
   5. Em uma área bem ventilada, aplique cimento acrílico ao longo das juntas usando um dispensador de agulhas. As superfícies plásticas imediatamente aderirem juntas. Deixe as peças sentar-se por 24 h.
      AVISO: Uma máscara e luvas devem ser usadas para evitar a inalação e a exposição da pele ao usar cimento acrílico.
   6. Aplique cimento acrílico viscoso nas juntas para garantir que o PBR seja estanque. Deixe o cimento secar durante 24-48 h, de acordo com as instruções do cimento; Os tempos de secagem podem variar.
   7. Preencha oReagir com água para verificar se há vazamentos visíveis. Se não houver vazamentos, coloque o reator em papel e verifique se há sinais de vazamento após 24-36 h.
      NOTA: As folhas de acrílico não inferior a 0,5 de espessura devem ser usadas para montar PBRs com mais de ~ 2 L; Folhas mais finas podem se curvar sob a pressão da água e causar vazamentos. As juntas e os parafusos de reforço podem ser usados ​​como uma alternativa mais robusta ao cimento acrílico ( Figura 1 ). Este tipo de montagem requer maquinaria de precisão e deve ser feito com muito cuidado, pois o acrílico pode facilmente quebrar.
   8. Use uma oficina de máquinas para projetar a tampa PBR, com portas para acomodar sensores e outros acessórios e necessidades PBR (por exemplo, impulsor, linhas de gás, portas de amostragem, etc. ). Certifique-se de que os componentes internos não interferem entre si.
      NOTA: A configuração / design da tampa PBR e PBR dependerá dos acessórios do reator e dos objetivos experimentais. Veja a Figura 1Para um exemplo de um reator PBR e design da tampa (mais detalhes podem ser encontrados na seção de materiais). Este projeto PBR será referenciado para o restante do protocolo.

Figura 1: Imagem da configuração de PBR da escala de banco personalizada com sensores e um mixer. Esta configuração mostra um misturador, um eletrodo fixado à tampa através de uma entrada roscada na tampa e um sensor de luz ligado a uma tampa especialmente projetada. Este design da tampa também inclui a fixação de um motor de mini-engrenagem de 12 V DC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Configurar e configurar sensores com a unidade de aquisição e controle de dados

NOTA: Sensores traduzem mudanças emO mundo físico em um sinal analógico mensurável, muitas vezes tensão. As unidades de aquisição de dados servem como uma interface entre o mundo digital e o mundo físico e podem ser usadas para ler esses sinais analógicos e convertê-los em valores discretos, conforme instruído por um computador. A unidade de aquisição de dados aqui descrita possui uma resolução de entrada analógica de 16 bits, pode ler até 14 sinais analógicos (± 10 V) e pode fornecer a energia necessária por alguns sensores (até 5 V). Essas instruções fornecem uma visão geral sobre como configurar esta unidade de aquisição e controle de dados para converter um sinal analógico em valores mais significativos para luz, pH e temperatura dentro de um PBR. Essas instruções não detalham conceitos importantes (por exemplo , quantização, precisão, tempo de resposta, etc. ) necessários para interpretar completamente esses valores medidos e quantificar a incerteza.

Figura 2: Diagrama de Conexão de Aquisição e Controle de Sensor-to-Data. Este diagrama mostra como configurar sensores de pH, luz e temperatura para a unidade de aquisição e controle de dados utilizada para este protocolo. Componentes de processamento de sinal para o sensor de pH e luz são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Configure e configure o sensor de luz com a unidade de controle e aquisição de dados usando um filtro passa-baixa.
   NOTA: Consulte a Figura 2 para diagramas de referência gerais. As especificações do sensor do fabricante indicam a diferença entre o sinal, a energia e os fios de aterramento com base na cor. Um filtro passa-baixa é um circuito simples que usa um resistor e capacitor para filtrar o ruído indesejado dos sinais elétricos. Este tipo de filtro atenua sinais elétricos com freqüências maiores queN a freqüência de corte conforme determinado pela resistência e capacitância. Este filtro ajuda a remover ou suavizar o ruído elétrico do sinal do sensor.
   1. Usando strippers de arame, corte um pedaço de conector verde de ~ 2 polegadas; Tira 0,25 de isolamento de uma extremidade e ~ 0,5 polegadas da outra extremidade de ambas as peças.
   2. Identifique o fio de saída do sinal analógico no sensor de luz. Certifique-se de que pelo menos ~ 0,25-0,50 polegadas de fio metálico são expostos após o isolamento do fio.
   3. Encaixe cuidadosamente uma perna do resistor de 1000 Ω em torno da extremidade desgastada de 0,5 polegadas do fio do conector. Enrole a outra perna do resistor ao redor da seção exposta do fio de sinal analógico do sensor de luz.
   4. Use uma solda de ferro de solda e sem chumbo para soldar as pernas do resistor ao fio. Deixe a solda arrefecer por 2-5 min.
      AVISO: A solda e os ferros de solda ficam extremamente quentes e podem ser muito perigosos se os usuários não estiverem devidamente treinados. Vídeos de instrução podem ser encontrados on-line. Óculos de segurança e outras precauções são extremamente importantes. Os fios não devem ser conectados a uma fonte de alimentação ou a outros dispositivos durante este processo.
   5. Deslize um pedaço de termocontrole de aproximadamente 1,5 polegadas sobre uma extremidade do fio do conector e deslize a peça até que ela cubra o fio soldado e o resistor. Certifique-se de que todas as peças de metal estejam totalmente cobertas.
   6. Calor-encolher usando uma pistola de calor. Certifique-se de que a tubagem se encaixe firmemente em torno de resistores e fios; Nenhum fio nu deve ser exposto.
   7. Anexe o fio de terra do sensor de luz a um terminal de terra livre (GND) na unidade de aquisição e controle de dados usando uma chave de fenda.
   8. Proteja a extremidade livre do fio do conector de sinal para um terminal de entrada analógica livre (AIN) usando uma chave de fenda.
   9. Proteja a linha positiva do capacitor de 1000 μF ( ou seja, a perna mais longa) para o mesmo terminal AIN como no passo 2.1.8 e o cabo negativo ( ou seja, a perna mais curta) para o mesmo terminal GND como no passo 2.1.7.Certifique-se de que tanto a perna do capacitor quanto o fio estão firmemente conectados ao terminal.
   10. Identifique o fio de entrada de energia para o sensor de luz e segure este fio para um terminal de entrada de tensão (VS) na unidade de aquisição e controle de dados.
2. Configure e configure o eletrodo de pH com a unidade de aquisição de dados usando um amplificador de ganho unitário e um filtro passa-baixa.
   NOTA: Devido à natureza das medições de pH ( isto é , alta impedância e baixa tensão), é necessário um buffer de amplificação de aumento de unidade entre a sonda de pH e o dispositivo de aquisição de dados. Um filtro passa-baixa também é benéfico para medir o pH, para proteger o sinal do ruído elétrico do ambiente.
   1. Conecte o amplificador de aumento de unidade à sonda de pH usando o fio do transmissor.
   2. Conecte o adaptador coaxial, com terminais de porta positivos e negativos, na outra extremidade do amplificador de ganho unitário.
   3. Corte dois pedaços de verde de 6 polegadas e um piec de ~ 12 polegadasE do fio do conector preto usando strippers de fio. Arraste 0,25 polegadas de isolação em ambas as extremidades do fio do conector preto.
   4. Arraste ~ 0,25 polegadas e ~ 0,5 polegadas de isolamento fora das extremidades dos fios do conector verde usando strippers de fio.
   5. Enrole com cuidado uma perna do resistor de 1000 Ω em torno da seção desgastada de ~ 0,5 polegadas de um fio de conector verde. Enrole a outra perna do resistor em torno da seção removida de ~ 0,5 polegadas do outro fio do conector verde.
   6. Use uma solda de ferro de solda e sem chumbo para soldar as pernas do resistor ao fio. Deixe a solda arrefecer por 2-5 min.
   7. Deslize um pedaço de termocontrole de aproximadamente 1,5 polegadas sobre uma extremidade do fio do conector e deslize a peça até que ela cubra o fio soldado e o resistor. Certifique-se de que todas as peças de metal estejam totalmente cobertas.
   8. Calor-encolher usando uma pistola de calor. Certifique-se de que o plástico se encaixe firmemente em torno do resistor e dos fios; Nenhum fio nu deve ser exposto.
   9. Proteja uma extremidade do preto cNo fio do terminal para o borne terminal negativo (preto) no adaptador coaxial. Insira a outra extremidade deste fio em um terminal GND da unidade de controle e aquisição de dados e segure-o usando uma chave de fenda.
   10. Fixe uma extremidade do fio do conector verde (com o resistor em série) ao borne positivo (vermelho) no adaptador coaxial. Insira a outra extremidade deste fio do conector em um terminal AIN livre na unidade de aquisição e controle de dados.
   11. Identifique o lead positivo do capacitor de 1000 μF ( ou seja , a perna mais longa) e segure esta ligação para o mesmo terminal AIN como no passo 2.2.9; Certifique-se de que a perna do capacitor e o fio do sinal estejam firmemente conectados ao terminal.
   12. Proteja o lead negativo do capacitor de 1000 μF ( ou seja , a perna mais curta) para o mesmo terminal GND que no passo 2.2.8.
3. Conecte o sensor de temperatura à unidade de controle e aquisição de dados conectando o sinal, o solo e o poder wIres da sonda para liberar os terminais AIN, GND e VS.

3. Configurar a aquisição de dados ao vivo e o arquivo experimental

NOTA: O software de aquisição e controle de dados descrito aqui se comunica com a unidade de aquisição e controle de dados para monitorar e registrar dados de sensores em intervalos de tempo especificados pelo usuário. As instruções abaixo explicam como configurar um arquivo de controle neste software para monitorar e registrar o pH, a temperatura e a luz. Essas instruções são específicas para a unidade de software e aquisição de dados e controle listada na seção de materiais. Mais instruções podem ser encontradas nos manuais do usuário do produto.

1. Conecte a unidade de aquisição e controle de dados a um computador perto da instalação experimental usando um cabo USB e baixe todos os drivers necessários.
2. Baixe e abra o software de aquisição e controle de dados.
3. Configure "Conversões" para cada sensor no software.
   NOTA: Para converter o volt físicoSinal de idade em um valor significativo, um fator de conversão, estabelecido por calibração, deve ser aplicado. Muitos sensores vêm com os fatores de calibração de fábrica encontrados nas folhas de especificação específicas do produto. As equações de conversão são específicas para a configuração e os sensores. Muitos parâmetros de equação de conversão, especialmente aqueles para eletrodos, devem ser atualizados regularmente por meio de calibração. A duração de um sensor e a frequência de calibração dependerão das especificações específicas do produto e do ambiente de trabalho.
   NOTA: Os usuários devem ler e entender essas especificações na íntegra. A Tabela 1 mostra as conversões para os sensores encontrados na lista de materiais. Um exemplo de conversão para a sonda de temperatura é mostrado abaixo.
   1. Navegue até "Conversões" no espaço de trabalho do software, no lado direito da página inicial principal.
   2. Adicione um nome de conversão, como "volts_to_celsius" e digite a equação de conversão: (55,56 x valor) + 255,37 - 273.15.

nome do canal	Nome da conversão	Equação	Notas
Temperatura	Volts_to_celsius	(Valor de 55,56 x) + 255,37 - 273,15	Equação de conversão do fabricante para converter volts para celsius.
Luz	Volts_to_PPFD	Valor x 500	Fator de conversão do fabricante para converter volts para a densidade de fluxo fotônico fotossintético (μmol m -2 s -1 ), a correção do LED do fabricante não foi aplicada.
PH	Volts_to_pH	(-17,05 x valor) + 6,93	Equação de conversão dependente da calibração (Figura 4b) para converter as leituras de tensão do eletrodo de pH em valores de pH. Apenas aplique a conversão para um canal de pH aPara calibrar a calibração.

Tabela 1: Tabela de conversão de canais para o arquivo de aquisição de dados. Exemplos de como inserir informações de canais e conversões para os sensores no software de aquisição de dados.

4. Configure canais apropriados para cada sensor dentro do software para adquirir dados do sensor.
   NOTA: Cada sensor precisa de seu próprio canal analógico-digital no software e um terminal de entrada analógico designado dentro da unidade de aquisição e controle de dados.
   1. Navegue até a página "Canal" no software.
   2. Adicione um nome do canal do sensor. Não são permitidos caracteres espaciais.
   3. Selecione o dispositivo apropriado para coletar dados para o canal correspondente; Este dispositivo corresponderá ao dispositivo de aquisição de dados.
   4. Insira o número do dispositivo usado para fazer referência à unidade de aquisição e controle de dados ou outroDispositivo de aquisição de dados; Se apenas uma unidade estiver sendo usada, o número padrão geralmente é zero.
   5. Selecione analog-to-digital, "A to D", para o tipo de entrada-saída ("Tipo de E / S") e insira o número do canal que corresponde ao número do terminal AIN na unidade de aquisição e controle de dados
   6. Insira a amostragem desejada "Temporização" (s); Este valor indica a frequência com que o sinal do sensor será lido. Entrada 1.0 para adquirir uma leitura a cada 1 s. Para obter dados médios em intervalos de 1 minuto antes do registro, verifique a caixa "Média" e especifique 60 para o comprimento médio.
   7. Selecione a conversão apropriada no menu suspenso, se aplicável (veja a etapa 3.3 para gerar conversões); Caso contrário, todos os dados do canal serão exibidos / registrados como uma tensão.
5. Configure o "Conjunto de Logging" para registrar os dados experimentais.
   1. Navegue até o "Painel de registro" no espaço de trabalho do software, adicione umEw logging set, e nomeie o conjunto de acordo. Selecione o tipo de arquivo de saída e a localização; O tipo de arquivo ASCII fornecerá um arquivo de valores separado por vírgula se a extensão '.csv' for especificada no nome do arquivo de saída.
   2. Adicione todos os canais desejados para registrar este conjunto.
   3. Comece e pare de registrar como desejado clicando com o botão direito do mouse na seqüência de registro no espaço de trabalho e selecionando a opção apropriada.
      NOTA: Não tente acessar o arquivo ao registrar dados ativamente. Essa ação pode interromper o processo de log. O local do arquivo para arquivos continuamente registrados não deve ser salvo / escrito dentro de um diretório da nuvem.
6. Configure a "Página" para exibir os dados e os gráficos.
   1. Navegue até a exibição "Páginas" no espaço de trabalho do software. Clique em uma das páginas em branco padrão.
   2. Para exibir uma leitura de saída do sensor numericamente na página, adicione uma exibição de "Valor Variável" à página.
      1. EquipamentoClique em qualquer lugar dentro da página em branco, selecione "Exibições" e clique na opção "Valor Variável"; Uma pequena caixa aparecerá na tela.
      2. Clique com o botão direito do mouse nesta caixa recém-criada e selecione "Propriedades". Digite a legenda da exibição (por exemplo, "Temperatura no Reator"), a referência do canal (por exemplo, "Temperatura [0]") e as unidades associadas (por exemplo, "Celsius"). Clique em "OK" e volte para a página de exibição.
   3. Para exibir os dados do sensor graficamente e em tempo real, adicione um gráfico 2D à página de exibição.
      1. Clique com o botão direito do mouse em qualquer lugar na página em branco e selecione "Gráficos" e depois "gráficos em 2-D"; Uma pequena parcela aparecerá na tela.
      2. Clique com o botão direito do mouse no gráfico recém-criado e selecione "Propriedades". Dentro da guia "Traços", digite o nome do canal do sensor desejado (por exemplo, "Temperatura") na caixa para "Expressão Y": e verifique se "Hora" está gravadaN na caixa para "X Expressão :." Clique em "OK" e volte para a página de exibição.

4. Calibre a sonda de pH

NOTA: A calibração do pH deve ser feita antes de cada experiência, na temperatura desejada de experiência, e as conversões dos canais de pH devem ser atualizadas em conformidade. As leituras de eletrodo de pH podem derivar durante experimentos; Para determinar a extensão dessa deriva, repita o processo de calibração após executar a configuração experimental e comparar as leituras. Os eletrodos de pH devem ser devidamente armazenados na solução de armazenamento apropriada antes e depois da experimentação, conforme indicado pelo fabricante.

1. Conecte os sensores de pH e temperatura, conforme descrito no passo 2.
2. Insira o eletrodo de pH e a sonda de temperatura no tampão de calibração de pH 7.
3. Verifique a exibição gráfica para garantir que a leitura da temperatura da sonda esteja na temperatura desejadaPara executar experimentos (passo 3.6.2.2).
4. Permita que a saída de tensão do eletrodo de pH se estabilize ( ou seja, as leituras de tensão não mudam mais em uma direção). Use uma exibição gráfica para confirmar a estabilização.
5. Registre ambos os dados elétricos de temperatura e pH em um arquivo (passo 3.5) para 30-60 s. Durante este processo, o canal de pH não deve ter nenhuma conversão aplicada ou incluir qualquer média.
   Nota: Uma vez que os eletrodos de pH são sensíveis ao ruído elétrico, pode ser preferível uma menor temporização de aquisição (ou seja, uma amostragem mais rápida) para o canal de pH ( por exemplo, 'Timing' = 0,1 s). Tenha em mente que um menor tempo exigirá mais recursos computacionais.
6. Repita a calibração para os buffers 4 e 10. Confirme se a resposta do sensor está entre -57 e -59 mV / pH ( Figura 3a ).
7. Gerar uma equação de conversão, traçando o valor do buffer de pH versus tensão e ajustando uma linha ( Figura 3b >). Atualize a equação de conversão conforme descrito no passo 3.3.
8. Aplique essa conversão ao canal de pH e atualize as configurações do canal para incluir a média como desejado para o registro.

5. Configure o PBR para a Experiência Algal

NOTA: As etapas abaixo são específicas para Dunaliella e o PBR personalizado mostrado na Figura 1 . Além disso, essas instruções de configuração não estão de acordo com protocolos estéril, pois este sistema não foi projetado de tal maneira.

1. Prepare o inóculo de algas e o meio de crescimento, conforme necessário para o experimento e os objetivos experimentais.
2. Conecte os fios de pH e temperatura à unidade de aquisição e controle de dados, conforme descrito nos passos 2.2-2.3.
3. Calibre e atualize a equação de conversão para o canal de pH , conforme descrito nas etapas 3.3 e 4.

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Figura 4: Diagrama de fiação para o misturador. Este diagrama mostra como configurar um dispositivo de mistura para um PBR usando um motor de mini-engrenagem, uma fonte de alimentação e um impulsor e eixo de impressão 3D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Configure o PBR dentro de uma incubadora controlada por temperatura com acessórios e sensores. Consulte a Figura 4 para visualização.
   1. Configure o sensor de luz dentro do PBR subindo o fio do sensor de luz através da porta da tampa e depois monte a cabeça do sensor na montagem da extensão da tampa usando o parafuso fornecido. Use uma rolha de borracha ou grommet para manter esta porta fechada à atmosfera.
   2. Conecte e fixe o impulsor do misturador na tampa PBR colocando o eixo do impulsor sobre o mecanismo de mini-engrenagem DCEixo dentro da tampa PBR; Prenda o eixo com um parafuso de ajuste e uma chave Allen.
   3. Adicione o meio de crescimento específico de algas, coloque a tampa e prenda a tampa com parafusos. Coloque o PBR dentro da incubadora (ajustado a 25 ° C ou a temperatura desejada).
   4. Insira a sonda de temperatura na sua porta designada e fixe-a na porta usando uma rolha de borracha.
   5. Fixe a sonda de pH na porta da tampa do reator usando uma montagem roscada PG-13.5.
   6. Conecte os fios do sensor de luz à unidade de aquisição de dados, conforme descrito no passo 2.1.
5. Coloque o impulsor do misturador na velocidade desejada.
   1. Configure a fonte de alimentação DC variável adjacente à configuração. Ligue a fonte de alimentação e ajuste o botão de tensão até o valor da tensão ler 0 volts. Desligue a fonte de alimentação.
   2. Conecte as linhas de energia do motor do impulsor aos terminais de saída positivo e negativo da fonte de alimentação variável ( Figura 5 AVISO: Nunca conecte ou toque fios ou circuitos ao vivo. Certifique-se de que todas as fontes de energia estejam desligadas antes de conectar qualquer fio. Leia sempre as instruções / especificações do fabricante para garantir a compatibilidade entre o motor, a fonte de alimentação e os fios.
   3. Ligue a fonte de alimentação e aumente lentamente a tensão girando o botão de tensão até atingir a velocidade de mistura desejada; Calcule a velocidade de mistura medindo as rotações por minuto.

Figura 5: Diagrama de Configuração Experimental do Reator. Visualização de uma configuração experimental PBR dentro de uma incubadora controlada por temperatura. Esta configuração inclui uma lâmpada de crescimento e um PBR, com sensores e um misturador seguro dentro da tampa PBR. Clique aqui paraVeja uma versão maior dessa figura.

6. Configure a lâmpada Grow para iluminar o PBR.
   NOTA: Uma lâmpada LED de alta potência e LED que emite no espectro azul e vermelho foi escolhida para atingir os níveis de intensidade de luz fotossintética necessários para essa pesquisa específica de Dunaliella. O tamanho e a forma da luminária devem ser selecionados de modo que a luz ilumine uniformemente a superfície incidente do PBR. Verifique se a incubadora pode lidar com uma fonte de calor interna. Não fazer isso pode encurtar a vida útil da incubadora e / ou pode causar danos ou aquecimento excessivo dentro da incubadora.
   1. Centre a lâmpada crescer ao longo da frente do PBR. Certifique-se de que o caminho da luz esteja diretamente orientado para o sensor de luz montado na parte traseira do reator.
   2. Ligue a luz e ajuste a intensidade da luz, conforme necessário, movendo a lâmpada de crescimento diretamente para ou para longe do reator. Verifique a exibição da variável do sensor para luzLeituras.
7. Monitore e registre os dados do sensor durante 6 a 24 h para garantir que as leituras de luz, temperatura e pH dentro do PBR sejam estáveis ​​e dentro do intervalo desejado. Ajuste conforme necessário.
   NOTA: O ruído elétrico geralmente pode ser observado por batidas, leituras instáveis ​​e / ou mudanças abruptas em valores, sem alterações aparentes no ambiente PBR.
8. Remova a rolha de borracha na entrada de amostragem para adicionar inóculo de algas por meio de uma pipeta de transferência.
9. Remova as amostras e monitore as condições para garantir que elas permaneçam dentro do intervalo desejado para a experiência.
   1. Remova as culturas para análise conforme necessário da porta de amostragem usando uma pipeta.
      NOTA: O volume, a frequência e a duração da experiência dependerão do passo 1.1.2.
   2. Monitorize a temperatura da água dentro da PBR, verificando a exibição de dados no software e ajustando manualmente o ponto de ajuste da temperatura do ar da incubadora para manter a temperatura da águaConstante constante.
      NOTA: Este ajuste dependerá das instruções do fabricante da incubadora.
   3. Monitore e ajuste o pH dentro do PBR, conforme desejado, para garantir que o pH permaneça dentro do alcance esperado para os experimentos.
      NOTA: Aqui, o pH foi controlado com uma válvula solenóide de 12 V (normalmente fechada) em linha com um tanque de CO2 comprimido (99,99%). A válvula foi aberta conforme necessário, usando a funcionalidade de controle da unidade de aquisição e controle de dados e software. Esta configuração exigiu uma placa de retransmissão de acessórios e módulos de DC e foi implementada usando programação de computador personalizada adaptada a objetivos específicos de pesquisa.

Representative Results

Os dados deste sistema de monitoramento em tempo real mostram o ambiente de cultura dinâmico para algas dentro de uma PBR de escala de banco e destacam a necessidade de monitorar e controlar o sistema. Os dados de temperatura registrados ( Figura 6 ) demonstram como a iluminação da luz, a temperatura do ar da incubadora e a dissipação de energia associada ao crescimento de algas podem alterar a temperatura dentro da PBR e como os dados em tempo real podem ser usados ​​para ajustar os controles de temperatura da incubadora, conforme necessário.

A luz medida ao longo do experimento enfatiza ainda mais a natureza dinâmica deste ambiente em crescimento. Conforme observado na Figura 7 , a leitura do sensor de luz, medida como densidade de fluxo fotônico fotossintético (PPFD; μE-m ^-2 s ^-1 ), foi de ~ 100 PPFD antes da adição de algas e caiu imediatamente para 85 PPFD afTer inoculando o reator com a cultura de algas. A luz continuou a cair para menos de 5 PPFD no dia 7. Esta diminuição da intensidade da luz deve-se ao aumento da biomassa e das contagens celulares e / ou ao aumento da absorção pelo aumento do teor de clorofila, mostrando que as algas estão ativas até o 7º dia, apesar da baixa Níveis de luz. Medições biológicas adicionais são necessárias para fazer inferências adicionais.

Os dados de pH continuamente verificados mostram que, em geral, o pH foi adequadamente controlado durante esta experiência com o algoritmo de controle de pH implementado ( Figura 8 ). Esses dados, que mostram leituras minuto a minuto e médias de uma hora, demonstram alguns pontos-chave sobre o cultivo de algas e o monitoramento do pH em tempo real. Primeiro, o pH aumentou acima do ponto de ajuste desejado de 7,6 imediatamente após a inoculação do PBR com algas. Esta mudança era esperada, já que a semente de cultura que foi adicionada ao PBR teveValor de H maior que o ponto de ajuste, uma vez que o balão utilizado para cultivar o inóculo não foi controlado pelo pH. Em segundo lugar, esses dados ao vivo destacam como os eletrodos de pH sensíveis são para o ruído elétrico externo. Essa sensibilidade é notada por um salto drástico nos valores dos eletrodos entre o dia 1 e o dia 2. Essas mudanças repentinas nos valores de pH provavelmente foram criadas pelo ruído elétrico de uma válvula solenóide de uma instalação experimental adjacente. Este distúrbio elétrico desencadeou prematuramente o algoritmo de controle de pH para injetar CO ₂ no PBR. Conseqüentemente, o pH caiu abaixo do ponto de ajuste desejado. A sensibilidade dos eletrodos de pH pode levar a outliers extremos e pode potencialmente interromper os sistemas de controle.

Figura 3: Gráficos de Exemplo de Resposta ao pH e de Calibração. (A) Exemplo de gráfico de resposta deE sensor de pH ( b ) Exemplo de gráfico de calibração do sensor de pH, com uma equação a utilizar para a conversão. A análise de regressão mostra um intervalo de confiança de 95%. As barras de erro não são visíveis (erro padrão inferior a 0,03%). Estes gráficos mostram que os sensores de pH foram conectados corretamente e que seu sinal era muito estável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Medições de temperatura dentro da PBR durante uma experiência de 7 dias. Os pontos azuis marinhos representam as médias de 1 h dos dados do sensor e os pontos azuis claros representam as leituras dos sensores adquiridos ao longo de 1 min (tempo de aquisição de 1 s, comprimento médio de 60) e convertidos em temperatura usando fatores de conversão fornecidos pelo fabricante. Setas pretas sho W quando a configuração da temperatura da incubadora foi ajustada para manter a temperatura da cultura em torno de 25 ° C (este ponto de ajuste desejado é designado com uma linha vermelha e pontilhada). As flutuações na temperatura são devidas ao crescimento de algas e às mudanças na temperatura da incubadora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Medições de luz dentro da PBR durante uma experiência de 7 dias. Os pontos azul escuro representam as médias de 1 h dos dados do sensor e os pontos azuis claros representam as leituras dos sensores adquiridos ao longo de 1 min (tempo de aquisição de 1 s, comprimento médio de 60) e convertidos em PPFD usando os valores padrão de calibração de fábrica do sensor de luz."> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Medições de pH dentro da PBR durante uma experiência de 7 dias. Os pontos azul escuro representam médias de 1 h dos dados do sensor, e os pontos azuis claros representam as leituras dos sensores registrados a cada 1 min (tempo de aquisição de 0,1 s, comprimento médio de 600) e convertidos em pH usando a equação de conversão estabelecida através da calibração. O pH foi mantido entre 7,6 e 7,5 usando uma injeção de gás com 99% de CO ₂ . As linhas vermelhas e pontilhadas indicam a faixa de pH desejada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este sistema PBR oferece a capacidade de monitorar e controlar experimentos de crescimento de cinética de algas de escala, permitindo resultados mais repetíveis de ensaios experimentais usados ​​para quantificar o crescimento. No entanto, uma compreensão das limitações e incertezas das medições do sensor é fundamental para garantir que as leituras dos sensores reflitam com precisão as condições do reator. Esta compreensão inclui conhecimento básico dos princípios de medição envolvidos com sensores, processo e freqüência de calibração, incerteza de medição e o que o sensor pode e não pode medir. Por exemplo, a resposta elétrica para o sensor de luz aqui descrito não está distribuída de forma igual na faixa de espectro visível, e alguns fatores de correção podem ser aplicados à saída do sensor, dependendo de como esses dados do sensor serão analisados.

Os níveis de temperatura e as variações também são extremamente importantes, pois as mudanças de temperatura podem ser drasticamenteFluence a resposta do sensor. Compreender potenciais interferências que podem impactar as leituras dos sensores também é extremamente importante; Essa interferência pode ser o ruído elétrico ambiental do prédio ou pode resultar do ambiente de medição ( por exemplo, os íons de sódio podem afetar drasticamente as leituras de pH em valores de pH superiores a 10) ¹² . Além disso, submergir múltiplas sondas em uma solução, especialmente uma solução de sal altamente iónica e condutora, também é uma fonte potencial de interferência. Os eletrodos que medem o pH (ou força iónica, oxigênio dissolvido, CO ₂ dissolvido, etc. ) são especialmente sensíveis ao ruído elétrico do ambiente e podem ser facilmente perturbados. O condicionamento do sinal usado para proteger o sinal do eletrodo não pode garantir que outros fatores não interfiram com as leituras da sonda. Como parte do controle de qualidade, outros equipamentos de laboratório, como uma sonda de pH manual, um espectrômetro de mão e um termômetro, devem ser usados ​​para verificar tAs leituras dos sensores e para garantir que o sistema esteja configurado e funcionando corretamente.

Outra limitação que deve ser abordada é o possível impacto do ambiente de algas e / ou cultura nos sensores. Por exemplo, se os detritos ou bolhas de algas cobrem o receptor de fotodiodo do sensor de luz, as leituras serão afetadas. Da mesma forma, os eletrodos de pH são extremamente sensíveis e requerem cuidados extras para garantir leituras precisas. Esses eletrodos funcionam medindo uma diferença de tensão através de uma junção interna devido ao acúmulo de íons H ⁺ ; Uma camada tampão hidratada dentro da sonda é necessária para manter medições precisas ¹² . Dependendo das condições dentro do reator, esta camada desaparecerá e a resposta do sensor pode mudar ao longo da experiência enquanto a sonda é submersa. Em testes preliminares, a saída de tensão de pH não derivou em mais de 0,2 unidades de pH ao longo de um experimento de 20 dias, Mas outras avaliações devem ser realizadas para caracterizar esta alteração na resposta do sensor e estabelecer tempos de execução experimentais máximos, especialmente se forem necessários ajustes / quantificações finais de pH.

Muitos sistemas de PBR de escala atual construídos para analisar o crescimento de algas não monitoram e controlam o ambiente de cultura interna tão forte quanto necessário para discernir como fatores diferentes afetam o crescimento de algas, uma vez que a criação de sistemas dessa maneira pode ser desafiadora. Este protocolo pode ajudar a facilitar experiências mais controladas, fornecendo instruções passo a passo para a construção de um PBR com monitoramento em tempo real. Além disso, esses dados ao vivo podem ser usados ​​não só para controlar melhor as condições experimentais, mas potencialmente podem ser utilizados para estimar a cinética do crescimento ( por exemplo, leituras de densidade óptica como referência para taxas de crescimento geral).

Sistemas experimentais controlados podem ajudar a tornar a pesquisa de algas mais reprodutível. PBR de escala de bancoAs etups que são monitoradas e controladas podem aumentar a eficiência experimental, minimizando artefatos não intencionais em projetos experimentais e podem ajudar a promover esforços para fazer biocombustíveis de algas uma fonte de combustível sustentável e alternativa.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cast acrylic sheets	McMaster Carr	8560K244	7/8'' thick, 12 x 36'', optically-clear, the size of sheets purchased will depend on reactor dimensions.
Acrylic cement	McMaster Carr	7517A4	Scigrip plastic pipe cement, #4SC nonwhitening for acrylic. Not needed if gaskets and screws are used for PBR assembly.
Acrylic cement applicator needle	McMaster Carr	75165A136	Acrylic cement applicator needle, 25 Gauge, 1", Stainless steel, PTFE lined.
Plastic dispensing bottle for acrylic cement	McMaster Carr	7544A67	Plastic dispensing bottle, 2-oz size, packs of 5.
Viscous acrylic cement	McMaster Carr	7515A11	Scigrip plastic pipe cement. Medium-bodied acrylic cement to seal in any gaps within PBR body.
PG-13.5 thread tap	McMaster Carr	2485A14	Can be used to help secure pH electrode to lid (if applicable).
PBR and lid	NCSU Precision Machine Shop	Karam Algae 3.2L Reactor Revision E	This machine shop is open to public for business. Contact shop manager.
pH sensor	Hamilton	238643	EasyFerm Plus 120, autoclavable, millivolt output.
Light sensor	Apogee Instruments	SQ-225	Amplified 0-5 volt electric calibration quantum sensor, water-proof.
Temperature sensor	LabJack	EI1034	Stainless steel, water-proof temperature sensor.
pH transmitter wire with BNC end	Sigma-Aldrich	HAM355173-1EA	This wire will vary with type of pH probe. Make sure wire is compatible with pH probe and has BNC connector end.
Unity gain pre-amplifier	Omega Engineering	PHTX-21	Signal processing amplifier for pH electrode needed for high-impedance pH readings.
Coaxial adapter, BNC female-to-binding post	Amazon	SMAKN B00NGD5K80	For connecting pH signal from pre-amplifier to microcontroller.
Capacitor (1000 uF)	Amazon	Nichicon BCBI4950	For low-pass filter.
Resistor (1000 ohm)	Radio Shack	2711321	For low-pass filter.
Hookup wire	RadioShack	2781222	For making low-pass filters, connecting sensors to microcontroller, and wiring motor.
Heat shrink tubing	RadioShack	2781611	For low-pass filter assembly.
Data acquisition and control unit	LabJack	LabJack U6	To process electrical signal from sensors and communicate with data acquisition and control software.
DAQFactory data acquisition software	DAQFactory	DAQFactory Express Release 5.87c Build: 2050	Free to download, for up to 10 channels.
Mini DC-gearmotor	McMaster Carr	6331K31	Motor for mixer impeller.
Impeller and shaft	N/A	N/A	Email authors for 3D files.
Variable DC power supply	Amazon	Tekpower HY1803D	Variable DC power supply, 0-18V @ 0-3A.
Grow Lamp	HydroGrow	SOL-1	This exact model is no longer available.
Incubator	Thermo Scientific	Precision Model 818	This particular incubator can withstand an internal heat source since this unit's cooling compressors run non-stop regardless of temperature setting.