Summary
Vi beskriver anvendelsen af et fænotypisk fluorescensbaseret neuraminidase inhiberingsassay at vurdere følsomheden af influenza A og B virus til neuraminidaseinhibitoren klasse af antivirale lægemidler.
Abstract
De (NA) inhibitorer neuraminidase er den eneste klasse af antivirale lægemidler er godkendt til behandling og forebyggelse af influenza, der er effektive over for tiden cirkulerende stammer. Ud over deres anvendelse i behandling af sæsoninfluenza, har NA-hæmmere blevet oplagret ved en række lande til brug i tilfælde af en pandemi. Det er derfor vigtigt at overvåge modtagelighed af cirkulerende influenzavira til denne klasse af antivirale midler. Der findes forskellige typer af assays, der kan anvendes til at vurdere modtagelighed af influenzavirus til NA-inhibitorer, men de enzymhæmning assays under anvendelse af enten et fluorescerende substrat eller et kemiluminescerende substrat er de mest udbredte og anbefales. Denne protokol beskriver anvendelsen af en fluorescens-baseret assay for at vurdere influenzavirus modtagelighed for NA-inhibitorer. Bestemmelsen er baseret på NA-enzymet spalte 2 '- (4-methylumbelliferyl) -α-D-N -acetylneuraminic syre (Muñana) Substrat for at frigive det fluorescerende produkt 4-methylumbelliferon (4-MU). Derfor er den inhiberende virkning af en NA-inhibitor på influenzavirus NA bestemmes baseret på koncentrationen af NA-inhibitor, der er nødvendig for at reducere 50% af NA-aktivitet, givet som en IC50-værdi.
Introduction
Hæmagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) er de to store overfladeglycoproteiner af influenza A og B virus. HA binder til sialsyre-galactose celleoverfladeglycoproteiner eller glycolipider, mens NA frigiver virus ved at spalte sialinsyre fra galactose på celleoverfladen 1. NA-inhibitorer er en klasse af influenza antivirale stoffer, der blev rationelt udformede til at binde tæt til NA enzymatiske aktive sted, hvilket forhindrer frigivelse og spredning af virus afkom. Oseltamivir og zanamivir er to NA hæmmere, der er godkendt i mange lande verden over til behandling og forebyggelse af influenza. I de seneste år, to ekstra NA hæmmere, peramivir og laninamivir, er blevet godkendt til brug i et begrænset antal lande. Screening af influenzavirus for modtagelighed for NA-inhibitorer og identifikation af mutationer, der bibringer resistens er vigtige ved bestemmelse og overvågning af virkningsfuldeness af denne klasse af antivirale lægemidler.
I de sidste 16 år har fluorescens-baserede NA inhiberingsassay blevet udført rutinemæssigt på WHO samarbejdscenter for reference og Forskning vedrørende Influenza, Melbourne (Melbourne WHOCCRRI) for at overvåge skiftende tendens af antiviral følsomhed blandt cirkulerende influenzavira. Årligt bliver mere end 2.000 influenzavirus testet for antiviral modtagelighed. I de fleste influenzasæsoner,> 98% af vira er modtagelige for alle fire NA inhibitorer 2, 3, 4, selvom under 2007-2008 nordlige halvkugle influenzasæson, var der en stigning i antallet af tidligere sæsonmæssige A (H1N1) virus der havde reduceret modtagelighed over for oseltamivir 5. Denne gruppe af vira, som indeholdt NA aminosyresubstitution H275Y, spreder sig til resten af verden ved udgangen af 2008, hvilket gør oseltamivir inapproprispiste globalt til behandling af denne virus. Langt størstedelen af de aktuelt cirkulerende influenza B, influenza A (H3N2), og influenza A (H1N1) pdm09 stammer er modtagelige for oseltamivir, selvom community klynger af A (H1N1) pdm09 varianter indeholder NA aminosyresubstitution H275Y som giver reduceret oseltamivir og peramivir modtagelighed, er blevet rapporteret i forskellige dele af verden 6, 7.
På grund af behovet for en tilstrækkelig høj virustiter, skal kliniske prøver (herunder dyr næseskylninger) passeres i enten cellekultur eller befrugtede hønseæg før antiviral følsomhedstest. NA-inhiberingsassay beskrevet i denne artikel kan opdeles i tre sektioner:
Bestemmelse af den lineære område for det fluorescerende produkt 4-methylumbelliferon (4-MU) på et bestemt fluorometer
Grund af de iboende forskelle mellem fluorometre, than lineære område for det fluorescerende slutprodukt, 4-MU, og den relative fluorescens enhed (RFU), skal etableres. Når det lineære område for 4-MU er etableret, den optimale target signal valgt, at hvor koncentrationen af influenzavira justeres i NA-aktivitet assay. Når du er færdig til en bestemt fluorometer, bør dette ikke behøver at blive gentaget.
Bestemmelse af NA aktiviteten af virus
NA-aktivitetsanalyse en simpel analyse, der involverer tilsætning af 2 '- (4-methylumbelliferyl) -α-D-N -acetylneuraminic syre (Muñana) substrat til seriefortyndet vira. Mængden af fluorescerende slutprodukt 4-MU genereret fra spaltningen af Muñana af NA måles med et fluorometer. Den passende virusfortynding til brug i NA inhiberingsassay vælges ved at afbilde fluorescensenheder mod virus fortynding. Fra formet kurve, bør af midtpunktet af den lineære sektion svarer til4-MU lineære område fluorometer bestemt i punkt 1 og vil informere den passende koncentration af virus, der skal anvendes i afsnit 3.
Vurdere virus modtagelighed for NA inhibitorer under anvendelse af NA-inhiberingsassay
For at vurdere følsomheden af virus til en bestemt NA-inhibitor, er vira ved fortynding bestemt i punkt 2 inkuberet med en række NA inhibitorkoncentrationer. Efter en efterfølgende inkubation med Muñana omdannes 4-MU genereres af uhæmmede vira målt i RFU ved fluorometer. Den inhiberende virkning af NA inhibitoren på NA enzymaktiviteten af et virus er beregnet ifølge NA inhibitorkoncentration nødvendig for at reducere 50% af NA-aktivitet, givet som en IC50-værdi.
Protocol
1. Bestemmelse af lineære område af Fluorescent Produkt 4-MU på et fluorometer
- Forbered 10 ml 6,4 mM 4-MU-stamopløsning ved at opløse 11,3 mg 4-MU i 5 ml absolut ethanol. Der tilsættes 5 ml 0,9% NaCl (vægt / volumen) til stamopløsningen for at gøre 10 ml. Forberede en 640 uM arbejdsopløsning ved at fortynde 1 ml 6,4 mM 4-MU i 9 ml 1x assaybuffer (33,3 mM 2- (N-morpholino) ethansulfonsyre (MES) og 4 mM CaCl2, pH 6,5).
BEMÆRK: Forbered 2x assaypuffer ved tilsætning af 13 g MES og 8 ml 1 M CaCI2 992 ml destilleret vand. PH justeres til 6,5 under anvendelse af 10 M NaOH. Foretage bufferen anvendelse af en steril celluloseacetat med porestørrelse 0,2 um. Advarsel!!!! Natriumhydroxid er ætsende og kan give ætsninger af hud og øjne. Sørg for, at fuld personlige værnemidler er slidt. - Forbered 5 ml af en række 4-MU koncentrationer (dvs. 5 pM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 & #181; M, og 320 uM) gennem en dobbelt seriel fortynding af 640 pM 4-MU anvendelse 1x assaypuffer.
- Dispensere 50 pi af hver seriefortynding af 4-MU (dvs. 5 pM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 pM, 320 pM og 640 pM) (to brønde pr fortynding) i en klar, 96- godt fladbundet plade og 50 pi 1x assaypuffer i de resterende brønde (der tjener som råemner til måling baggrundssignaler).
BEMÆRK: Slutkoncentrationerne af 4-MU i reaktionsvolumenet (50 pi 4-MU + 50 pi 300 pM Muñana) er 2,5 uM, 5 pM, 10 pM, 20 pM, 40 pM, 80 pM, 160 pM og 320 pM . - Forberede en 2,5 mM MUNANA stamopløsning ved at rekonstituere 25 mg Muñana i 20 ml destilleret vand. Bland 0,72 ml 2,5 mM MUNANA med 5,28 ml 1x assaybuffer til opnåelse af en 300 uM Muñana arbejdsopløsning (tilstrækkeligt volumen for én plade). Dække røret indeholdende 300 uM Muñana working opløsning med aluminiumfolie og holde det på is medmindre anvendes straks. Kassér eventuelle tiloversblevne materialer.
BEMÆRK: 2,5 mM MUNANA stamopløsning kan opbevares ved -20 ° C i 1 måned og skal anvendes inden for en fryse / tø-cyklus. De 4-MU og Muñana løsninger er lysfølsomme og skal beskyttes mod langvarig lyseksponering. - Der tilsættes 50 pi 300 pM Muñana til hver brønd, bankes let at blande, og der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Dæk pladen med en pladeforsegler at forhindre fordampning.
BEMÆRK: Dette trin er at redegøre for baggrundsfluorescens i NA inhiberingsassay. - Forberede stopopløsningen ved at blande 11 ml absolut ethanol med 2,225 ml 0,824 M NaOH (tilstrækkeligt volumen for én plade).
- Tilsæt 100 uL stopopløsning til hver brønd for at stoppe reaktionen og forsigtigt trykke for at blande.
- Aflæs pladen ved anvendelse af et fluorometer med en excitationsbølgelængde indstilling på 355 nm og en emissionsbølgelængde indstilling på 460 nm, som per producentens anvisninger.
- Beregn den gennemsnitlige baggrundssignal anvendelse fluorescenssignaler fra alle brøndene indeholdende ingen 4-MU. Fratræk dette gennemsnit baggrund signalet fra hver af brøndene indeholdende 4-MU og beregne de gennemsnitlige signaler (RFU) hvor hver 4-MU-koncentration. Plotte en standardkurve for RFU mod 4-MU-koncentration (uM), som vist i figur 1a; et nærbillede lineær del af kurven er vist i figur 1b.
- Visualisere handlingen i RFU mod 4-MU-koncentration (pM) for at bestemme det lineære område, og den optimale target signal; det lineære område er hvor fluorescenssignalet forøges proportionalt med stigende koncentrationer af 4-MU på grunden, mens den optimale målsignal er en vilkårlig 4-MU-koncentration inden for det lineære område.
BEMÆRK: lineære område og den optimale målsignal er fluorometer-specifikke. F.eks fluorometeret ved Melbourne WHOCCRRI har en lineær række 20,5-40 uM 4-MU og en optimal target signal på ~ 30 pM 4-MU, hvilket svarer til ~ 1.500 RFU.
2. Bestemmelse af NA aktivitet af virus
BEMÆRK: Influenzavira dyrkes til tilstrækkelige titre i Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler eller befrugtede hønseæg 8.
- Dispensere 120 pi per brønd af ufortyndede dyrkede influenzavirus i kolonne 1 og 60 pi 1x assaybuffer indeholdende 0,1% NP-40 i de resterende 11 kolonner i en 96-brønds, U-bundplade.
- Serielt udføre to gange fortynding af viraene over pladen (dvs. overføre 60 pi fra kolonne 1 til kolonne 2 og så videre, op til kolonne 11) under anvendelse af en multikanalpipette, forlader kolonne 12 som en blank indeholdende kun 1 x assaypuffer.
- Overføre 50 pi fra hver af brøndene (fortyndet virus og blanks) i en klar, 96-brønds, fladbundet plade.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at cSvejsning pipettespidser hvis materialer overføres fra kolonne 12 gennem til kolonne 1. - Tilsættes 50 pi 300 pM Muñana (fremstillet ifølge trin 1.4) pr brønd og bankes let på pladen for at blande. Inkubér pladen ved 37 ° C i 1 time. Dæk pladen med en pladeforsegler at forhindre fordampning.
- Tilsæt 100 pi stopopløsning (fremstillet ifølge trin 1.6) per brønd for at afslutte reaktionen og bankes let på pladen for at blande.
- Læs pladen ved hjælp af et fluorometer.
- Anvende en excitationsbølgelængde indstilling på 355 nm og en emissionsbølgelængde indstilling på 460 nm.
- Bestemme den gennemsnitlige baggrundssignal baseret på fluorescens-målinger i kolonne 12 og trække den gennemsnitlige baggrundssignal fra hver brønd. Plotte en graf af RFU mod virusfortyndingerne.
BEMÆRK: baggrundsværdier for 100 pM Muñana på WHOCCRRI Melbourne er typisk mellem 50 og 120 RFU, men disse vil variere afhængigt af fluorometer being anvendes. - Se handlingen i RFU mod virusfortyndingerne at bestemme midtpunktet af den lineære del af kurven for hvert virus (figur 2). Bruge optimale målsignal (bestemt i trin 1) som referencepunkt.
BEMÆRK: Denne skal svare med 4-MU lineære område fluorometer bestemt i punkt 1 og vil give den passende koncentration af virus, der skal anvendes i afsnit 3.
3. Vurdering Virus Modtagelighed for NA Inhibitors Brug af NA-inhiberingsassay
- Forberede masterstamopløsninger af NA inhibitorer ved koncentrationer på 300 uM.
- Forbered 300 uM zanamivir (molekylvægt, MW = 332,32 g / mol) ved at opløse 5,0 mg zanamivir i 50 ml 2x assaybuffer (66,6 mM MES og 8 mM CaCl2, pH 6,5).
- Forbered 300 uM oseltamivircarboxylat (D-tartrat; MV = 386,44 g / mol) ved at opløse 5,8 mg i 50 ml 2x assaypuffer.
- Forberede300 uM peramivir trihydrat (MV = 382,45 g / mol) ved at opløse 5,7 mg i 50 ml 2x assaypuffer.
- Forbered 300 uM laninamivir (MV = 346,34 g / mol) ved at opløse 5,2 mg i 50 ml 2x assaypuffer.
BEMÆRK: NA inhibitor masterstamopløsninger kan opbevares ved -20 ° C i 12 måneder. Kontroller MW NA inhibitorer til at sikre de korrekte vægt og volumener anvendes i rekonstituering. Oseltamivircarboxylat er den aktive forbindelse af prodruget oseltamivirphosphat. Derfor bør kun oseltamivircarboxylat anvendes i NA inhiberingsassay.
- Fra stamkulturer, forberede arbejdet lagre af ti-fold seriefortyndinger af NA-inhibitorer i 50 ml-centrifugerør ved koncentrationer på 0,03 nM, 0,3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3.000 nM, og 30.000 nM i 2 x assay buffer (66,6 mM MES og 8 mM CaCl2, pH 6,5); dette er til anvendelse på tværs af flere assays.
BEMÆRK: De endelige koncentrationer af NA-inhibitorer i omsætningen volume (50 pi virusfortynding + 50 pi NA inhibitor + 50 pi 300 pM Muñana) er 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1.000 nM, og 10.000 nM. Slutkoncentrationen omfatter ikke de 100 pi stopopløsning. Gemme alle NA inhibitorer fortyndinger ved 2-8 ° C. Udløbsdatoen er den samme som for master bestande. - Forberede virusfortyndingerne i 1x assaybuffer indeholdende 0,1% NP-40 overfladeaktivt middel i en 96-dybe brønd blok. Bruge virusfortyndingerne baseret på NA-aktivitet analyseresultaterne afledt fra afsnit 2. Brug en samlet volumen på 2 ml pr virus til at teste fire NA inhibitorer.
BEMÆRK: Forbered to brønde (1 ml per brønd) pr virus i en 96-dybe brønd blok. Eksempler på virusfortyndingerne for VIRUS 1, 2, og 3 er vist i tabel 1. - Dispensere den nødvendige mængde NA inhibitorer (fremstillet ifølge trin 3.2) i en 8 dybe brønd reservoir. Derfra dispensere 50 pi NA inhibitorer ved fortyndinger i intervallet fra 0 nM (2x assay buffer kun) til 30.000 nM i rækkerne A til H i en klar, 96-brønds, fladbundet plade.
BEMÆRK: pladelayout er illustreret i figur 3. - Tilsættes 50 pi fortyndede test vira per brønd til kolonnerne 1-11 og 50 pi per brønd af 1x assaybuffer kun til kolonne 12. forsigtigt på pladen til at blande og inkubere ved stuetemperatur i 45 minutter. Dæk pladen med en pladeforsegler at forhindre fordampning.
- Tilsættes 50 pi 300 pM Muñana (fremstillet ifølge trin 1.4) pr brønd og bankes let på pladen for at blande. Inkubér pladen ved 37 ° C i 1 time. Dæk pladen med en pladeforsegler at forhindre fordampning.
- Tilsæt 100 pi stopopløsning (fremstillet ifølge trin 1.6) til hver brønd og bankes let på pladen for at blande.
- Læs pladen ved hjælp af et fluorometer.
- Anvende en excitationsbølgelængde på 355 nm og en emissionsbølgelængde på 460 nm, som beskrevet tidligere.
4. Beregning afIC50 Værdier
BEMÆRK: JASPR v1.2 er kurvetilpasse software, der gør det muligt at beregne IC50-værdier. Softwaren er udviklet af Influenza Division ved CDC, Atlanta, USA. Anvender softwaren ligningen: V = Vmax x (1 - ([I] / (Kj + [I]))), hvor Vmax er den maksimale hastighed af metabolisme, [I] er inhibitorkoncentrationen, V er responsen inhiberes, og Ki er IC50 for inhiberingen kurve.
- Kopiere og indsætte de rå data afgives af fluorometer i et regneark i en 12-søjle pladeformat (96 brønde), startende med celle A1.
BEMÆRK: Rå data fra hver efterfølgende plade skal være forskudt med en tom række. Hvis hver virus er blevet testet mod fire NA inhibitorer, indsætte de rå data i et sæt af fire (med en tom række mellem hver plade). - Åbn tilpasningssoftware og click på fanen "Experiment". Vælg "Alternative 2-drug Fluor 11 prøver."
- Klik på fanebladet "Indstillinger" og kryds "Generer Grafer."
- Klik på "Options" igen og klik på "Ny nøgle" fanen. Gem "inhibition_key" .csv-fil i samme mappe som de rå data regnearksfil.
- I inhibition_key fil, en liste over alle prøvenavne under id. Hver prøve skal være unikt.
- Hvis fire NA inhibitorer blev testet, indsætte mellemrum yderligere to rækker under Oseltamivir og skriv "peramivir" og "Laninamivir." Gem ændringerne af den inhibition_key fil.
- Retur til "jaspr v 1.2-Hæmning Curve fitting" vinduet, og vælg den rå datafil som "Experiment File" og inhibition_key som "Key File". Kør analysen. Gem resultaterne i .csv og .pdf formater.
BEMÆRK: Softwaren vil automatisk plotte en hæmning kurve (RFU agaiNST NA inhibitorkoncentrationer), som vist i figur 4. Programmet beregner også IC50-værdier for hvert virus over for en borger NA-inhibitor (figur 4). Derudover JASPR viser IC50-værdierne og signal-til-baggrund (S / B) forhold i regneark. Værdierne baggrund kan variere fra laboratorium til laboratorium, afhængigt af fluorometer anvendes. Ved Melbourne WHOCCRRI, baggrunden værdier for 100 pM Muñana området fra 50 til 120 RFU. For en pålidelig IC50-værdi, er et S / B-forhold på ≥10 foretrækkes, skønt et forhold på mindre end 10 stadig er acceptabel, især for mutantvirus, der har meget lav NA-aktivitet. - Undersøg IC50-værdierne og kurven figurer genereret af softwaren. Alle datapunkter skal falde på eller tæt på kurven; hvis de ikke gør det, skal du gentage NA inhiberingsassay.
BEMÆRK: virus, der viser usædvanligt høje IC50-værdier, bør analysen være gentagelseed at bekræfte resultatet.
Representative Results
Ved hjælp af standardiserede retningslinjer for rapportering fra WHO Arbejdsgruppen vedrørende overvågning af influenza Antiviral modtagelighed 9, er følsomheden af influenzavirus til NA-hæmmere rapporteres ved hjælp af vilkår normale hæmning (NI), reduceret hæmning (RI), og stærkt reduceret hæmning (HRI) . NI vira er dem med IC50-værdier mindre end 10 gange sammenlignet med referencen median IC50 for influenza A-vira (eller mindre end 5 gange for influenza B-vira). RI vira er dem med IC50-værdier mellem 10- og 100-fold over referenceniveauet medianen IC50 for influenza A-vira (eller 5- og 50-fold for influenza B). HRI vira er dem med IC50-værdier på 100 gange over referenceværdien medianen IC50 for influenza A-vira (eller over 50 gange for influenza B-vira); se tabel 2.
IC50-værdierne for A (H1N1) pdm09, A (H3N2), og B Yamagata / B Victoria virus beregnes og opdateres årligt på Melbourne WHOCCRRI at afspejle mindre ændringer i IC50-værdier på cirkulerende influenzastammer til NA-inhibitorer (tabel 3). Medianen IC50-værdier i influenza A (H1N1) pdm09 vira er næsten den samme på tværs af de fire NA inhibitorer, men medianen zanamivir og laninamivir IC50-værdier for A (H3N2) virus er 2- til 4-fold højere sammenlignet med oseltamivir og peramivir IC50-værdier (tabel 3). Medianen oseltamivir IC50 værdi for influenza B-vira er generelt 5- til 10 gange højere end den zanamivir, peramivir, og laninamivir IC50-værdier (tabel 3).
NA inhiberingsassay er et fænotypisk assay, som ikke giver oplysninger om den genetiske ændringer forening,ated med RI eller HRI. Derfor er det vigtigt, at der udføres genetisk analyse efter identifikationen af vira med RI eller HRI. Ved Melbourne WHOCCRRI er NA-genet fra varianter analyseret ved anvendelse Sanger sekventering og pyro-sekventering. En repræsentativ liste over aminosyresubstitutioner, der kan findes i NA-genet af vira med RI og HRI varianter er præsenteret i tabel 4. En mere omfattende liste over aminosyresubstitutioner, der kan ændre NAI modtagelighed er også tilgængelig på WHO websted 10.
Figur 1: RFU mod 4-MU-koncentration. (A) Standardkurve af RFU mod 4-MU-koncentration (pM). Den stiplede boks viser det lineære område af 4-MU til fluorometeret. Fluorescenssignalerne over det lineære område kan være mættet, og derfor, eventuelle sregistreres muligvis ikke mall ændringer i fluorescens ved fluorometer. (B) Close-up lineær sektion af standardkurven i figur 1a til identifikation af den "optimale target signal." Fluorometeret ved Melbourne WHOCCRRI har en lineær række 2,5-40 uM 4-MU og en optimal target signal på ~ 30 pM 4-MU, hvilket svarer til ~ 1.500 RFU. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempel på NA-aktivitet kurver af influenzavirus. Den gennemsnitlige baggrund værdi på 50,61 RFU er blevet trukket fra hver fortynding punkt på NA aktivitet kurver. Pilene viser passende virus fortynding til brug i NA inhiberingsassay for hvert virus. For nemmere preparation af virusfortyndingerne, kan man vælge at udføre en 1/100 fortynding for VIRUS 3 i stedet for en 1/96 fortynding. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Plate layout for opsætningen af NA inhiberingsassay. Hver plade indeholder den sidste kolonne, der fungerer som en negativ kontrol, der ikke indeholder virus, men kun 1x assaybuffer (AB), NA-inhibitor, Muñana, og stopopløsning. BEMÆRK: JASPR bruger aflæsninger fra kolonne 12 i hver plade for at bestemme den gennemsnitlige blindt signal anvendes til beregning af IC50-værdierne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksempel på en inhiberingskurve og IC50-værdi på en A (H1N1) pdm09 virus, A / Perth / 82/2015. Den JASPR software viser inhiberingskurven som fluorescens (RFU) mod stigende koncentration (nM) af NA-inhibitor, med hvert punkt pasning inden i kurven. Baseret på inhiberingskurven, IC50-værdien bestemmes som koncentrationen af NA-inhibitor for at reducere 50% af virus NA-aktivitet. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Virus | Virus fortynding kræves | 1x assaybuffer volumen (pi) | Overfladeaktivt-Amps-NP-40 (10%) (ml) | Virus volumen (ml) |
| 1 | 1/20 | 940 | 10 | 50 |
| 2 | 1/40 | 965 | 10 | 25 |
| 3 | 1/100 | 890 | 10 | 10 |
Tabel 1: Fremstilling af virusfortyndingerne for VIRUS 1, 2, og 3 i NA inhiberingsassay.
| Virus type / undertype / afstamning | normal hæmning | reduceret hæmning | Stærkt reduceret inhibering |
| (NI) | (RI) | (HRI) | |
| A (H1N1) pdm09 | <10 gange | 10-100 gange | > 100 gange |
| A (H3N2) | &# 60; 10 gange | 10-100 gange | > 100 gange |
| B Yamagata og B Victoria | <5 gange | 5-50 fold | > 50 gange |
Tabel 2: WHO Antiviral Arbejdsgruppen anbefalede retningslinjer for klassificering af influenzavirus modtagelighed for NA-hæmmere.
| Virus type / undertype / afstamning | N | Zanamivir | Oseltamivir | peramivir | Laninamivir |
| Median (interval) IC50 nM | Median (interval) IC50 nM | Median (interval) IC50 nM | Median (interval) IC50 nM | ||
| A (H1N1) pdm09 | 1326 | 0,42 (0,1-3,43) | <td> 0,36 (0,01-3,48)0,19 (0,07-1,60) | 0,55 (0,05-2,29) | |
| A (H3N2) | 1.654 | 0,9 (0,11-4,0) | 0,38 (0,01-3,65) | 0,33 (0,12-3,06) | 1,38 (0,01-9,38) |
| B Yamagata og B Victoria | 1115 | 2,2 (1,24-10,72) | 15,12 (2.39-70.75) | 1,36 (0,57-6,67) | 2,89 (1,62-9,15) |
Tabel 3: Median IC50 og IC50 af normalområdet inhibering (NI) vira fra 2015 afledt i WHO CCRRI, Melbourne.
| Aminosyresubstitution | Type / undertype / afstamning | IC50 fold-change compared at referere mediane IC50-værdier. | |||
| Zanamivir | Oseltamivir | peramivir | Laninamivir | ||
| H275Y | A (H1N1) pdm09 | 1 | 557 (HRI) | 123 (HRI) | 2 |
| E119V | A (H3N2) | 1 | 63 (RI) | 1 | 1 |
| H134Y | B Victoria | 1 | 4 | 76 (HRI) | 2 |
| N151T | B Victoria | 4 | 4 | 42 (HRI) | 1 |
| G104E | B Victoria | 1,220 (HRI) | 87 (HRI) | 17.724 (HRI) | 701 (HRI) |
| E105K | B Victoria | 3 | 5 (RI) | 59 (HRI) | 2 |
| I222T | B Victoria | 2 | 7 (RI) | 8 (RI) | 3 |
| H273Y | B Yamagata | 1 | 230 (HRI) | 377 (HRI) | 2 |
| D197N | B Yamagata | 4 | 7 (RI) | 32 (RI) | 3 |
Tabel 4: Repræsentativ liste over aminosyresubstitutioner forbundet med reduceret inhibering (RI) eller stærkt reduceret inhibering (HRI) til NA-inhibitorer.
| Problem | Mulig årsag (er) | Opløsning (s) |
| Ingen eller lav NA aktivitet | Intet virus var til stede eller lav virusudbytte. | Kliniske prøve skal dyrkes i cellelinier (dvs. Madin-Darby Canine Kidney-celler) eller i befrugtede hønseægtil en højere virus belastning til anvendelse i NA inhiberingsassay. |
| Nogle mutant vira har ekstremt lav NA aktivitet på trods ved høj virus belastning. | Brug pæn viruskoncentrationen til test. Lavere pH assaybuffer (f.eks pH 5,3) kan anvendes. Dog skal der udvises forsigtighed, når man sammenligner data. | |
| Ingen eller lav NA-aktivitet i NA inhiberingsassay | Ingen virus blev tilføjet. | Re-fortynde virus. Sikre virusset sættes direkte ind i 1x analysebuffer. |
| Forkert virus fortynding blev anvendt. | Gentag NA-aktivitet assay. | |
| Utilstrækkelig inkubationstid. | Sikre inkubationstiden følges. | |
| Datapunkter falder uden for IC50 kurve | Krydskontaminering af NA inhibitor af højere koncentration. | Sørg for, at tip er ikke i kontakt med NA inhibitor ved dispensering fortyndede virus ind i pladen med 96 brønde. |
| Hvis der anvendes en 8 dyb brønd reservoir, kasseres og re-dispensere NA inhibitorkoncentrationer i en frisk 8 dyb brønd reservoir. | ||
| Volumenet af NA-inhibitor eller Muñana eller fortyndet virus blev ikke tilføjet ligeligt i hver brønd. | Gentages analysen med et kalibreret multi-kanal pipette. Sikre lige volumen af hver reagens dispenseres i hver brønd. | |
| Usædvanligt høje IC50-værdier | For høj koncentration af virus blev tilsat. | Gentag NA aktivitetsassay og NA inhiberingsassay. |
| Test prøve indeholdt blandinger af influenza A og influenza B. | Udfør realtids-PCR at identificere tilstedeværelsen af virus-blandinger. | |
| Bakteriel forurening i prøven | Kultur virus i steril tilstand med tilstedeværelsen af antibiotika. | |
| Høj baggrund fluorescens-signalet | Muñana substrat kan nedbrydes med tiden. | Brug et nyt parti af Muñana subtrate. |
| Detektion af fluorescens fra tilstødende brønde. | Bruge sort 96-brønds fladbundede plader |
Tabel 5: Fejlfinding for potentielle problemer i NA inhiberingsassay.
Discussion
Den globale overvågning af influenzavirus modtagelighed for NA inhibitorer øjeblikket gennemføres af en række laboratorier under anvendelse af enten fluorescerende eller kemiluminiscerende NA inhiberingsassays 11, 12. Den fluorescenstest er mere almindeligt anvendt end den kemiluminescerende assay. Selvom begge assays er robuste og reproducerbare, IC50-værdierne opnået fra fluorescens-baseret assay er ofte højere end den chemiluminescens assay, hvilket gør en direkte sammenligning af dataene fra de to assays vanskelige 13. Selv med anvendelse af den samme protokol, kan data fra ét laboratorium variere fra en anden. På grund af disse forskelle mellem laboratorier, WHO arbejdsgruppe om overvågning af influenza Antiviral Følsomhed produceret en retningslinje for at hjælpe med sammenligninger mellem forskellige laboratorier. Snarere end at sammenligne de absolutte IC50-værdier, denne retningslinje brugsa sammenligning baseret på IC 50 ganges forskel midterplan IC50 for NI influenzavira testet i hvert enkelt laboratorium. Evnen til at sammenligne data fra de fem samarbejdende centre har resulteret i den årlige offentliggørelse af den globale influenza antivirale data om modtagelighed 2, 3, 4. Tilgængeligheden af den store mængde af influenza modtagelighed data i det offentlige rum giver forskerne at sammenligne IC50 data fra disse studier med der genererede i deres egne laboratorier.
Andre NA inhiberingsassays, der indfører et lignende koncept er også kommercielt tilgængelige. Disse kommercielle kits, der indeholder klar-til-brug-reagenser (NA inhibitorer ikke inkluderet) er lige reproducerbare. Imidlertid in-house NA inhiberingsassay er væsentligt billigere end de kommercielle kits, fordi størstedelen af de reagenser kan foretaget internt istørre mængder og Muñana substrat, som tidligere udgjorde den største omkostninger i analysen, kan nu købes fra forskellige kilder til konkurrencedygtige priser. Omkostningerne ved at teste en influenza isolat pr narkotika er ca $ 1 (USD). Ved Melbourne WHOCCRRI, er der sket forbedringer til den interne NA inhiberingsassay efter inkorporeringen af en robot platform for de flydende håndtering assayets komponenter. Bortset fra den manuelle fremstilling af virusfortyndingerne er størstedelen af de procedurer udført ved anvendelse af robot væskehåndteringsevne. Dette er ikke blot minimerer manuel håndtering, men det øger også antallet af analyser, der kan køres på en dag.
Selv om NA-inhiberingsassay er meget robust, er der en række kritiske trin, der skal udfyldes med yderligere omhu. Første, uregelmæssighed i NA inhibitorkoncentrationer kan forflytte hæmningskurverne og IC50-værdierne; Derfor bør omhyggelig opmærksomhed værebetalt ved fremstilling af NA inhibitorkoncentrationer. Sekund, præcise pipetteringstrin og præcis inkubationsperioder er afgørende for at opretholde ensartede resultater over hele assays; dette kan opnås ved anvendelse af kalibrerede pipetter og timere. Inddragelsen af kontrol vira i hver analyse muliggør også overvågningen af analysens ydeevne fra analyse til analyse og over lange perioder. Tredje fordi NA enzymaktiviteten af sæsonbetingede influenzavirus er optimal ved pH 6,5, den korrekte pH af assaypufferen er vigtig. Nogle rapporter har fundet, at anvendelsen af lavere pH kan betingelser forbedrer identifikation af influenza-varianter, såsom A (H7N9) variant indeholdende R292K mutationen 14, 15. Ændringen af pH i assaybufferen, vil imidlertid flytte IC50-værdierne, og dette kan komplicere sammenligningen af data inden laboratorier og mellem laboratorier. Andre modifikationer og fejlfinding, der kan være performed er anført i tabel 5.
NA-inhibitorer er den eneste klasse af godkendte antivirale stoffer, der i øjeblikket er effektive mod cirkulerende influenzavira. Indtil andre antivirale klasser bliver tilgængelige til klinisk brug, vil den antivirale følsomhed overvågning af cirkulerende influenzavira være fokuseret på NA-hæmmere alene. På grund af enkelhed og reproducerbarhed af resultaterne, at anvendelsen af NA inhiberingsassayet vurdere influenzavirus modtagelighed for NA-inhibitorer vil fortsætte.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Den Melbourne WHO Collaborating Center for reference og forskning om Influenza er støttet af den australske regering Department of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Influenza A and B viruses | Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs | ||
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | PTA-6500 | |
| 2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Biosynth AG | M-5507 | |
| 2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) | Sigma | M8639 | |
| 4-Methylumbelliferone (4-MU) | Sigma | M1381-25G | |
| 2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid) | Sigma | M8250-250G | |
| Calcium Chloride (Ca Cl2) | APS AJAX Finechem | 127-500G | |
| Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution) | Thermo Fisher Scientific | PIE28324 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | APS AJAX Finechem | 482-2.5KG | |
| Absolute Ethanol | APS AJAX Finechem | 214-2.5L GL | |
| 96-well clear flat-bottom plates | NUNC | 456537 | |
| 96-well U-bottom plates | Greiner Bio-one | 4650101 | |
| 8 channel deep well block | Pacific Laboratory Products | RES-MW8-HP | |
| 96-well deep plates, 2.0 mL square wells | Pacific Laboratory Products | P-2ML-SQ-C | |
| Plate sealers | Thermo Fisher Scientific | 236366 | |
| Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL) | Sigma-Aldrich | CLS430758-12EA | |
| Single-channel pipettes (1 µL - 1,000 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
| Multi-channel pipettes | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | 8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 - 1250 µL volume) | |
| Pipette tips (1 µL - 1,250 µL) | Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius) | ||
| Disposable pipettes (10 mL and 25 mL) | Greiner Bio-one | P7740-200EA and P7865-200EA | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | BD Bioscience | 352070 | |
| Racked tubes | Scientific Specialties, Inc. | 1750-00 | |
| Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm | TermoFisher Scientific | ASCENT FL 374 | |
| Ascent software | TermoFisher Scientific | 5185410CD | |
| Incubator set at 37 °C | Lab Supply | Biocell 1000 | |
| Zanamivir | GlaxoSmithKline | Request directly from the company | |
| Oseltamivir carboxylate | Roche | ||
| Peramivir (BCX-1812) | BioCryst | ||
| Laninamivir (R-125489) | Daiichi-Sankyo | ||
| JASPR v1.2 | Influenza Division at the CDC Atlanta, USA | freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov) |
References
- Moscona, A. Neuraminidase inhibitors for influenza. N.Engl.J.Med. 353 (13), 1363-1373 (2005).
- Hurt, A. C., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 132, 178-185 (2016).
- Meijer, A., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 110, 31-41 (2014).
- Takashita, E., et al. Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 117, 27-38 (2015).
- Lackenby, A., et al. Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A(H1N1) viruses in Europe. Euro Surveill. 13 (5), (2008).
- Hurt, A. C., et al. Community transmission of oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 influenza. N Engl J Med. 365 (26), 2541-2542 (2011).
- Takashita, E., et al. Characterization of a large cluster of influenza A(H1N1)pdm09 viruses cross-resistant to oseltamivir and peramivir during the 2013-2014 influenza season in Japan. Antimicrob Agents Chemother. 59 (5), 2607-2617 (2015).
- Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. Influenza A virus isolation, culture and identification. Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).
- Meetings of the WHO working group on surveillance of influenza antiviral susceptibility - Geneva, November 2011 and June 2012. Wkly Epidemiol Rec. 87 (39), 369-374 (2012).
- A summary of amino acid substitutions in the influenza neuraminidase associated with resistance or reduced susceptibility to NAIs. WHO. , Available from: http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/avwg2014_nai_substitution_table.pdf?ua=1 (2016).
- Okomo-Adhiambo, M., Hurt, A. C., Gubareva, L. V. The chemiluminescent neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 95-113 (2012).
- Hurt, A. C., Okomo-Adhiambo, M., Gubareva, L. V. The fluorescence neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors. Methods Mol Biol. 865, 115-125 (2012).
- Analysis of IC50 data. isirv Antiviral Group (isirv-AVG). , Available from: https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data (2016).
- Sleeman, K., et al. R292K substitution and drug susceptibility of influenza A(H7N9) viruses. Emerg Infect Dis. 19 (9), 1521-1524 (2013).
- Gubareva, L. V., Robinson, M. J., Bethell, R. C., Webster, R. G. Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guanidino-Neu5Ac2en. J Virol. 71 (5), 3385-3390 (1997).
