Summary
Her præsenterer vi en procedure til udførelse af storskala Ca 2+ -billeddannelse med cellulær opløsning på tværs af flere kortikale lag i frit bevægelige mus. Hundredvis af aktive celler kan observeres samtidigt ved hjælp af et miniature, hovedmonteret mikroskop kombineret med en implanteret prisme probe.
Abstract
In vivo kredsløb og cellulært niveau funktionel billeddannelse er et kritisk redskab til at forstå hjernen i aktion. Højopløsningsbilleddannelse af musekortiske neuroner med tofotonmikroskopi har givet enestående indsigt i kortikal struktur, funktion og plasticitet. Disse undersøgelser er imidlertid begrænset til hoved faste dyr, hvilket reducerer den adfærdsmæssige kompleksitet, der er til rådighed til undersøgelse. I dette papir beskriver vi en procedure til udførelse af kronisk fluorescensmikroskopi med cellulær opløsning på tværs af flere kortikale lag i frie opførende mus. Vi brugte et integreret miniaturiseret fluorescensmikroskop parret med en implanteret prisme-probe til samtidig visualisering og registrering af calciumdynamikken hos hundredvis af neuroner på tværs af flere lag af den somatosensoriske cortex, idet musen forlovede en ny objektudforskningsopgave i flere dage. Denne teknik kan tilpasses til andre hjerneområder i forskellige dyrearter til andre adfærdsmæssige paradigms.
Introduction
Cortex er en vigtig spiller i mange komplekse mentale og adfærdsmæssige funktioner, fra opmærksomhed, sensorisk opfattelse og top-down kognitiv kontrol 1 , 2 , 3 til motiverende, belønning og afhængighedsveje 4 , 5 . At forstå de beregningsmæssige processer, der ligger til grund for dens funktion, er et vigtigt mål at opnå en bedre klinisk forståelse af mange mentale og adfærdsmæssige lidelser.
Mange aktuelle teorier om psykiatrisk sygdom drejer sig om ideen om, at kortikale neurale kredsløbsforstyrrelser eller diskoordination kan understøtte kognitive og adfærdsmæssige abnormiteter, der er kendetegnene for tilstande som skizofreni 6 , autisme 7 eller obsessiv-kompulsiv lidelse 8 . Således opnår man niveau for neurale aktivitetsdata fra coRtiske kredsløb inden for den rette sammenhæng med samtidige adfærdsmæssige oplysninger er af stor betydning og kan ideelt set målrettes mod specifikke celletyper til finere neuralkredsløshed.
Miniaturiserede mikroskoper i forbindelse med implanterbare gradientbrydningsindeks (GRIN) mikrolenser muliggør optisk adgang til neuronelle ensembler under frit bevægelige betingelser fra en mangfoldighed af mulige hjernegrupper 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , inklusiv cortex 14 , 15 , 16 . Anvendelse af et mobilt mikroskopisystem kombineret med genetisk kodede calciumindikatorer muliggør konsistent billeddannelse af den samme cellulære population, der omfatter hundreder af neuroner i løbet af dage til uger i mange hjerneområder 9 og kan væreGenetisk målrettet mod specifikke celletyper ved anvendelse af viral vektor eller transgene teknikker.
Da cortex er kendt for at understøtte forskellige funktioner og forbinde til forskellige hjerneområder afhængigt af placeringen af cellerne i den corticale lamina 17 , 18 , 19 , er vi interesserede i at opnå samtidig multilags neural aktivitet i våde, opfører fag. Her viser vi, hvordan man billediserer hundredvis af fluorescensmærkede neuroner i frit opførende mus i løbet af dage ved brug af det miniaturiserede fluorescensmikroskop 20 parret med en implanteret prisme probe, som giver et flertalsbillede af cortexen ( figur 1 ).
Prismåben anvendt her består af to separate GRIN-objektiver: et prisme og et cylindrisk relæobjektiv ( Figur 1 ). Lyset fra mikroskopet spænder fluorescensmærkningenCeller placeret langs billedprofilens billedflade, efter at de er reflekteret ud fra hypotenussen af prismedelen af sonden. Det udsendte lys fra cellerne afspejler også ud fra prismehypotenusen, opsamles gennem mikroskopets mål og når sensoren i mikroskopet. Den prisme sonde, der anvendes i denne procedure, er tilpasset til nem brug med standard stereotaxisk udstyr.
Det miniaturiserede fluorescensmikroskop 20 detekterer actionpotentiale-fremkaldte Ca2 + -transienter i neuronpopulationer med enkeltcelleopløsning, efter at disse celler er blevet specifikt mærket med Ca2 + -følsomme genetisk kodede fluorescerende indikatorer. I denne protokol injicerer vi Ca 2+ -indikator kodet i en viral vektor (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), implanterer en prisme sonde, installerer mikroskopet og dernæst opnår flere dage somatosensoriske (S1-bakben) neurale aktivitetsdata Fra et dyr udsættesD til nye objektoverflader under fri udforskning ( figur 2 ).
Protocol
Procedurer vedrørende dyrearter er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) hos LifeSource Biomedical Services, NASA Ames Research Center, Californien.
1. Preoperativ forberedelse
- Sterilisér de værktøjer, der skal anvendes i kirurgiske procedurer i en sterilisator med hot bead og tørre operationen med 70% ethanol. Tænd varmepuden anbragt over det stereotaxiske trin og opretholde det ved 37 ° C.
- Bedøves dyret under anvendelse af isofluran (5% til induktion og 1-2% ved vedligeholdelse, 0,6-0,8 L / min O2). Kontroller, at der ikke findes en tårefleksrefleks for at vurdere dybden af anæstesi.
- Monter dyret i en stereotaxisk ramme forsynet med øre og tænderstænger.
- Påfør oftalmisk salve på dyrets øjne og dække dem med et stykke mørkt papir for at beskytte dem mod tørring og intense kirurgiske lys.
- Subkutant injicere dyret med ketoprofen (2,5Mg / kg) eller carprofen (2,5 mg / kg)
2. Virusinjektionsoperation
- Trim og barber hovedbunden mellem øjnene og ørerne og desinficer huden med 3 alternative svaber af 70% ethanol og betadin.
- Udsæt kraniet ved at lave et snit i hovedbunden, der starter mellem øjnene og udvide 1,5 cm rostrocaudal med et sterilt kirurgisk blad. Åbn huden for at afsløre kraniet, og fjern periosteumet rundt om det ønskede injektionssted ved hjælp af bomuldspindler og en skalpel. Skyl kraniet med sterilt PBS. Rengør og polsk kraniet med bomuldspindler.
- Niveau kraniet, og markér de stereotaxiske koordinater for virusinjektion med en markør. Ved hjælp af en 0,5 mm burr på en mikrodrill med høj hastighed (indstillet til ca. 7.000-10.000 omdr./min.), Lav et lille hul i kraniet. Påfør let tryk under boring og periodisk rengør knoglestøvet og fugt området med sterilt PBS for at forhindre hjernevæv fra overophedning, indtil hjernens overflade er igen.smertede. Hold hjernen fugtig, hvor hullet er boret.
- Brug en 26 G nål til afhentning af virus ( f.eks. AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) i mikrosprøjten, og udskift den derefter med en 35 G nål til injektion. Vedhæft microsyringen lastet med virus til manipulator armen af det stereotaxiske apparat.
- Bring sprøjten tæt på hul på injektionsstedet og juster nålens vinkel, så den kommer ind i 90 ° vinkel på hjernefladen. Sænk nålen, indtil den berører pia mater og gennembor gennem duraen. Begynd at sænke nålen i trin på 10 μm / s, indtil den når den ønskede dybde (z). Fastgør nålens placering der ved hjælp af den stereotaxiske arm.
- Indstil mikrosprøjtepumpen til at injicere 250 nL virus ved 25 nL / min.
- Kritisk trin: Da virusvolumenet, der skal injiceres, afhænger af titer og fortynding, udføres forsvindingsforsøg på forhånd, for at etablere optimale volumen- og koncentrationskriterier for billeddannelse af cellerI eksperimentet.
- Hvis der ses noget virus ud af injektionsstedet, skal du sætte pause i injektionen og vente til hjernevæv absorberer virusfaldet. Vent i 5-7 minutter efter at det samlede volumen er blevet injiceret, før nålen trækkes tilbage. Farvestoffer såsom hurtiggrøn kan også tilsættes til virusopløsningen for at hjælpe med at styre injektionshastigheden i tilfælde af, at viruset ses udstødt ud af hjernens overflade.
- Ved mærkning af flere lag i cortex skal du bruge flere injektioner, hvis det er nødvendigt. Start først på ventralstedet og vent i 5-7 minutter efter injektionen, og træk nålen til næste mest dorsale punkt til injektion ( f.eks. Injicer ved -1,0 mm AP, 1,5 mm ± ML og 400 og 600 μm DV). Vent 10 minutter efter den endelige injektion, inden du trækker nålen ud og fjerner den fra den stereotaxiske opsætning.
- Bland en lille mængde af et in vivo biokompatibelt transparent elastomerklæbemiddel fra dobbelt cylindersprøjten (F.eks. Kwik-Sil) og dække hullet i kraniet med det. Påfør cyanacrylatklæbemiddel oven på laget af elastomerklæbemiddel og lad det hærde.
- Sutur hovedbunden og lad dyret komme sig fra anæstesi i et varmt genoprettelsesbur, indtil det er ambulant. Administrer ketoprofen (2,5 mg / kg) eller carprofen (2,5 mg / kg) subkutant, inden dyret returneres til sit hjembur. Enkelt hus efter operationen for at beskytte operationsstedet og gentage dosen 24 timer senere.
- Efter fjernelse af mikrosprøjten skylles både 26 G og 35 G nåle 7-10 gange med destilleret vand for at rengøre før opbevaring.
3. Prism Probe Implant Surgery
- 1-2 uger efter virusinjektion, forberede sig til prismodelimplantatkirurgi. Desinficere prisme sonden i 70% ethanol og rengør den med linsepapir. Sæt prisme sonden i linser holder værktøj og stram hex skruen med skruetrækker. Sæt mikroskopet i bundholderen (denMagneter vil holde det på plads).
- Forbered dyret som beskrevet under afsnittet Preoperativ forberedelse.
- Trim og barber dyrets hoved mellem øjnene og ørerne og desinficere huden med alternative vatpinde af 70% ethanol og betadin.
- Udsæt kraniet ved at hæve huden med et par sterile saks og fjern hudflappen og underliggende periosteum. Tør og poler kraniet med bomuldspinde. Sørg for tilstrækkelig fjernelse af det omgivende muskelvæv til at skabe et rent, tørt, bredt knoglefundament som forberedelse til følgende trin.
- Implantskalle skruer i den kontralaterale halvkugle for at gøre implantatet stabilt og sikkert. Disse kan også være nyttige, hvis du vælger at implantere en headbar til vågen hovedfiksering for at klargøre dyret til eksperimentelle billedbehandlinger i afsnit 5.
- Niveau kraniet og med en markør markere AP og ML koordinaterne for linser indsættelse. Ved hjælp af en 0,5 mm burr på en microdrill åbnes en rund kraniotomi, der sikrer thE kraniotomi-diameter er lige større end prismediameteren, dvs. 1,0 mm i dette tilfælde. Bør forsigtigt, mens du pauser intermitterende for at skylle kraniet med sterilt PBS og sug det væk med vatpind. Fjern det knogledøv, der genereres.
- Kritisk trin: Placer craniotomi sådan, at når prismaet indsættes i cortex, står dets flade kant (billedoverflade) mod virusinjektionsstedet og ligger inden for en radius på 150-200 μm.
- Stop boring lige før kraniet er helt fortyndet. Blodkar skal være synlige gennem den tynde knogle. Fjern knoglepluggen forsigtigt med fine 45 ° tang.
- Fjern dura med # 5 tang.
- Kritisk trin: Når hjernevævet er udsat, skal du altid holde vævet fugtigt. Placer en bomuldspindel dyppet i steril saltvand over kraniotomi. Dette vil også opretholde pres på vævet.
- For at lette trykket i hjernevæv duRing indsættelse af prisme sonden, skabe en indsættelse kanal før tiden. Fastgør en retkanten dissektionskniv til elektrodeholderens arm i det stereotaksiske apparat og monter det på det stereotaxiske apparat i en sådan vinkel, at knivbladet er vinkelret på krøllens krumning (10 ° vinkel i dette tilfælde) og i en Plan parallelt med virusinjektionskolonnen.
- Placér kniven forsigtigt over craniotomi langs den forreste mediale kant i dette tilfælde og ~ 200 μm lateral til virussprøjtestedet med skærekantet vendt bagud ( Figur 1 ). Nul ud Z-aksen, når knivspidsen rører ved siden og sænk den gradvis (i intervaller på 10 μm / s) til en dybde, hvormed prisme sonden vil blive indsat. Flyt derefter kniven 1 mm bagved for at skabe en sti til prismeens forkant. Pause og kontrollere for eventuelle blødninger, der kan ske, mens snittet gøres med et pre-sterilt saltvand gennemblødt stykke gelfoam.
- Fastgør objektivholderen (med prisme sonden og mikroskopet) til den stereotaxiske manipulatorarm i samme vinkel som kniven i det foregående trin. Juster prismet således, at prismens flade side er over snit og parallelt med virusinjektionssøjlen. Dette trin kan muligvis kræve en fin korrektion af den stereotaxiske armposition. Juster justeringen ved at holde tæt på kraniet for hurtigere resultater.
- Når prismen er i den rigtige vinkel, sænkes den gradvis i hjernen i 10 μm trin til en sidste z på 1,1 mm for denne probe, startende fra hjernens overflade. Hjernevævet vil udvide sig omkring prismen, og ethvert pres, der er skabt, ligger bag visualizatiPå fly og vil ikke påvirke synsfeltet. Indsæt mikroskopet på en computer med købs software installeret via en USB3 port og visualiser feltfluorescens ved at tænde LED'en.
- Dæk alle udsatte væv omkring prisma i kraniotomi i et meget tyndt beskyttende lag elastomerklæbemiddel ved hjælp af en 25G nål.
- Når elastomerklæbemiddelet er hærdet (normalt i ~ 3-5 minutter), skal du bruge en 25 G nål til at påsætte et visst cyanacrylatklæbemiddel for at fastgøre prismelinsens glas til den tilstødende kranie over laget af elastomerklæbemiddel for at forhindre linsen i at bevæge sig indeni Kromotomi. Inkluder kanterne af prisme sonde manchet for bedre vedhæftning. Får ikke noget klæbemiddel på toppen af den implanterede prisme sonde. Når cyanoacrylatklæbemidlet er hærdet, skru linsholderen forsigtigt af og fjern mikroskopet. Træk derefter langsomt den stereotaxiske manipulatorarm for at lade prisme sonden sikkert implanteres.
- Påfør et lag af dental akryl ellerCyanoacrylatklæbemiddel omkring implantatet for at dække alle udsatte kranietoverflader, op til men ikke røre det omgivende tilbagetrukne muskelvæv. Dækker et stort område med kraniet med denne kraniale hætte vil senere hjælpe med bundplade vedhæftet fil. Huden omkring implantatstedet skal helbredes alene omkring kranietækslet.
- Kritisk trin: Lad ikke klæbemiddel røre ved noget af det omgivende hud- eller muskelvæv, og tag ikke op i huden i kranietækslet. Hvis du gør det, vil det irritere huden, og det kan medføre overdreven ridser og mulig skade på implantatet.
- Valgfrit: Hvis du ønsker at bruge en vågen hovedfast installation til at fastgøre og løsne mikroskopet til et dyrs basisplade i eksperimentelle billedbehandlinger snarere end at bedøvelse eller skrubbe dyret kort, skal du implantere en hovedstang i kranietasken, der er kompatibel med en vågen hoved- Fast opsætning af valg (ikke vist i denne protokol).
- Bland katalysatoren og basen fra et siliciumE klæbemiddel sprøjte og sæt en dråbe elastomeren inde i prisme sonde manchet for at dække sonde linse toppen for at forhindre skade og støv fra afregning.
- Fjern dyret fra den stereotaxiske ramme og tillade tilbagesøgning fra anæstesi i et varmt kammer. Administrer ketoprofen (2,5 mg / kg) eller carprofen (2,5 mg / kg) subkutant, og returner dyret til et rent hjem bur, når det er ambulant. Husk alle emner for at beskytte implantatet og gentag dosisen 24 timer senere.
4. Bordplade Vedhæftning til Miniature Microscope Installation
- Én uge til 10 dage efter implantering af prisme sonden skal du kontrollere virussekspression i vævet gennem den implanterede prisme sonde og vedlægge en baseplate på kraniet, hvis præparatet viser celleaktivitet. Mikroskopet vil docke på bundpladen under levende billeddannelse.
- Følg de trin, der er skitseret i den præoperative procedure til fremstilling af dyret til bundpladefastgørelse.
- Fjern silikone klæbemuffen over overfladen af den implanterede prisme sonde linse top. Undersøg linsens overflader og rengør forsigtigt snavs med linsepapir og 70% ethanol for at sikre, at billedoverfladen er ren.
- Sæt mikroskopet i sin DAQ-boks og tilslut det via USB3-porten til pc'en.
- Åbn overtagelsessoftwaren på computeren og tilslut mikroskopet via USB3-porten. Brug overtagelsessoftwaren til at kontrollere neurale aktiviteter og til måling og dokumentation af synsfeltet for fremtidige optagelser i dette emne.
- Fastgør en basisplade til mikroskopet og fastgør bundpladesætskruen for at holde bundpladen på plads og fastgør mikroskopet i mikroskopgriberen på den stereotaxiske mikromekanipulatorarm ved mikroskopets krop. Fastgør griberen til en Newport stang, som kan monteres på den stereotaxiske mikromanipulatorarm.
- Placer mikroskopet over prisme sonde linse ved hjælp af sTereotaxisk mikromanipuatorarm. Visuelt inspicere orienteringen ved at se prismelinsen fra siden og bagsiden af dyrefasen. De optiske akser af både mikroskop objektivet og prisme sonde linse skal være justeret.
- Tænd mikroskop LED gennem softwaren. Evaluer kvaliteten af mikroskopets justering ved at fokusere på det implanterede prisme sondeobjektions overflade i opkøbsprogrammet. Når det er korrekt justeret, skal kantene på prismodens linseoverflade være skarpe.
- Juster mikroskopets fysiske afstand over den implanterede prisme sonde ved hjælp af den stereotaxiske manipulator arm for at opnå det ønskede brændpunkt i vævet. Den optisk optimerede afstand mellem mikroskop objektivet og implanteret GRIN linse er ~ 500 μm.
- Gem et referencefluorescensbillede, når det ønskede billeddannelsesplan er taget.
Kritisk punkt: Fra dette tidspunkt skal du ikke justere mikroskopets position, da dette ændrer placeringenPå billedplanet i vævet.
BEMÆRK: Påfør klæbemiddel i næste trin for permanent at fastgøre basepladsens placering i forhold til krankhætten. Klæbemidlet kan opleve en smule krympning i løbet af den følgende dag eller to, hvilket kan ændre brændpunktet i vævet. Præcis hensyn til dette ved at måle mængden af krympning for din klæbemiddelblanding og afstand ex vivo , og derefter understøtte den endelige Z-position af mikroskop + basepladen med denne mængde, før den går videre til klæbemiddelpåføringstrinnet. - Brug dental akryl eller cyanoacrylat til permanent at fastgøre bundpladen til akrylhætten, der dækker dyrets kraniet, der overbinder kløften med akryl eller klæbemiddel. Anvendelse af dental akryl / cyanoacrylat gradvist og hærdning i flere trin kan minimere effekten af den tidligere nævnte krympning på den endelige position af mikroskopets billedplan.
- Kritisk trin: Pas på, når du anvender tandlægeAkryl / cyanoacrylat for at forhindre, at materiale kommer i kontakt med mikroskopets objektivlins, sætskruen eller mikroskopkroppen, hvilket forhindrer korrekt brug af instrumenteringen senere.
- Kritisk trin: Tryk ikke på mikroskopet mens du anvender klæbemidlet. Tryk på mikroskopet eller basispladen kan forårsage bevægelse af mikroskopobjektivet i forhold til prisme-sondeobjektivet, hvilket kunne resultere i fejljustering eller en ændring af brændpunktet i vævet, der ville kræve hurtig omjustering.
- Kontroller, at dental akryl / cyanoacrylat har hærdet og hærdet ved at trykke akrylet med et par tang eller sprøjtespids. Indhent et sidste referencefluorescensbillede med overtagelsessoftwaren.
- Frigør mikroskopet fra griberen og træk griberen ud af mikroskopet. Hvis cyanoacrylat eller et andet transparent klæbemiddel blev brugt, dække det med sort neglelak eller et lag af sort dentalcement for at forhindre enMbient lys lækage i hovedet hætten, som kan forurene fremtidige billeder erhvervet under forsøg.
- Fjern nu mikroskopet, hvis det er nødvendigt. For at adskille mikroskopet fra bundpladen, slip bundpladesætskruen ved at dreje sætskruen ca. ½ drej mod uret. Knip mikroskopkroppen, mens du understøtter bundpladen og akrylhætten med den anden hånd, og træk mikroskopet lige op. Udskift det i opbevaringsbeholderen.
- Beskyt den implanterede prisme sonde med en bundplade afdækning. Dette forhindrer støvpartikler i at løsne sig på linsens overflade, hvilket kan være vanskeligt at rengøre, når bundpladen er installeret.
- Fastgør bundpladedækslet på bundpladen og forskyv skruen med ca. ½ omdrejning med uret eller indtil indstillingsskruen er i indgreb med bundpladen. Må ikke overstige.
- Fjern dyret fra anæstesi og monitor i et varmt opvarmningskammer indtil ambulerende. Vende tilbageE dyr til sit hjem bur. Huset huser alle dyr med implanterede bundplader for at beskytte implantatet.
5. Billeddannelse af flere kortiske lag i en frit bevægende mus
- Forbered det adfærdsmæssige apparat ( f.eks. Phenotyper, Noldus) ved at rengøre og desinficere det og tørre ned med 10% blegemiddelopløsning.
- Slut mikroskopet til dets DAQ-boks, og tilslut det til computeren, og start programmet.
- Kontroller, om der er rigeligt lagerplads på opkøvelcomputeren og gør plads til calciumbilledfilmene. Gem direkte fra softwaren til den lokale harddisk i stedet for at skrive til en ekstern harddisk for at imødekomme den høje dataoverførselshastighed mellem mikroskop og computer og forhindre tab af data under optagelser.
- Bedøv dyret med isofluran (5% i oxygen) i et induktionskammer for at fastgøre mikroskopet. Alternativt kan du forsigtigt scruff dyret eller bruge en vågen hovedfast installationMed en headbar, hvis anæstesi er kendt for at forstyrre det valgte adfærdsmæssige paradigme.
- Fjern bundpladedækslet ved at dreje bundpladesætskruen mod uret og løfte bundpladedækslet ud.
- Sæt mikroskopet i bundpladen på dyret. Mikroskopet skal snappe på plads ved hjælp af magneterne på bundpladen. Før bundpladesætskruen, indtil der mærkes en lille modstand.
- Kritisk trin: Stram ikke bundpladesætskruen for at forhindre beskadigelse af mikroskophuset.
- Kontroller billedplanet i vævet ved at erhverve et fluorescens-snapshot i softwaren og juster om nødvendigt brændpunktet i vævet ved at løsne mikroskopets tårnets skrue, dreje mikroskopetårnet for at justere det fine fokus og derefter stramme tårnet igen Boltsætskrue.
- Kritisk trin: Tving aldrig tårnet til at dreje uden først at løsne sætskruen ogStram ikke skruen til tårnets skrue.
- Hvis du gennemfører en longitudinel undersøgelse, skal du vende tilbage til den fysiske tårnposition for at fange det samme synsfelt. I maskinvaren skal du notere antallet af tårnblade eller turretens fysiske position for hvert dyr, der er afbildet med samme mikroskop, for hurtig tilbagevenden til det samme synsfelt.
- Frigør dyret, der bærer mikroskopet, i sit hjem bur eller adfærdskammer for akklimatisering, og afventer slid af anæstesi, hvis det er relevant.
- Kritisk trin: Træn dyrene for at bære vægten af mikroskopet ved hjælp af et dummymikroskop i flere sessioner, indtil det sikres, at iført mikroskopet ikke forstyrrer deres normale adfærd, før der påbegyndes eksperimentelle sessioner. Regelmæssig håndtering og træning til vågen fastholdelse forhindrer dyrene unødig belastning.
- Vælg de overtagelsesindstillinger, der skal bruges til at indsamle data. Dette inkluderer fraJeg vurderer at indsamle data ( fx 20 fps, Gain of 1 og LED power of 50%). Kontroller billedhistogrammet, når du vælger indstillingerne for at sikre god SNR.
BEMÆRK: Den numeriske blænde for fluorescensopsamling er 0,35 for 1 mm prisme sonden sammenlignet med 0,5 for den 1 mm lige probe. - Start den adfærdsmæssige software og programmer den til at udløse mikroskopet ved den ønskede billedoptagelsesoptagelsescyklus ( f.eks. En 4X 5 min ON 2 min OFF). Tilslut TTL-porten på Noldus IO-boksen til TRIG-porten på DAQ-boksen via et RJ45 til BNC-kabel.
- Placer dyret i adfærdsområdet, hvis det ikke allerede er der, og start eksperimentet.
- Efter anskaffelse af ønskede data bedøves dyret igen med isofluran (5% i oxygen) i et induktionskammer, eller forsigtigt opbevar dyret forsigtigt.
- Løsn bundpladesætskruen og tag mikroskopet ud af bundpladen ved forsigtigt at trække mikroskopet op. Udskift bundpladedækslet og stram forsigtigt basispladenTe sæt skruen.
- Returner dyret til hjemmeboret til næste optagelsessession. Brug referencefluorescensbillederne som vejledning til efterfølgende billedbehandlinger for at vende tilbage til det samme synsfelt.
6. Evaluering af storskala Ca 2+ billeddata
- For at udtrække celle placering og Ca 2+ dynamik inden for synsfeltet fra data, kan forskellige dataanalys platforme anvendes. Mosaic, en dataanalyse platform designet specielt til at behandle storskala Ca 2+ billedfilm er blevet brugt til dette studie her.
- Rectify defekte pixel og interpolere eventuelle individuelle faldne rammer i de rå film i forbehandlingstrinnet. Buk billederne i mellemrummet fra det fulde 1.440 x 1.080 pixel synsfelt til 720 x 540 pixel for at reducere dataudtrykket.
- For at korrigere for bevægelsesartefakter i hjernen med hensyn til mikroskopets billedsensor, skal du registrere filmene ved hjælp af en streng ImageJ-baseret billedreaktionGistration algoritme (TurboReg).
- For at identificere individuelle neuroner, gentag billederne som relative ændringer i fluorescens ΔF / F 0 = FF 0 / F 0 hvor F 0 er det gennemsnitlige billede opnået ved at gennemsnitlige hele filmen.
- Identificer de rumlige filtre svarende til individuelle celler ved hjælp af en etableret celle-sorteringsalgoritme. Her anvendte vi hoved- og individuel komponentanalyse 21 for at identificere individuelle neuroner.
BEMÆRK: En begivenhed blev specificeret, når peak amplitude af en begivenhed i et spor var mere end 8 standardafvigelser fra sporets basislinje i vores datasæt, og celleplaceringen og Ca 2+ -dynamikdata blev eksporteret til yderligere analyse.
Representative Results
Den her beskrevne protokol beskriver en effektiv og effektiv måde at udføre langsgående multilag Ca2 + -billeddannelse fra hundredvis af kortikale neuroner i fritt opførende mus ved anvendelse af prismerprober ( figur 1 ). Tidligere tilgange til flerlags kortikal billeddannelse har primært været begrænset til hoved faste dyr 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . For at erhverve dette niveau af data i en frit opfindsom kontekst blev en miniaturiseret mikroskopplatform brugt til adfærds fleksibilitet; En genetisk kodet calciumindikator (GCaMP6f) blev anvendt til at målrette en specifik cellepopulation (CAMKII + -celler i cortexen); Og en prisme sonde blev valgt til at tilvejebringe et kronisk multilags synsfelt.
figur 2 , trin 1), før kronisk implantering af en prisme sonde for at muliggøre optisk adgang til de mærkede celler ( figur 2 , trin 2). En basisplade, der tjener som en sikker midlertidig dock til positionering af mikroskopet under billedbehandlinger, blev derefter installeret over dyrets hoved ( Figur 2 , Trin 3), hvilket muliggør visualisering af kortikal aktivitet på tværs af flere cellelag i en vågen, opfører eksperimentel Opsætning ( figur 2 , trin 4).
For at sikre, at den ønskede cellulære population blev målrettet, vises en post mortem-coronal hjerneafsnit fra en repræsentativ mus i figur 3 med prisme sondeområdet og synsfeltet markeret i forhold til GCaMP6f labEled neuroner i lag 2/3 og 5 af den somatosensoriske cortex.
Under vågen opførsel af billeddannelse med systemet blev aktiviteten af de somatosensoriske kortikale neuroner registreret, da musen blev udsat for tre forskellige miljøer - Åbent felt (Dag 1), Objektsidentifikation (Dag 2-4) og Noveltobjekt (Dag 5) ( Figur 4 ). På dag 1 blev musen anbragt i en adfærdsmæssig arena uden nogen objekter. På dag 2-4 blev musen anbragt i arenaen med de samme to teksturelt forskellige genstande (en gelpude og en træblok). På dag 5 blev en af genstande erstattet af et nyt objekt. Dyret blev afbildet over 5 dage i 20 minutter hver dag.
Efter celleekstraktion ved hjælp af Ca 2+ billeddataanalysesoftwaren blev rumlige filtre svarende til cellepositioner overlejret på den gennemsnitlige fluorescerende intensitetsprojektion af mikroskopoptagelsesdataene( Figur 5) . En hvid streget linje adskiller lag 2/3 og 5 celler. Tilsvarende Ca 2+ spor fra 5 celler fra hvert af lagene viser brændemønsteret for cellerne i to forskellige adfærdsmæssige sammenhænge - Objektbeskæftigelse og Novel Object Exposure. Lag 2/3 celler var mere aktive sammenlignet med lag 5 celler på den dag, hvor musen blev udsat for en ny genstand. Dette fremgår også af raster-plotterne, der viser tærskelværdierne for alle afbildede celler på dag 1, 4 og 5.
Figur 1: In vivo Ca 2+ Imaging over flere kortiske lag i frit bevægende mus. ( A ) Prism sonde specifikationer og afbildning af billedplan. Den reflekterende belægning på indersiden af hypotenussen muliggør afbildning af 90 ° fra prismatsens indsætningsplan. Linsen cuFf integreres med objektivholderen, som strømlinierer implantationsproceduren og muliggør potentiel visning af omgivende vævsfluorescens under implantation ( B ) (i). Illustration af placering af prisme-probe craniotomi og knivindsnit i forhold til virussprøjtningsstedet, og (ii) illustration af placeringen af prisme sonde flad side i forhold til knivindsnit og virusinjektionssted. ( C ) Illustration af in-vivo Ca 2+ billeddannelsesopsætning, der viser lysbanen for et lille område inden for det fulde synsfelt gennem prisme sonde implanteret i musekortex. ( D ) Eksempelvis synsfelt under prismatsinstallation. Miniaturemikroskop er fastgjort til objektivholderen, som holder prisme sonden muligt for at kontrollere virusekspression under prisme sonde installation. ( E ) Integration af mikroskop med prisme sonde til multilag kortortisk billeddannelse af GCaMP6f mærket S1 celler. F Eksempel synsfeltUnder bundpladeinstallation. Klar blodkar mønster er synligt på tidspunktet for bundpladen installere med nogle celler i rå billede. Flere celler er tydeligt synlige, når DF / F er tændt i vinduet til køb af software. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk Viser tidslinjen for Workflow Events for Prism Probe Implantation og Microscope Installation. Antal uger er repræsenteret på X-aksen og arbejdsgangstrinnene i procedurerne langs Y-aksen. ( A ) Grafisk illustrerende viral injektion (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) langs den samme dorso-ventrale akse for at mærke flere lag af musens somatosensoriske cortex. ( B ) 2 uger efter virusinjektioner, en prisme probE er implanteret ved en akse, der er parallel med virusinjektionsstederne. ( C ) Ca. en uge efter prismonsimplantationen kontrolleres dyret for ekspression med mikroskopet og en basisplade er monteret på hovedet, hvis en population af celler er synlig. ( D ) Dyret er så klar til kronisk billeddannelse under relevante adfærdsmæssige opgaver (museklip modificeret efter tilladelse fra- UW-Madison Biochemistry MediaLab). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Postmortem Histologisk Validering af Prism Probe Location og GCaMP Expression. ( A ) Koronale sektion fra en repræsentativ mushjerne, der viser prismodelkanalen og med dens billeddannelsesside vendtGCaMP6f-udtrykkende celler (AAV1.CaMKII.GCaMP6f udtrykt i neuroner i lag 2/3 og 5). ( B ) Samme koronale hjernesektion efter farvning for DAPI. Scale bar = 250 μm ( C ) Zoomet i lyset af GCaMP6f udtrykker celler i somatosensorisk cortex. Målestang = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Musaktivitet under Habituation, Familiarization og Novel Object Exposure Testing blev videosporet ved hjælp af videosoftware. ( A ) På dag 1 blev dyret anbragt i en adfærdsmæssig arena uden nogen objekter (Open Field). ( B ) På dag 2-4 blev de samme to teksturelt forskellige genstande (gelpude og træblok) placeret i arenaen (Object Familiarization). ( C ) På dag 5 blev en af genstande erstattet af en ny genstand (træblok med sandpapir) (Novel Object Exposure). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kalsiumdynamik fra overfladiske og dybe lag af somatosensorisk cortex fra en repræsentativ mus, der er billedet med mikroskopet. ( A ) Flettet billede af neuronale rumlige filtre (grønne blobs) og gennemsnitlig fluorescensintensitetsprojektion af mikroskopoptagelse gennem prisme sonde synsfelt. Border mellem supragranulære og infragranulære lag indikeret med en hvid streget linje. Målestang = 100 μm. ( B ) Kalkspor fra fem eksempel overfladiske og dybe lagceller (fyldt blå og rødt cElls i panel A), der angiver enheder af standardafvigelse af fluorescens efter principiel og uafhængig komponentanalyse. Horisontal skala bar 50 s og lodret skala bar 10 SD ( C ) Raster plot af celler fra overfladiske (lag 2/3) og dybe lag (lag 5) vist over Åbent felt, Objekttegnelse og Novel objektudforskning. Skalestang = 100 s. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Forståelse af neuralt kredsløbsaktivitet under vågen adfærd er et vigtigt niveau af neurovidenskabelig undersøgelse, der er nødvendig for effektivt at dissekere hjernens funktion i sundhed og sygdom. Cortex er en særlig vigtig region at studere i forbindelse med vågen opførsel, da den spiller en vigtig rolle i mange vitale sensoriske, kognitive og udøvende funktioner 28 , 29 .
Den kortikale søjle antages at være den grundlæggende funktionelle enhed i cortexen, og populationsniveauaktiviteten af corticalceller er kendt for at variere baseret på deres fysiske placering i søjlen. Eksempelvis ekspiratoriske neuroner i lag 2/3 i den somatosensoriske cortex projekterer primært til andre neokortiske regioner og modulerer andre kortikale netværk 30 , mens celler i dybere lag primært rammer subkortale områder som thalamus 31 . Optagelse af aktiviteten af hundredeS af forudbestemte corticalceller samtidig og pålideligt over tid på tværs af forskellige laminer i fritt optrængende emner vil i høj grad fremme vores forståelse af cortical informationsstrøm, hvilket muliggør en finere funktionel dissektion af cortikale søjler informeret af realtids adfærdsmæssige oplysninger og opgaverelevant tids- skalaer.
Indsamling af dette niveau af neurale kredsløbsdata er muliggjort ved brug af en effektiv og strømlinet miniaturiseret mikroskopiplatform til at gennemføre storskaleret Ca 2+ -billeddannelse i frit opførende emner (eller hovedfokuserede emner som ønsket). Anvendes med genetisk kodede calciumindikatorer til at muliggøre specifik målretning af celletype og billeddannelse af et flerlags synsfelt tilvejebragt af en kronologisk implanteret prisme-probe, undersøgte denne protokol én sag blandt mange mulige anvendelser: observering af laminære forskelle i somatosensorisk kortikal behandling, når mus Fysisk engageret med en ny genstand ( figur 5 ).Dette er den første proceduremæssige illustration af denne type celle-type specifik, in vivo tilgang til at studere flere kortikale lag i våde, fritt opfølgende dyr og udvider spektret af forsøgsmetoder til rådighed for at forstå laminære strukturer i den aktive hjerne.
Det periskopiske synsfelt aktiveret af prisme sonden i denne teknik kan med fordel anvendes på andre hjernestrukturer, når bevaring af vævet direkte dorsalt til en region af interesse er ønsket; For eksempel kan CA3 billeddannelse opnås uden forstyrrelse af hippocampal funktion.
Prismatsbaseret tilgang til billeddannelse Ca 2+ aktivitet kræver fysisk indsættelse og permanent implantation af en mikroprism i cortexen, hvilket svarer til dannelsen af en kortikal læsion, hvor linsensonden er indsat. Dette kan resultere i forstyrrelser af det lokale neurale kredsløb, herunder afbrydelse af apikale dendritter og processer. THans procedure vil også forårsage en initial aktivering af glialceller i regionen, selv om dette forventes at være lokaliseret til vævet omkring 150 μm fra prismatfladen og at aftage efter at hjernen har helet 22 . Det er meget vigtigt at overveje, om denne teknik vil påvirke dyrets normale kredsløbsanatomi og / eller opførsel ved planlægning af forsøg. Adfærdskontrolgrupper bør altid udføres for at sikre, at der ikke er nogen signifikante ændringer i baseline-adfærd, der kan forårsage forvirrende eksperimentelle resultater.
Ved hjælp af denne miniaturiserede mobile Ca 2+ -billedteknik med neurofarmakologisk manipulation kan forskellige kognitive, sociale, motoriske eller indre adfærdsmæssige paradigmer kombineres med andre fysiologiske målinger uddybe og berige studier, der fokuserer på at forstå neurale kredsløbs funktionelle roller i adfærd og signal Behandling 32 . Suppression eller aktivAtion af bestemte veje moduleret af lægemidler kan påvirke tilknyttede adfærd, som let kan undersøges ved hjælp af denne teknologi 33 . Forgrening i forskellige celletyper ved at ændre målretningen for calciumindikatoren er en anden kraftfuld og nyttig applikation og muliggør mange kreative kombinationer af eksperimentelle værktøjer til at behandle forskellige neurale kredsløbsspørgsmål.
Disclosures
Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konkurrerende interesser: SG, SO og VC betales medarbejdere hos Inscopix.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger og K. Svoboda fra Genie-projektet (Genie-Encoded Neuronal Indicator and Effector) på Janelia Research Campus i Howard Hughes Medical Institute for deres generøse donation af AAV1-GCaMP6f Til University of Pennsylvania Vector Core. De vil også gerne takke A. Olson og Neuroscience Microscopy Core ved Stanford University støttet af NIH NS069375 tilskud til deres konfokale mikroskopi tjenester.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurostar Motorized Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument |
Kopf | Model 963SD | Surgery |
| Stereoscope | Labomed | Prima DNT | Surgery and Imaging |
| Mini Rectal Thermistor Probe (.062"/1.6 mm diameter) - 1/4" Jack | FHC | 40-90-5D-02 | Surgery |
| Heating Pad 5 X 12.5 cm | FHC | 40-90-2-07 | Surgery |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | Surgery |
| Microsyringe Pump | World Precision Instruments | UMP3 model; serial 155788 F110 | Surgery |
| NanoFil 10 μL Syringe | World Precision Instruments | NANOFIL | Surgery |
| 35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK | World Precision Instruments | NF35BV-2 | Surgery |
| Omnidrill35, 115 - 230 V | World Precision Instruments | 503598 | Surgery |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| nVista | Inscopix | 100-001048 | Imaging |
| AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-1-PV3435 | Surgery |
| Ketoprofen | Victor Medical | 5487 | Surgery |
| Carprofen | Victor Medical | 1699008 | Surgery |
| Isoflurane | Victor Medical | 1001054 | Surgery |
| Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm) | Pfizer (Fisher Scientific) | NC9841478 | Surgery |
| Dumont #5/45 forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Surgery |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Surgery |
| Dissecting knives | Fine Science Tools | 10055-12 | Surgery |
| ProView Implant Kit | Inscopix | 100-000756 | Surgery and Imaging |
| ProView Prism Probe 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm Length | Inscopix | 100-000592 | Surgery and Imaging |
| Kwik-Sil adhesive pack of 2 | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Surgery |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Surgery and Imaging |
| Miniature Optical Mounting Post | Newport | M-TSP-3 | Imaging |
| Microscope Baseplate | Inscopix | BPL-2 | Imaging |
| Microscope Baseplate Cover | Inscopix | BPC-2 | Imaging |
References
- McConnell, S. K. Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex. Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).
- Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception. Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).
- Miller, E. K., Cohen, J. D. An integrative theory of prefrontal cortex function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).
- Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior. Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).
- Dehaene, S., Changeux, J. P. Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making. Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).
- Ferenczi, E. A., et al. Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior. Science. 351 (6268), aac9698 (2016).
- Anomal, R. F., et al. Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism. Front. Sys. Neurosci. 9, 158 (2015).
- Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective. Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Sun, C., et al. Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).
- Kitamura, T., et al. Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory. Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).
- Pinto, L., Dan, Y. Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior. Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).
- Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons. Nat. Comm. 7, 10763 (2016).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Hooks, B. M., et al. Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex. The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).
- Masamizu, Y., et al. Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task. Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).
- Rowland, D. C., Moser, M. -B. From cortical modules to memories. Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Chia, T. H., Levene, M. J. In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism. J. Vis. Exp. (30), (2009).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), pdb.prot5476 (2010).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Hawrylycz, M., et al. Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience. Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).
- Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse. J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).
- Aronoff, R., et al. Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex. Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).
- Rogan, S. C., Roth, B. L.
- Berdyyeva, T., et al. Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope. PloS One. 9 (11), e112068 (2014).
